专利名称：交联型猪脱细胞真皮片的制作方法
技术领域：
本发明涉及烧伤和整形所用人体皮肤真皮替代物。
临床大面积烧伤患者切痂创面常采用自体刃厚皮网状皮、邮票状皮、自体-异体皮镶嵌和微粒皮移植术。由于缺乏真皮成份，术后易发生瘢痕增生和挛缩畸形，增加后期整形的难度。复合皮(Composite Skin，CS)的诞生为解决上述问题带来了希望。其中真皮支架可分为天然皮肤真皮和人工合成真皮替代物两种，人工合成的真皮替代物的先进性无可置疑，但制备复杂、价格昂贵、抗感染力差，且通透性、抗感染力和结构成分等均不及天然皮肤真皮。由于人的异体皮受到人权、司法、宗教信仰和传染性疾病等限制，因而要提高现阶段大面积烧伤切/削痂和切疤创面的植皮的质量，防止供皮区瘢痕增生，宜加强(培养的)自体表皮与异种猪真皮重组复合皮的研制和应用。
异种猪皮在组织配型(HLA I型/II型)上与人体相差悬殊，且真皮内残留的附件上皮细胞、微血管内皮细胞(mVEC)、淋巴细胞(LC)等细胞成分具有很强的抗原性，是人体产生免疫排斥反应的主要原因，研究证实，经戊二醛等交联处理的附带基底膜成分的异体真皮与自体表皮片或刃厚皮复合移植后，真皮-表皮连接再生迅速，表皮贴附、生长和成熟均较快，组织炎生反应轻，异体真皮支架不易被降解，复合皮表面平整，近似正常皮肤。
因此，本发明研制的猪脱细胞真皮片(pig cen-removed derma1 sheets，P-CRDS)是具有抗原性低，含有基底膜成分，利于(培养)自体表皮细胞生长的理想的异种无细胞真皮片或真皮基质。经交联后临床应用于烧伤切/削痂创面和整形患者的切疤的创面上，既可作复合皮的真皮支架用，也可作生物敷料应用。p-CRDS有望取代人脱细胞真皮片(h-CRDS)，有广泛的应用前景。
本发明的优点1.猪真皮来源充分、价廉，制作较人真皮容易，无人权或司法方面的争议，商品化容易；2.经胰蛋白酶等特定处理的脱细胞真皮片便于保存和运输，有较完整的基底膜和细胞外基质的形态结构。
3.用消毒液或Co60照射可以杀乙肝等传染性病毒和各类致病菌，消除生物制品临床应用的后顾之忧；4.交联型猪脱细胞真皮片抗原性低，复合移植后炎症反应轻，不易被降解，皮片表面平整，无瘢痕增生，发挥真皮支架作用。
本发明的技术方案选择健康白猪活杀后洗刷去毛，剥取全厚皮块，去脂肪后反取约0.1-0.4mm厚的皮片，在0.25％胰蛋白酶复合消化液内4℃、16～24小时，揭去表皮，真皮网状打孔后于0.1～0.2％戊二醛水溶液内或3～5％甲醛(福尔马林)-乙醇混合液内交联5～20分钟，反复浸泡和冲洗，装袋封口Co60照射或入75％酒精内保存备用。组织学证实p-CRDS是含基底膜成分胶原网络的无细胞真皮片或无细胞真皮基质。
具体实施例方式(1)实验室24孔板内，p-CRDS经DMEM浸泡24小时后，在p-CRDS表皮面接种正常人成纤维细胞和人表皮角朊细胞，细胞均贴壁生长，与培养板直接接种的上述细胞对比，经MTT检测结果证实，角朊细胞贴壁、生长快，而成纤维细胞生长较慢(P＜0.05)。证明p-CRDS对细胞低毒或无毒副作用，且能促进人表皮角朊细胞的贴壁生长和抑制成纤维细胞的增生。
(2)猪移植实验选健康小白猪(50公斤)为p-CRDS供体，一次性反取厚度约0.2mm，处理方法同上，采用进口0.2％戊二醛交联的条件见实验分组。
实验分组CS中p-CRDS设未经戊二醛交联即零处理(0-CS)组、5分钟交联(5-CS)组、10分钟交联(10-CS)组、20分钟交联(20-CS)组和40分钟交联(40-CS)组，以OT移植为对照组，每组移植6例。
移植方法选择10公斤左右的健康小白猪3头，于脊柱两侧制成4.0cm×8.0cm全层皮肤创面上下各3块，间隔2cm。取皮鼓反取0.1mm左右的自体刃厚皮，在止血清洁的创面上，先移植p-CRDS，其上重叠移植自体刃厚皮(OT)。对照组在创面上单纯移植OT，各组皮片移植部位均等，皮片移植后分别打包包扎，弹力网套固定。
观察和皮片成活判断标准以术后2周时的观察记录为准，表皮和真皮成活95％以上者视为全部成活，40％以下者为未成活，二者之间为部分成活。数据作Ridit分析。术后2周首次打开创面，除2例40-CS和1例20-CS成活较差(部分成活)外，余各组皮片均完全成活。至术后5周时，CS表面光滑，创面轻度收缩，各组皮片面积检测结果未见明显差异(t，P＞0.05)。组织学(HE)和免疫组化(vwF和VIII因子相关抗原)观察。CS移植后其自体刃厚皮OT早期血供来自于p-CRDS的网孔。在网孔内可见丰富的微小血管和结缔组织，是创基向OT提供营养的“桥”或“蒂”。部分CS移植后出现脱痂和OT层皮肤附件上皮细胞二次上皮化现象，与临床中厚、全厚皮移植或皮瓣转移后，因血运欠佳产生痂下(表皮坏死的干痂)愈合十分相似。此现象在40-CS组多见。0-CS组p-CRDS与自身组织融合迅速，5周时已难以分瓣，其中成纤维细胞(Fb)、mVEC和LC密集，与OT组相近，其它各组在p-CRDS的基底膜与OT交界面上水肿明显，p-CRDS四周的自体组织中微小血管丰富，尤以网孔“蒂”部和皮下组织层明显。p-CRDS内自体Fb、mVEC和LC数量随戊二醛交联时间延长而逐渐减少(t，P＜0.05)。因此该指标可反映戊二醛交联作用对p-CRDS占位性的影响。
(3)临床应用20例大面积烧伤患者，于第1、2次手术时，以四肢非功能部位为复合皮移植部位，受体年龄1-63(25.3±18.2)岁，烧伤面积10-91(45.3±27.8)％，于伤后5-60天之内作复合皮移植。
设p-CRDS+自体刃厚皮复合皮(p-CS)实验组，并以h-CRDS+自体刃厚皮复合皮(h-CS)、单纯自体薄中厚皮(TS)和OT组为对照。
选择切痂残剥痂和整形切疤创面，经充分止血和清洗，以徒手取皮刀取患者0.1mm以内的刃厚皮片(以头皮来源为主)，制成筛状。CS植移方法同上。每块移植面积在12.0-80.0(30.5±17.1)cm2之间，一次移植1～3块，共27块，其中p-CS19块，h-CS18块，TS和OT移植条件一致，三者眦邻。移植术后5天，CS与OT和TS一样，已初步建立血运，表皮红润，4周的网孔已上皮化。至术后6个月，p-CS和h-CS地样未见明显排异反应，皮片表面平滑，接近正常皮肤色泽，无不适感，而TS和OT表面痒痛感明显，外观潮红，且OT表面高低不平，出现瘢痕增生。CS与TS和OT移植皮片成活率(判断标准同上)见下表。早期组织学观察与猪复合皮移植实验较为一致，对少数未经戊二醛交联的p-CRDS重组复合皮，经半年以上的观察不能防止局部瘢痕增生和挛缩，p-CRDS虽然早期建立血运较快，但其淋巴细胞浸润明显，组织降解迅速。复合皮组中，成活较差的病例与p/h-CRDS厚，戊二醛交联的浓度高、时间长(＞40分钟)和复合皮移植时机较晚(＞1个月)、肉芽创面感染严重有关。
附表p-CS与h-CS和OT、TS移植后成活率比较组别块数完全成活(％) 部分成活(％) 未成活(％)p-CS12 9(75.0) 1(8.3) 2(16.7)h-CS20 13(65.0) 3(15.0) 4(20.0)TS 32 28(87.5) 4(12.5) 0(0)OT 32 30(93.75)2(6.25) 0(0)动物实验和临床应用结果说明①p-CRDS可以作为(培养)自体表皮片或OT移植的载体，复合皮手术一次完成，有良好的研究和应用价值；②p-CRDS有一定的占位性，但通过控制戊二醛等交联浓度和时间可完全避免；③和h-CRDS一样，p-CRDS对移植床要求较OT组和TS组高，不适合晚期肉芽创面或感染严重的创面；④p-CRDS有和h-CRDS一样的厚度要求(0.1～0.3mm之间)，太薄则制作困难，远期效果难以保证，太厚则易导致移植失败。
权利要求
1.交联型猪脱细胞真皮片，其特征是选择健康白猪活杀后洗刷去毛，剥取全厚皮块，去脂肪后反取约0.1-0.4mm厚的皮片，在0.25％胰蛋白酶等复合消化液内4℃、16～24小时，揭去表皮，真皮网状打孔后于0.1～0.2％戊二醛水溶液或3～5％甲醛-乙醇混合液内交联5～20分钟，反复浸泡和冲洗，装袋封口Co60照射或入75％酒精内保存备用。
2.根据权利要求1所述的交联型猪脱细胞真皮片，其特征是所述的猪脱细胞真皮片临床应用于烧伤切/削痂创面和整形患者的切疤的创面上，既可作复合皮的真皮支架用，也可作生物敷料应用。
全文摘要
交联型猪脱细胞真皮片,涉及烧伤和整形所用人体皮肤真皮替代物。经胰蛋白酶和戊二醛等处理过的猪脱细胞真皮片是含有基底膜成分和胶原网络支架作用的无细胞真皮片,具有抗原性低,利于(培养)表皮生长,与自体刃厚表皮重组移植后无明显排异反应,外观平坦,无瘢痕增生和挛缩,且来源充足,制作简便,价廉,无司法和人权争议等优点。是临床烧伤(特别是大面积烧伤)和整形切疤患者复合移植应用的理想真皮替代物和生物制品。
文档编号A61L27/00GK1266716SQ99115729
公开日2000年9月20日 申请日期1999年3月12日 优先权日1999年3月12日
发明者姜笃银, 陈壁, 徐明达 申请人:中国人民解放军第四军医大学第一附属医院