脱细胞真皮基质及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗材料领域，特别是涉及一种脱细胞真皮基质及其制备方法。
【背景技术】
[0002]自体皮和异体皮的来源极为有限，异种(如:猪、牛等)脱细胞真皮就成为了当今软组织修复技术研究的一大主题。而真皮组织在修复过程中很容易出现一系列的免疫排斥反应，主要来自于细胞和脂肪。脱细胞真皮基质的制备方法有很多种，目的是能够去除真皮内所有的细胞成分而最大限度保留真皮内胶原结构等的完整性。
[0003]现有的专利公开了各种脱细胞真皮基质的制备方法，例如公开号为CN104288837A的专利申请公开了一种单纯利用碱液对超薄乳头层皮肤进行脱细胞的方法，但该真皮基质脱细胞方法的适用范围及应用都非常有限；公开号为CN1775189的专利申请采用哺乳动物皮肤用氢氧化钠溶液反复处理，去除组织中细胞遗传物质DNA，再用去污剂去除细胞膜中的脂类物质，但是不能有效去除细胞碎肩成分；公开号为CN201350162Y的专利公开了一种脱细胞异体真皮基质组织补片，但对其制备方法未做详述。
[0004]因此针对现有技术的不足，提供一种既能够降低真皮基质的免疫原性，又保留了真皮基质的正常胶原结构的脱细胞真皮基质及其制备方法。
【发明内容】
[0005]基于此，有必要提供一种大小、形状容易控制的脱细胞真皮基质及其制备方法。
[0006]—种脱细胞真皮基质的制备方法，包括如下步骤:
[0007]对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片；
[0008]对所述真皮层皮片分别进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，得到脱细胞真皮基质前体，其中，所述脱脂处理、所述病毒灭活处理和所述去除免疫原性处理的操作顺序可以相互更换，所述脱脂处理的操作为:将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5%?3%的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂，所述去除免疫原性处理的操作为:将所述真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中；以及
[0009]对所述脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型，得到脱细胞真皮基质。
[0010]在一个实施例中，所述对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为:用机械法对所述哺乳动物的皮肤进行初步脱脂及除毛，接着用取皮机将所述哺乳动物的皮肤去掉0.15mm?0.4mm表皮与皮下组织后制成厚度为0.3mm?1.0mm的真皮层皮片。
[0011]在一个实施例中，所述哺乳动物的皮肤包括依次层叠的皮毛、表皮层、真皮层和皮下组织。
[0012]在一个实施例中，所述哺乳动物的皮肤为猪、牛、羊或马的皮肤。
[0013]在一个实施例中，所述将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5%?3%的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂的操作中，所述真皮层皮片与所述碱溶液的体积比为I:1?4，所述碱溶液的溶质选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种，所述真皮层皮片浸泡在所述碱溶液中的时间为6h?24h ；
[0014]所述将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5%?3%的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂的操作中，所述真皮层皮片与所述有机溶剂的体积比为1:1?4，所述有机溶剂选自丙酮、乙醇、正己烷和异丙醇中的一种或两种，所述真皮层皮片浸泡在所述有机溶剂中的操作重复I次?8次，所述真皮层皮片每次浸泡在所述有机溶剂中的时间为15min ?60mino
[0015]在一个实施例中，所述病毒灭活处理的操作为:按照体积比为1:1?4，将所述真皮层皮片浸泡在病毒灭活溶液处0.5h?Sh进行病毒灭活处理，所述病毒灭活溶液为过氧化物和乙醇的混合溶液或过氧化物溶液，所述过氧化物和乙醇的混合溶液中的过氧化物的质量百分含量为0.1%?10%，所述过氧化物和乙醇的混合溶液中的乙醇的质量百分含量为 20%?70%。
[0016]在一个实施例中，所述病毒灭活处理的操作为:对所述真皮层皮片在50°C?120°C下进行干热灭活处理3h?48h。
[0017]在一个实施例中，所述将所述真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中操作中，所述蛋白酶溶液的溶质为胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶，所述蛋白酶溶液的溶质的质量百分含量为0.05%?0.5%，所述表面活性剂溶液的溶质选自烷基葡萄糖苷、十二烷基硫酸钠、TritonX-100、脱氧胆酸钠、3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸、硫代甜菜-10和硫代甜菜-16中的一种，所述表面活性剂溶液的溶质的质量百分含量为0.01%?5%，所述交替浸泡的次数为2次?6次，所述交替浸泡的操作中每次操作的时间为6h?24h0
[0018]在一个实施例中，所述对所述脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型的操作为:将所述脱细胞真皮基质前体脱水后放入冷冻干燥机冻干，接着置于5MPa?30MPa的压力下保压Ih?30h进行定型处理。
[0019]—种脱细胞真皮基质，所述脱细胞真皮基质采用如上述的脱细胞真皮基质的制备方法制备得到。
[0020]这种脱细胞真皮基质的制备方法通过对真皮层皮片进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，将真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中可以最大限度的降低真皮基质的免疫原性，又保留了真皮基质的正常胶原结构，制得的脱细胞真皮基质具有适当的降解速率、良好的生物相容性与骨诱导能力。
【附图说明】
[0021]图1为一实施方式的脱细胞真皮基质的制备方法的流程图；
[0022]图2是实施例1制得的制备脱细胞真皮基质的光滑面的扫描电子显微镜照片；
[0023]图3是实施例1制得的制备脱细胞真皮基质的粗糙面的扫描电子显微镜照片；
[0024]图4是实施例1制得的制备脱细胞真皮基质的截面的扫描电子显微镜照片；
[0025]图5是实施例1制得的制备脱细胞真皮基质经过苏木精-伊红染色后的倒置显微镜照片。
【具体实施方式】
[0026]下面主要结合附图及具体实施例对脱细胞真皮基质及其制备方法作进一步详细的说明。
[0027]如图1所示的脱细胞真皮基质的制备方法，包括如下步骤:
[0028]S10、对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片。
[0029]对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为:用机械法对哺乳动物的皮肤进行初步脱脂及除毛，接着用取皮机将哺乳动物的皮肤去掉0.15mm?0.4mm表皮与皮下组织后制成厚度为0.3mm?1.0mm的真皮层皮片。
[0030]哺乳动物的皮肤包括依次层叠的皮毛、表皮层、真皮层和皮下组织。
[0031 ] 具体的，哺乳动物的皮肤为猪、牛、羊或马的皮肤。
[0032]得到的真皮层皮片可以低温储存备用。具体的，得到的真皮层皮片可以储存在-20°C下备用。
[0033]S20、对SlO得到的真皮层皮片分别进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，得到脱细胞真皮基质前体。
[0034]需要说明的是，脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理的操作顺序可以相互更换。
[0035]S20中，脱脂处理的操作具体为:将真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5%?3%的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂。
[0036]将真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5%?3%的碱溶液中的操作中，真皮层皮片与碱溶液的体积比为1:1?4，碱溶液的溶质选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种，真皮层皮片浸泡在碱溶液中的时间为6h?24h。
[0037]优选的，真皮层皮片与碱溶液的体积比为1:3，碱溶液的溶质为氢氧化钠，碱溶液的溶质的质量百分含量为2%，真皮层皮片浸泡在碱溶液中的时间为8h。
[0038]将真皮层皮片依次浸泡在有机溶剂中的操作中，真皮层皮片与有机溶剂的体积比为1:1?4，有机溶剂选自丙酮、乙醇、正己烷和异丙醇中的一种或两种，二次脱脂的操作重复I次?8次，真皮层皮片每次浸泡在有机溶剂中的时间为15min?60min。
[0039]优选的，真皮层皮片与有机溶剂的体积比为1:3，有机溶剂为乙醇和异丙醇的混合溶液，二次脱脂的操作重复2次，真皮层皮片每次浸泡在有机溶剂中的时间为60min。
[0040]得到的脱脂后的真皮层皮片采用磷酸盐缓冲溶液清洗干净后备用。
[0041]S20中，病毒灭活处理的操作可以为:按照体积比为1:1?