48h进行定型处理，得到所需的脱细胞真皮基质。
[0081]实施例4
[0082](I)制备真皮层皮片:将健康猪的整张腹部与背部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.2mm,制成厚度为0.8mm的真皮层皮片，储存在-20°C环境中备用；
[0083](2)病毒灭活处理:将皮片经过90°C干热灭活24h ;
[0084](3)脱细胞处理:将步骤(2)制备的真皮层皮片用中性酶溶液处理12h，再用3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)处理8h，该步骤重复2次；
[0085](4)脱脂处理:一次脱脂是采用质量浓度3%的碳酸钠进行脱脂6h，皮片与脱脂剂的体积比为1:2 ;二次脱脂是将脱细胞真皮基质置于有机溶剂正己烷、异丙醇中进行二次脱脂，正己烷处理时间为60min，异丙醇处理时间为50min，脱脂后的脱细胞真皮基质用磷酸缓冲盐溶液清洗，清洗时间为4h，每隔20min换一次磷酸缓冲盐溶液；
[0086](5)清洗及脱水处理:采用质量分数为0.9 %的NaCl溶液和pH值为7.2的磷酸缓冲盐溶液交替清洗，NaCl溶液处理时间为12h，磷酸缓冲盐溶液处理时间为12h，NaCl溶液每隔Ih换液，交替清洗3次，最后采用洗衣机进行脱水处理；
[0087](6)冻干、定型处理:将经清洗工艺后的皮片，放入特定程序的冷冻干燥机中冻干，将冻干后的脱细胞真皮基质置于20MPa的压力下保压5h，进行定型处理，得到所需的脱细胞真皮基质。
[0088]实施例5
[0089](I)制备真皮层皮片:将健康猪的整张腹部与背部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.18mm,制成厚度为1.0mm的真皮层皮片，储存在_20°C环境中备用；
[0090](2)脱脂处理:一次脱脂是采用质量浓度1.2%的碳酸氢钠进行脱脂12h，皮片与脱脂剂的体积比为1:3 ;二次脱脂是将皮片置于有机溶剂正己烷中进行二次脱脂，正己烷处理时间为30min ;脱脂后的脱细胞真皮基质真空干燥后用磷酸缓冲盐溶液清洗，清洗时间为3h，每隔30min换一次磷酸缓冲盐溶液；
[0091](3)脱细胞处理:将步骤(2)制备的真皮层用胃蛋白酶处理18h，再用烷基葡萄糖苷处理6h，SDS每隔Ih换液，该步骤重复3次；
[0092](4)病毒灭活处理:将脱细胞处理后的皮片用过氧乙酸-乙醇溶液进行病毒灭活，过氧乙酸的质量分数为0.10%，乙醇的质量分数为20%，皮片与病毒灭活溶液的体积比为1:3 ；
[0093](5)清洗及脱水处理:采用质量分数为0.9 %的NaCl溶液和pH值为7.5的磷酸缓冲盐溶液交替清洗，NaCl溶液处理时间为10h，磷酸缓冲盐溶液处理时间为12h，每隔2h换液，交替清洗4次，最后采用机械力脱水设备进行脱水处理；
[0094](6)冻干、定型处理:将经清洗及脱水后的皮片，放入冷冻干燥机进行冻干处理，再将冻干后的脱细胞真皮基质置于5MPa的压力下保压48h进行定型处理，得到所需的脱细胞真皮基质。
[0095]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1.一种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片； 对所述真皮层皮片分别进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，得到脱细胞真皮基质前体，其中，所述脱脂处理、所述病毒灭活处理和所述去除免疫原性处理的操作顺序可以相互更换，所述脱脂处理的操作为:将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5%?3%的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂，所述去除免疫原性处理的操作为:将所述真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中；以及 对所述脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型，得到脱细胞真皮基质。2.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为:用机械法对所述哺乳动物的皮肤进行初步脱脂及除毛，接着用取皮机将所述哺乳动物的皮肤去掉0.15_?0.4_表皮与皮下组织后制成厚度为0.3mm?1.0mm的真皮层皮片。3.根据权利要求1或2所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物的皮肤包括依次层叠的皮毛、表皮层、真皮层和皮下组织。4.根据权利要求3所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物的皮肤为猪、牛、羊或马的皮肤。5.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5%?3%的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂的操作中，所述真皮层皮片与所述碱溶液的体积比为1:1?4，所述碱溶液的溶质选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种，所述真皮层皮片浸泡在所述碱溶液中的时间为6h ?24h ; 所述将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5%?3%的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂的操作中，所述真皮层皮片与所述有机溶剂的体积比为1:1?4，所述有机溶剂选自丙酮、乙醇、正己烷和异丙醇中的一种或两种，所述真皮层皮片浸泡在所述有机溶剂中的操作重复I次?8次，所述真皮层皮片每次浸泡在所述有机溶剂中的时间为15min?60mino6.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活处理的操作为:按照体积比为1:1?4，将所述真皮层皮片浸泡在病毒灭活溶液处0.5h?Sh进行病毒灭活处理，所述病毒灭活溶液为过氧化物和乙醇的混合溶液或过氧化物溶液，所述过氧化物和乙醇的混合溶液中的过氧化物的质量百分含量为0.1 %?10%，所述过氧化物和乙醇的混合溶液中的乙醇的质量百分含量为20%?70%。7.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活处理的操作为:对所述真皮层皮片在50°C?120°C下进行干热灭活处理3h?48h。8.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述将所述真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中操作中，所述蛋白酶溶液的溶质为胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶，所述蛋白酶溶液的溶质的质量百分含量为0.05%?0.5%，所述表面活性剂溶液的溶质选自烷基葡萄糖苷、十二烷基硫酸钠、TritonX-100、脱氧胆酸钠、3-[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、硫代甜菜-10和硫代甜菜-16中的一种，所述表面活性剂溶液的溶质的质量百分含量为0.01%?5%，所述交替浸泡的次数为2次?6次，所述交替浸泡的操作中每次操作的时间为6h?24h。9.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述对所述脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型的操作为:将所述脱细胞真皮基质前体脱水后放入冷冻干燥机冻干，接着置于5MPa?30MPa的压力下保压Ih?30h进行定型处理。10.一种脱细胞真皮基质，其特征在于，所述脱细胞真皮基质采用如权利要求1?9中任一项所述的脱细胞真皮基质的制备方法制备得到。
【专利摘要】本发明公开了一种脱细胞真皮基质及其制备方法，脱细胞真皮基质的制备方法包括如下步骤：对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片；对真皮层皮片分别进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，得到脱细胞真皮基质前体，去除免疫原性处理的操作为：将真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中；以及对脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型，得到脱细胞真皮基质。这种脱细胞真皮基质的制备方法通过将真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中可以最大限度的降低真皮基质的免疫原性，又保留了真皮基质的正常胶原结构，制得的脱细胞真皮基质具有适当的降解速率、良好的生物相容性与骨诱导能力。
【IPC分类】A61L27/36, A61L27/60
【公开号】CN105126170
【申请号】CN201510508880
【发明人】李丽花, 钟梅玲, 谭荣伟, 佘振定
【申请人】深圳兰度生物材料有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月18日