一种用于骨软骨界面修复的具有梯度活性的支架材料及其制备方法和应用
【专利说明】一种用于骨软骨界面修复的具有梯度活性的支架材料及其制备方法和应用
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及生物材料技术领域，更具体地，涉及一种用于骨软骨界面修复的具有梯度活性的支架材料及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0003]关节软骨由含胶原纤维的致密结缔组织形成基本框架，这种框架呈半环形，其底端紧紧附着在骨质上，上端朝向关节面，该结构使软骨与骨紧密结合从而难以脱落，同时当受到压力时，还允许有少量变形，起到缓冲压力的作用。在胶原纤维之间，分布着形态渐变的软骨细胞。由浅层向深层，软骨细胞逐渐由扁平样过渡至椭圆或圆形，维持软骨的正常代谢。软骨可分为四层，各层中细胞的形状与大小、胶原纤维的粗细与走向、蛋白多糖的浓度、水的含量，均不相同。浅表层，胶原纤维密集排列，形成膜样结构，蛋白多糖的浓度相对较低，水分含量最多；中间层，胶原纤维随机排列，相互交织。软骨细胞呈随机分布；放射排列层，含蛋白多糖最多，胶原纤维最粗，且自下而上呈放射状排列，垂直于软骨表面，而软骨细胞成串定位于此层中；钙化软骨层，邻接软骨下骨。
[0004]关节软骨没有神经和血管，其营养供给是通过关节活动产生的压力变化，使滑液在关节腔与软骨基质之间流通来完成，故损伤后的关节软骨难以自行修复与再生，且易导致明显的功能障碍。关节软骨缺损在临床上十分常见，常常导致患者出现关节疼痛、活动受限，诱发骨关节炎，甚至导致肢体功能障碍和残缺，严重影响患者的生活质量，已成为目前肢体残障的主要原因之一。
[0005]现阶段，临床应用的治疗软骨损伤的方法主要是:(1) 口服药物、关节腔内注射透明质酸、关节灌洗术和清理术等，但只能起到缓解症状，延缓病情进展的作用，不能修复已损伤的软骨及软骨下骨；(2)钻孔术、微骨折术等手术可利用经髓腔自然渗透到钻孔区的、未经过特殊处理的少量间充值干细胞(MSCs)修复缺损，但其刺激所新生成的是疤痕组织和以I型胶原为主的纤维软骨，不具备正常关节软骨的生物力学性能，远达不到关节软骨力学的需要；(3)自体软骨细胞移植或自体骨软骨块嵌合移植，获得了一定的治疗效果，但取材来源有限，软骨细胞扩增能力欠佳及对供区造成伤害等原因大大限制了其应用；(4)同种异体软骨移植，虽然可提供相应位置的供体材料，但存在免疫排斥反应、供体受体融合不完全、软骨分离等弊端，且面临疾病传播的风险。
[0006]
目前最新发展的组织工程，是将分离的自体细胞种植于细胞支架(scaffold)或细胞外基质(extracellular matrix, ECM)上，使细胞在预制形态的三维支架上增殖分化，然后将这种细胞杂化材料(hybrid material)植入软骨缺损部位。在生物材料逐步降解的同时，种植的骨细胞不断增殖，从而达到修复组织缺损的目的。
[0007]现在使用的软骨修复支架材料可分为天然支架材料和人工支架材料两大类。天然支架材料是来源于动、植物或者人体内天然存在的大分子材料，具有良好的生物相容性、组织亲合性。人工支架材料是目前研究较多的材料，主要有高分子聚合物，无机物等，可根据需要调整其物理、化学、生物力学和降解性能，容易加工成形，生产重复性好。无机物以碳酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石为主。近年来，羟基磷灰石(HA)因其与骨矿物质相似而成为骨骼修复材料。它可以作为骨替代物而进行软骨修复，或涂于接骨材料表面使其植入体内后有更好的修复效果，但简单的涂抹或者混合不能够非常准确地将HA涂层涂于受损伤表面，并且对基材要求高，涂层组成结构不均一等缺点，同时传统煅烧法制备羟基磷灰石对实验要求较高，因此需要发展新的医疗HA应用技术。模拟人体骨磷灰的生物矿化过程引起关注，它是指在有机基质调控和参与下生物矿物在生物体内的形成过程。这种方法能够在与基质水溶液接触的表面上形成均一的磷灰石涂层，并由仿生矿化过程在人体温度下进行，且用该种方法形成的HA在组成结构性能与天然骨基质更为相近，是很好的生物相容性骨修复材料。因此模拟生物矿化成为等离子喷涂法制备经基磷灰石涂层最有前景的替代技术。
[0008]于此同时，研究发现近年来在所构建的支架材料只侧重于修复软骨，且往往是各向均一的。在体内，软骨并非是单一结构的组织，且软骨与骨紧密结合在一起，才能行使其传递应力的功能。因此，需要制备模拟体内组织结构的复合生物材料，特别是骨软骨界面结构，才能提供类似体内的细胞微环境，从而使得软骨组织缺损的修复更牢固、成功。
【发明内容】
[0009]本发明解决的技术问题是克服现有组织工程支架材料结构单一，机械性能不足，以及操作过于繁琐，无法量化生产等不足，提供了一种用于骨软骨界面修复的具有梯度活性的支架材料及其制备方法和应用。
[0010]本发明的技术目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种用于骨软骨界面修复的具有梯度活性的支架材料，所述支架材料由以下制备方法制成:S1.将钙盐溶液和含有酪蛋白的碳酸盐溶液混合，搅拌，清洗，过滤、干燥后得到含有酪蛋白的复合碳酸钙微球；
52.将SI中含有酪蛋白的复合碳酸钙微球分散于N，N-二甲基甲酰胺中，得到悬浮液A ;将生物医用可降解聚合物溶解于二氯甲烷中，得到溶液B ;将A加入B中，搅拌，制备成膜，干燥后将成膜材料在碱性溶液下浸泡，待用；
53.将S2中所得物质加入无菌SBF溶液，进行矿化，清洗，干燥后即得所述支架材料。
[0011]本发明通过将含有酪蛋白碳酸钙复合微球与生物医用可降解聚合物在一定条件下进行复合，并原位进行矿化，得到了具有层状结构的含纳米羟基磷灰石的有机无机复合材料。
[0012]该层状结构为沿着复合材料厚度方向上，各组分的相对含量不同且底层与表层结构也不同。
[0013]优选地，所述SI中钙盐溶液和含有酪蛋白的碳酸盐溶液混合体积比为1:1，所述含有酪蛋白的碳酸盐溶液中酪蛋白的质量体积浓度为8mg/ml ；
所述含有酪蛋白的复合碳酸钙微球直径为1~2μπι。
[0014]优选地，所述S2中N，N- 二甲基甲酰胺与二氯甲烷的混合体积比为1:3。
[0015]优选地，所述生物医用可降解聚合物包括聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸。
[0016]优选地，当所述S2中加入聚已内酯制备成溶液B时，聚己内酯的分子量为70000-90000 Da，所述S2中成膜材料，按质量体积百分数计，聚已内酯浓度为8%~20 w/v%,CaCO3浓度为 4%~10 w/v %。
[0017]优选地，当所述S2中加入聚乳酸-羟基乙酸共聚物时，按质量体积百分数计，聚乳酸-羟基乙酸共聚物浓度为5 %~20 w/v % ;所述成膜材料中聚乳酸-羟基乙酸共聚物与CaCO3的质量比为2~3:1。
[0018]优选地，当所述S2中加入聚已内酯制备成膜材料时，成膜方法为将A加入B中，搅拌，静电纺丝成膜；
所述S2纺丝中推动速度为1.0 ml/h，流量为0.6-1.2 ml/h，施加电压值为10~20 kV，接收距离为10~20 cm ；
所述静电纺丝成膜的纤维直径为600~1000 nm。
[0019]优选地，当所述S2中加入制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物成膜材料时，成膜方法为将A与B的混合溶液溶于二氧六环溶液中，浇注成膜于培养皿中，真空干燥24 h~72h ;
所述浇注成膜厚度为300~600 nm。
[0020]优选地，所述S2中成膜材料在0~4°C条件下浸泡0.1~1 h ;
更具体地，所述成膜材料在1.5 M的NaOH溶液下浸泡，浸泡的目的是为了提高CaCO^j球的暴露程度并增加复合膜的表面亲水性。
[0021]所述S3中将S2中所得物质经75%酒精灭菌，风干12~24 h，加入无菌SBF溶液，于37°C浸泡14天；14天后移去矿化液，去离子水清洗三遍，冷冻干燥后，即得所述支架材料。
[0022]本发明通过将无机的含有酪蛋白的碳酸钙复合微球和有机的生物医用可降解材料进行复合，并在一定条件下原位矿化，形成了具有生物活性的梯度分布的纳米羟基磷灰石。而直接采用纳米羟基磷灰石作为原料复合有机聚合物形成的支架材料，其表征结果显示材料组成结构不均一且羟基磷灰石容易发生团聚，并不能获得本发明原位矿化后形成的羟基磷灰石层状仿生结构。
[0023]进一步地，通过对本发明制备得到的支架材料进行细胞培养实验后发现，其细胞生长情况良好，7天后细胞增殖率达到了 160%和90%，显示了其良好的细胞培养活性。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明制备了具有梯度活性的生物支架材料，其中含具有骨诱导活性的酪蛋白CaCO3复合微球，分布于复合支架中，并结合体外矿化，使具有生物活性的纳米HAP在复合材料沿厚度方向呈梯度分布，很好的模拟了骨软骨界面结构。该材料不仅具有促进骨细胞钙吸收、成骨活性的作用。同时，该骨软骨界面修复支架材料，在多层结构中沿用了同一种聚合物，黏合牢固，还可有效解决软骨与骨的整合问题。且本发明所述的软骨修复膜，制备工艺中不接触有毒物质，未使用变性剂、促凝剂和交联剂等添加剂，并且制备工艺简单，成本低，无需大型设备，在医学组织工程修复上有很高的应用前景和实用价值。
【附图说明】
[0025]图1为酪蛋白碳酸钙复合微球的扫描电镜图； 图2为实施例2具有梯度活性的支架材料复合静电纺丝膜表面、背面、截面的扫描电镜图；
图3为实施例3具有梯度活性的支架材料复合浇注膜表面、背面、截面的扫描电镜图。
[0026]图4为对比例I制备得到的材料形貌图。其中图4A为直接采用羟基磷灰石原料复合得到的材料的形貌图，图4B为本发明实施例2得到的支架材料表面矿化形成的羟基磷灰石放大后的形貌图。
[0027]图5为实施例2和实施例3的梯度活性的支架材料细胞培养实验图，其中5A为细胞在实施例2静电纺丝支架上生长状况，图5B为细胞在实施例3PLGA浇注支架上生长状况。
【具体实施方式】
[0028]下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0029]除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0030]实施例1酪蛋白/碳酸钙微球的制备
配制浓度为50 mM|丐盐(氯化|丐)溶液和50 mM的碳酸盐(碳酸钠和8 mg/ml酪蛋白)，两溶液等体积混合，在600 rpm搅拌20 min，反复清洗三遍并冷冻干燥。将材料固定于样品台上，喷金处理，置于热场发射扫描电镜的真空室内，15 kV电压下观察，得到SEM观察图。产品如图1所示，微球分散均匀，并且大小约I ym，为均匀球形。