一种定量检测海参多糖的方法与流程

本发明涉及一种检测生物大分子的方法，更具体，涉及定量检测海参多糖的方法。

背景技术：

海参中营养物质种类和含量丰富，海参多糖在海参中的营养成分占重要地位。海参多糖(sea cucumber polysaccharide)的结构主要有两类：一类是海参糖胺聚糖，又称岩藻糖化硫酸软骨素，另一类是海参岩藻聚糖。虽然两类的糖基组成不同，但它们的糖链上都被不同程度的硫酸酯化。研究发现海参多糖对人体的生理功能调控、维系生命好的状态具有很重要的意义，主要表现在抵抗血栓、肿瘤、凝血和降低血清胆固醇以及提高身体免疫力等方面。

目前社会对海参的需求也越来越多，海参加工产品多种多样，导致产品品质也各有不同。因此，定量检测海参多糖是相关加工工艺产品的质量控制的必要措施，也是对含这类多糖的食品质量评价的有力手段。

目前，对这些海参多糖的定量检测，主要集中在对降解产生的不同单糖组分的检测分析，最为常用的是化学显色法。例如经过分离纯化后，通过咔唑法测定糖醛酸含量从而间接测定含糖醛酸多糖，以及通过Elson-Morgan法测定氨基糖含量。但这些化学显色法缺乏特异性，难以得到准确的结果。申请号200810016622.8的“一种海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法”也作了相关报道，该方法通过酶解醇沉等步骤，以岩藻糖含量为基准，乘以转化系数得到了海参多糖的含量。但是，目前还缺乏同时对岩藻糖基化硫酸软骨素和岩藻多糖这两种多糖进行定量的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于实现海参多糖的定量分析，使海参中的海参糖胺聚糖和海参岩藻聚糖能够同时、快速、准确的完成定量检测。

为了达到上述目的，本发明提供了一种定量检测海参多糖的方法，包括如下步骤：

S1、向1.3mol/L的三氟乙酸水溶液中加入硫酸软骨素及岩藻糖，配制一系列浓度梯度的含有硫酸软骨素及岩藻糖的标准样品溶液；

所述硫酸软骨素及岩藻糖的浓度均在0.02～0.4mg/ml范围内；

所述硫酸软骨素及岩藻糖最优浓度范围为0.04～0.2mg/ml；

S2、提取待测样品中的多糖：将待测样品粉碎、混匀后，准确称量，然后采用酶解后醇沉法提取、冻干，得到待测样品海参多糖提取物，向所述待测样品海参多糖提取物中加入三氟乙酸水溶液，所述三氟乙酸水溶液的浓度为1.3mol/L，得到待测样品海参多糖溶液；

所述待测样品为海参或海参制品；

优选方式下，所述待测样品海参多糖溶液中每毫升三氟乙酸水溶液加入所述待测样品海参多糖提取物0.1～100mg；

S3、准确量取步骤S1制得的各浓度标准溶液及步骤S2制得的待测样品溶液、密封，分别准确1.00ml标准溶液和待测样品溶液，密封，在105℃下水解3h，放置室温，采用冷冻离心浓缩除去溶剂，收集固相；向所述固相物质中加入0.3～1mL甲醇或水，再采用冷冻离心浓缩除去溶剂，重复三次，达到除酸目的，得到各浓度标准样品溶液及待测样品溶液的固相残余物；

S4、向步骤S3制得的各样品溶液的固相残余物中分别加入等量的氨水溶解，再加入乳糖作为内标物，加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生化，得到含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液；

S5、液相色谱-质谱联用检测步骤S4制得的含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液，得到各样品中硫酸软骨素二糖衍生物和岩藻糖衍生物各自监测离子色谱峰面积；

检测条件为：

高效液相色谱-三重四极杆质谱仪；

色谱条件为：

反相色谱柱，

柱温30℃，

流动相20mmol乙酸铵-乙腈(88:12，V/V)，

流速0.5mL/min；

质谱条件：

离子源ESI源，

正离子模式检测，

喷雾电压5.5kV，

辅助加热气温度：600℃，

氮气作为碰撞气和喷雾气，

选择多重反应监测(MRM)，监测的离子对包括673.3/175.0、687.3/175.0、495.2/175.0；

S6、根据色谱峰保留时间和监测特征离子对区分内标乳糖衍生物、标样多糖的硫酸软骨素二糖衍生物和岩藻糖衍生物，然后以标样色谱峰面积和内标样峰面积的比值作为响应值，根据响应值和标准糖浓度绘制工作曲线，对照工作曲线，得出待测样品中硫酸软骨素和岩藻糖的含量；

S7、根据步骤S6得到的硫酸软骨素和岩藻糖的含量，结合公式(1)、(2)得到待测样品中岩藻聚糖和岩藻糖基化硫酸软骨素的含量；

X＝m_CS/A％(1)，

Y＝m_Fuc×M_(Fuc-H2O)/M_(Fuc)－X×(1－A％)(2)，

其中，X为岩藻糖基化硫酸软骨素的含量(mg/g)，Y为岩藻聚糖的含量(mg/g)，m_CS为样品中硫酸软骨素的含量(mg/g)，m_Fuc为样品中岩藻糖的含量(mg/g)，A％为硫酸软骨素主链在岩藻糖基化硫酸软骨素所占比例。

岩藻聚糖的结构组成为硫酸软骨素和岩藻糖；而岩藻聚糖是由岩藻糖所构成的直链多糖。

A可以通过采用核磁共振氢谱分析纯化后的岩藻糖基化硫酸软骨素得到，也可以采用色谱方法分析纯化后岩藻糖基化硫酸软骨素的降解产物得到。

优选方式下，步骤S4的具体操作为：将步骤S3制得的各样品溶液的固相残余物分别进行以下处理：

将所述样品溶液的固相残余物全部加入到400μL的氨水中溶解，再加入1mg/ml的乳糖溶液100μL、0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液400μL，密封，70℃环境下反应30min；反应结束后，加入1mL甲醇或水，离心浓缩除去溶剂，重复三次；再加入1mL的体积浓度为1％乙酸水溶液、1mL氯仿萃取，震荡后静置，除去氯仿，收集水相，重复萃取三次后，取最终的水相作为样品供试液。

本发明的有益效果是：

1、本发明中通过检测降解产生的硫酸软骨素特征二糖片段和岩藻糖，能够实现同时检测海参中岩藻糖基化硫酸软骨素和岩藻多糖的含量。

2、本发明方法用于快速定量测定海参多糖，更准确，方便，且效率高，能够对不同种类、经过不同加工处理的海参多糖进行准确的定量测定，为不同的海参加工产品的质量控制提供了有效手段。

3、本发明采用离心浓缩方法除去样品中的三氟乙酸和氨水，适合批量处理样品，而且相对于氮吹、真空烘干等方法，样品不易发生损失，能够保证定量检测的准确可靠。

4、本发明建立了适用于海参多糖检测的三重四极杆质谱检测方法，确定了监测离子对，保证了检测的稳定性和灵敏度。

附图说明

图1是实施例1的典型的混合标准糖溶液MRM色谱图

图2是实施例1的典型的海参多糖样品溶液MRM色谱图

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明提供一种内标法定量检测海参多糖的方法，具体步骤如下：

S1、配制一系列浓度梯度的硫酸软骨素和岩藻糖标准品溶液，其中硫酸软骨素和岩藻糖浓度在0.02～0.4mg/ml范围内，其中最优浓度范围为0.04～0.2mg/ml；溶液为1.3mol/L的三氟乙酸的水溶液。

S2、将样品混匀、粉碎后，采用酶解后醇沉法提取样品中的多糖，并加入三氟乙酸溶液，使待测溶液中三氟乙酸浓度为1.3mol/L。

S3、准确量取1.00mL标准溶液和待测样品溶液，密封，105℃下水解3h，放置室温，采用冷冻离心浓缩除去溶剂，然后加入0.3～1mL甲醇或水，再采用冷冻离心浓缩除去溶剂，以上操作重复三次，达到除酸目的；

S4、加入400μL的氨水溶解残渣，并分别加入100μL的1mg/ml的乳糖溶液，再加入400μL0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，密封，70℃水浴30min，加入1mL甲醇或水，离心浓缩除去溶剂，重复三次；然后加入1.00mL水，再加入1mL的氯仿，震荡后静置，除去氯仿，重复萃取三次，水层作为供试液；

S5、高效液相色谱-质谱联用分析的条件如下：高效液相色谱-三重四极杆质谱仪，反相C18色谱柱；流动相为20mmol乙酸铵水溶液(A)：乙腈(B)等度洗脱。质谱条件：离子源ESI源；正离子模式；监测的离子对包括673.3/175.0,687.3/175.0和495.2/175.0。

S6、根据色谱峰保留时间和监测特征离子对区分内标乳糖、标样多糖的硫酸软骨素二糖片段和岩藻糖衍生物，然后以标样色谱峰面积和内标样峰面积的比值作为响应值，根据响应值和标准糖浓度绘制工作曲线，计算待测样品中硫酸软骨素和岩藻糖的含量。

S7、根据公式(1)、(2)来计算海参中岩藻聚糖和岩藻糖基化硫酸软骨素的含量。X＝mCS/A％(1)；Y＝mFuc×0.89－X×(1－A％)(2)

X—岩藻糖基化硫酸软骨素的含量(mg/g)；Y—岩藻聚糖的含量(mg/g)；

mCS—样品中硫酸软骨素的含量(mg/g)；mFuc—样品中岩藻糖的含量(mg/g)

A—硫酸软骨素主链在岩藻糖基化硫酸软骨素所占比例。

其中，M(Fuc-H₂O)/M(Fuc)＝(164-18)/164＝0.89；M表示摩尔质量，Fuc表示岩藻糖，H₂O表示水分子。

本发明步骤S6确定的是海参样品中硫酸软骨素和岩藻糖的含量，根据岩藻糖基化硫酸软骨素中硫酸软骨素与岩藻糖的比例，并根据S7中的公式即可计算出海参糖胺聚糖和岩藻聚糖这两种多糖分别的含量。

实施例1

(1)将新鲜海参冷冻干燥、打碎得冻干粉。取1g试样，加入到30倍体积的0.1mol/L乙酸钠缓冲溶液(pH＝6.0)中，并加入10％木瓜蛋白酶，5mmol/L EDTA溶液和5mmol/L半胱氨酸溶液，于60℃水浴下搅拌反应24h之后，反应混合物离心(4000r/min，10min，20℃)。向上清液，即酶解液中加入3倍无水乙醇，离心(4000r/min，10min，20℃)取沉淀，沉淀冻干得粗多糖。

(2)准确称取硫酸软骨素、岩藻糖各10mg于10ml容量瓶中，加入5ml水溶解，用2.6mol/L的三氟乙酸定容，混匀，制成标准母液，然后用1.3mol/L的三氟乙酸稀释，配制成系列浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4mg/ml)的混合标准糖溶液，每个浓度两平行。

(3)制备待测样品多糖溶液：准确称取新鲜海参多糖20mg于10ml容量瓶，加入5ml水溶解，用2.6mol/L的三氟乙酸定容，混匀，得到待测样品多糖溶液；精确量取0.50ml待测样品多糖溶液于5ml水解管中，用1.3mol/L的三氟乙酸补足至1ml，待加热水解；精确量取0.50ml待测样品多糖溶液于5ml水解管中再加入0.50ml含0.20mg/ml标准糖的1.3mol/L的三氟乙酸混合溶液，制成加标样品，密封，待加热水解。

(3)标准品溶液和样品溶液，密封，在105℃，水解3h，使用冷冻离心浓缩除去溶剂，再加入0.5mL甲醇，使用冷冻离心浓缩除去溶剂，以上操作重复三次，达到除酸目的；

(4)加入400μL的氨水溶解残渣，并分别加入100μL的1mg/ml的乳糖溶液，再加入400μL 0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，密封，70℃水浴30min，加入1mL甲醇，真空冷冻离心减压除去溶剂，重复三次；然后加入1mL水，再加入1mL的氯仿，震荡后除去氯仿，重复萃取三次，水层作为供试液；

(5)色谱条件：高效液相色谱仪(日本SHIMADZU公司)；Thermo scientific Hypersil GOLD(150×2.1mm，5μm)色谱柱；柱温30℃；流速0.5mL/min；流动相为20mmol乙酸铵水溶液(A)：乙腈(B)＝88:12等度洗脱。质谱条件：4000QTRAP三重四极杆串联线性离子阱质谱仪(美国AB SCIEX公司)；离子源ESI源；喷雾电压5.5kV；正离子模式；辅助加热气温度600℃；选择多重反应监测(MRM)。其它参数如表1所示。

表1PMP衍生化的二糖和单糖的质谱分析条件

CE:碰撞能量，DP:去簇电压

(6)图1为典型混合标准糖溶液的MRM色谱图，图2为典型的海参多糖样品溶液MRM色谱图。分别选择673.3/175.0,687.3/175.0和495.2/175.0三个离子色谱图来对内标乳糖、硫酸软骨素二糖片段和岩藻糖的衍生物进行定量，工作曲线和加样回收结果如表2所示。根据工作曲线计算新鲜海参样品中硫酸软骨素和岩藻糖的含量分别为0.32mg/g、0.30mg/g，RSD分别为3.39％和6.46％。

(7)根据公式(1)、(2)来计算海参中岩藻聚糖和岩藻糖基化硫酸软骨素的含量。X＝mCS/A％(1)；Y＝mFuc×0.89－X×(1－A％)(2)X—岩藻糖基化硫酸软骨素的含量(mg/g)；Y—岩藻聚糖的含量(mg/g)；mCS—样品中硫酸软骨素的含量(mg/g)；mFuc—样品中岩藻糖的含量(mg/g)

A—硫酸软骨素主链在岩藻糖基化硫酸软骨素所占比例。

其中，M(Fuc-H₂O)/M(Fuc)＝(164-18)/164＝0.89；M表示摩尔质量，Fuc表示岩藻糖，H₂O表示水分子。

根据文献报道，在该种类的海参中，硫酸软骨素在岩藻糖基化硫酸软骨素中所占比例为68.9％，则由公式(1)(2)计算得到新鲜海参样品中岩藻聚糖和岩藻糖基化硫酸软骨素的含量分别为0.464mg/g、0.123mg/g。

表2方法学考察结果

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。