一种提高鸡骨骼肌成肌细胞分化能力的制剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高鸡骨骼肌成肌细胞分化能力的制剂及其应用，属于生物工程【技术领域】。本发明所提供的制剂是由肌源成纤维细胞提取物、丙酮酸盐和钙盐组成。其中，肌源成纤维细胞提取物是鸡肌源成纤维细胞经超声波裂解后，分离得到小于10KDa的蛋白液经真空干燥获得的；钙盐和丙酮酸盐可为丙酮酸钙。本发明所提供的制剂具有成份简单易得、使用简便有效的特点，可显著提高鸡骨骼肌成肌细胞的融合率，促进骨骼肌纤维直径的增大及功能性收缩蛋白的表达。利用本发明提供的制剂培养成肌细胞，成肌细胞的融合率提高32.01％，肌管中的平均细胞核数提高91.63％，肌管平均直径增加45.59％。
【专利说明】一种提高鸡骨骼肌成肌细胞分化能力的制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高鸡骨骼肌成肌细胞分化能力的制剂及其应用，属于生物工程
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 肌肉组织广泛存在于动物体，是胚胎发育过程中最早形成的组织之一，是研究细 胞命运决定、细胞分化、形态发生等基本生命现象的良好模型。然而目前为止，对肌肉发育 及再生机制的阐述仅仅是冰山一角。尽管体内成肌模型的建立很好的模拟了肌肉的再生过 程，但也给相关机制的研究增加了复杂性，因此建立高效、稳定的骨骼肌细胞体外培养体系 将为进一步阐述骨骼肌发育、再生机制奠定基础。
[0003] 肌肉形成是一个连续的生理过程。胚胎期，肌肉前体细胞一成肌细胞增殖、 分化、融合为初级肌管并逐步成熟；出生后，肌管的数目虽然不再改变，但当肌肉组织 受损时，静息的卫星细胞被激活，进而分裂、融合形成新的肌管，肌肉得以再生（Brian etal.，2008)。依靠现代细胞分离、培养技术，研究人员能够利用胚胎成肌细胞或成体卫星 细胞体外培养获得初级肌管，但所得肌管类型随机性强，氧化代谢水平各异，通常仅在形态 或功能的某些方面符合体内的成肌进程。这对于未来在医疗上通过细胞移植治疗肌病，如 心肌梗死、缺血性心力衰竭、大面积肌肉损伤、杜兴肌营养不良症等造成了技术上的障碍。 此外，畜牧业生产中，畜禽的体增重、肌肉含量和体脂含量对于不同育种目标的畜禽是均非 常重要的考察指标。例如，肉禽要求有较快的体增重和较高的肌肉含量，以期获取较高经济 效益；而种禽则相反，要求体重小，增重慢，以利于公禽的精液品质和母禽的产蛋性能；有 些地方品种又要求控制一定的肌肉和体脂比例以保证其可口的风味。因此，对肌肉形成相 关过程和机制的研究也将为畜禽育种上的应用提供理论参考。
[0004] 肌肉组织并不是由单一类型的细胞构成，肌肉细胞和其它类型细胞之间的互作在 整个成肌过程中发挥重要作用（Donoghue and Sanes，1994;Krauss et al.，2005)。无论是 发育期还是成熟期的肌肉组织中都存在肌源成纤维细胞，它们位于肌肉细胞外的基质中， 不仅为成肌提供了可以附着的骨架结构，还在很大程度上负责分泌细胞外基质和生长因子 (Idea etal.，2009)。现有的成肌培养体系大多没有考虑到体内成肌微环境的作用，因而建 立一种接近体内成肌模式的体外培养体系对于肌肉发育和再生机制的研究及医疗和畜牧 生产领域的应用均具有积极意义。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种提高鸡骨骼肌成肌细胞分化能力的制剂，所 采取技术方案如下：
[0006] 本发明的一个目的是提供一种提高鸡骨骼肌成肌细胞分化能力的制剂，该制剂是 由肌源成纤维细胞提取物、丙酮酸盐和钙盐组成。
[0007] 所述肌源成纤维细胞提取物是鸡肌源成纤维细胞经超声波裂解后，分离得到小于 lOKDa的蛋白液经真空干燥获得的。
[0008] 所述制剂用于培养鸡骨骼肌成肌细胞，提高鸡骨骼肌成肌细胞的分化能力。
[0009] 所述丙酮酸盐可以为丙酮酸钙、丙酮酸钠、丙酮酸钾；所述钙盐可以为丙酮酸钙、 氯化钙、硫酸钙；丙酮酸盐和钙盐可同时为丙酮酸钙。
[0010] 优选地，丙酮酸盐和钙盐同时为丙酮酸钙。
[0011] 所述肌源成纤维细胞提取物与丙酮酸钙单独包装。
[0012] 本发明的另一个目的是提供一种利用所述制剂培养鸡骨骼肌成肌细胞的方法，该 方法是将肌源成纤维细胞与丙酮酸钙混合后，添加到成肌分化培养基中使用。
[0013] 所述肌源成纤维细胞提取物与丙酮酸钙混合，肌源成纤维细胞提取物与丙酮酸钙 的质量比为10-120:1。
[0014] 所述添加到成肌分化培养基中使用，肌源成纤维提取物的终浓度为600-2400mg/ L，丙酮酸钙的终浓度为5-80mg/L。
[0015] 优选地，肌源成纤维提取物的终浓度为2400mg/L，丙酮酸钙的终浓度为20mg/L。
[0016] 所述鸡骨骼肌成肌细胞分化培养条件优选培养温度为39°C，C02浓度为5 %，周期 为8-10天，其间每隔2天换液一次。
[0017] 所述成肌分化培养基优选含有2(%马血清、211111^-谷氨酰胺、10(^/ 1111青霉素、 100ug/ml链霉素的高糖DMEM培养基。
[0018] 本发明有益效果：
[0019] 肌肉形成过程中，成肌细胞的细胞外基质中分布有大量的肌源成纤维细胞，它们 通过分泌细胞因子调控整个成肌过程，包括抑制成肌细胞凋亡、促进成肌细胞迁移及肌管 成熟等。本发明采用生物提取技术，将肌源成纤维细胞提取物作为诱导鸡骨骼肌成肌细胞 分化的培养组分，一方面模拟了体内发育过程中的成肌微环境；另一方面避免了现有技术 中采用细胞共培养方式造成成肌细胞污染的可能性，能够满足研究和临床级别细胞培养的 需要。钙离子是肌肉细胞兴奋一收缩偶联的介质分子，对于促进肌肉细胞成熟及功能性收 缩发挥着重要作用。丙酮酸是机体糖代谢的中间产物，能够代替葡萄糖为细胞氧化供能提 供碳源，对于提高肌肉细胞的磷酸化水平、增强机械性能等具有积极作用。
[0020] 本发明提供的提高鸡骨骼肌成肌细胞分化能力的制剂，成份简单易得、使用简便 有效，可显著提高鸡骨骼肌成肌细胞的融合率，促进骨骼肌纤维直径的增大及功能性收缩 蛋白的表达，从而在形态及功能上同时提高了鸡骨骼肌成肌细胞的分化能力，不同于现有 的仅能促进肌肉细胞表型性肥大的培养方法。对于体外成肌培养条件的探索及优化将为解 析肌肉形成及再生机制等奠定基础，具有良好的研究及应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为成肌细胞在各组培养基中分化培养8天后形成的肌管形态；
[0022] (100X，A，含有成肌分化培养基；B，含有成肌分化培养基、20mg/L丙酮酸钙；C， 含有成肌分化培养基、2400mg/L肌源成纤维细胞提取物；D，含有成肌分化培养基、5mg/L 丙酮酸钙、2400mg/L肌源成纤维细胞提取物；E，含有成肌分化培养基、20mg/L丙酮酸钙、 2400mg/L肌源成纤维细胞提取物；F，含有成肌分化培养基、80mg/L丙酮酸钙、2400mg/L肌 源成纤维细胞提取物）。
[0023] 图2为成肌细胞在各组培养基中分化培养8天后骨骼肌收缩蛋白表达水平的 Western Blot检测结果；
[0024] (A，含有成肌分化培养基；B，含有成肌分化培养基、20mg/L丙酮酸钙；C，含有成肌 分化培养基、2400mg/L肌源成纤维细胞提取物；D，含有成肌分化培养基、5mg/L丙酮酸钙、 2400mg/L肌源成纤维细胞提取物；E，含有成肌分化培养基、20mg/L丙酮酸钙、2400mg/L肌 源成纤维细胞提取物；F，含有成肌分化培养基、80mg/L丙酮酸钙、2400mg/L肌源成纤维细 胞提取物）。
[0025] 图3为成肌细胞在A组和E组培养基中分化培养8天后细胞骨架微丝蛋白在肌管 中分布的免疫荧光检测结果；
[0026] (200 X，A，含有成肌分化培养基；E，含有成肌分化培养基、20mg/L丙酮酸 钙、2400mg/L肌源成纤维细胞提取物，其中，上图为鬼笔环肽标记的微丝蛋白；下图为 Hochest33342标记的细胞核；虚线圈出的部分为肌管）。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0028] 下述实施例中的方法未经特别说明均为常规方法。
[0029] 下述实施例中所用仪器和试剂未经特别说明均为可通过商业途径获得的常规仪 器和试剂。
[0030] 实施例1鸡骨骼肌成肌细胞的获得及增殖培养
[0031] 新鲜的种鸡蛋于38°C，63%湿度的孵化箱内孵化11天。蛋壳经70%的乙醇消毒 后，破壳取出鸡胚置于培养皿中。用镊子将鸡胚胸部皮肤拨开，分离胸大肌，并在解剖镜下 去除韧带、结缔组织及血管。Hank's液清洗胸肌组织3次，充分剪碎后加入0. 1 %的胶原酶 I于38°C孵育30分钟，期间每10分钟吹打一次。离心，加入Hank's液吹散细胞后，用200 目的不锈钢滤网过滤细胞以获得单细胞悬液。
[0032] 配制20%、27. 5%和40%的Percoll溶液，将其按浓度由高向低依次加入15ml离 心管内（动作要轻缓），然后将上述细胞悬液缓慢铺在20% Percoll液面上。1500g、4°C水 平离心8分钟，小心收集27. 5% /40%液面交界处的细胞，用含有10% FBS、2mML-谷氨酰 胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、高糖DMEM的成肌增殖培养基重悬细胞并接种于培养 皿，39°C培养2小时，收集尚未贴壁的细胞即为成肌细胞。
[0033] 将成肌细胞接种于0. 1 %明胶处理的培养皿中，接种密度为5000个细胞/cm2， 39°C培养1天后换液，继续培养2-3天达到70%细胞汇合。
[0034] 实施例2肌源成纤维细胞提取物的获得
[0035] 新鲜的种鸡蛋于38°C，63%湿度的孵化箱内孵化11天。蛋壳经70%的乙醇消毒 后，破壳取出鸡胚置于培养皿中。用镊子将鸡胚胸部皮肤拨开，分离胸大肌，并在解剖镜下 去除韧带、结缔组织及血管。Hank's液清洗胸肌组织3次，充分剪碎后加入0. 1 %的胶原酶 I于38°C孵育30分钟，期间每10分钟吹打一次。离心，加入Hank's液吹散细胞后，用200 目的不锈钢滤网过滤细胞以获得单细胞悬液。用含有10% FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml 链霉素的高糖DMEM重悬细胞并接种于培养皿，39°C培养2小时，收集贴壁细胞并传代纯化 培养3-5代得到肌源成纤维细胞。
[0036] 将肌源成纤维细胞进行超声波破碎，参数为450Hz、每次超声6秒停10秒、共40 次。采用 15mL/10KD 的蛋白浓缩柱（Millipore UFC901024 Amicon Ultra -15,按说明书 操作）过滤浓缩上述细胞裂解液，收集分子量小于10KD的蛋白液进行真空干燥处理。
[0037] 实施例3鸡骨骼肌成肌细胞的分化培养
[0038] 当经过实施例1培养的鸡骨骼肌成肌细胞达到70%汇合时，去除成肌增殖培养 基，PBS清洗3次，沿着培养皿内壁缓慢加入表1所示的A- F组培养基。其中，A组为对照 组，仅含有成肌分化培养基（成肌分化培养基为含有2%马血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml 青霉素、100ug/ml链霉素的高糖DMEM) ;B-F组为实验组，为添加有至少一种制剂组分的成 肌分化培养基。
[0039] 表1 A- F组培养基的组成及配比
[0040]
【权利要求】
1. 一种提高鸡骨骼肌成肌细胞分化能力的制剂，其特征在于，是由肌源成纤维细胞提 取物、丙酮酸盐和钙盐组成。
2. 权利要求1所述制剂，其特征在于，所述肌源成纤维细胞提取物是鸡肌源成纤维细 胞经超声波裂解后，分离得到小于lOKDa的蛋白液经真空干燥获得的。
3. 权利要求1所述制剂，用于培养鸡骨骼肌成肌细胞，提高鸡骨骼肌成肌细胞的分化 能力。
4. 权利要求1所述制剂，其特征在于，所述丙酮酸盐和钙盐可同时为丙酮酸钙。
5. 权利要求4所述制剂，其特征在于，所述肌源成纤维细胞提取物与丙酮酸钙单独包 装。
6. -种利用权利要求4所述制剂培养鸡骨骼肌成肌细胞的方法，其特征在于，将肌源 成纤维细胞与丙酮酸钙混合后，添加到成肌分化培养基中使用。
7. 权利要求6所述方法，其特征在于，所述肌源成纤维细胞提取物与丙酮酸钙混合，肌 源成纤维细胞提取物与丙酮酸钙的质量比为10-120:1。
8. 权利要求6所述方法，其特征在于，所述添加到成肌分化培养基中使用，肌源成纤维 提取物的终浓度为600-2400mg/L，丙酮酸钙的终浓度为5-80mg/L。
9. 权利要求8所述方法，其特征在于，所述肌源成纤维提取物的终浓度为2400mg/L，所 述丙酮酸钙的终浓度为20mg/L。
【文档编号】C12N5/077GK104152406SQ201410400520
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】张宇, 李海, 刘忠华, 连正兴 申请人:东北农业大学