一种体外培养骨骼肌表达体系的制作方法

专利名称：一种体外培养骨骼肌表达体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及一种体外培养的骨骼肌表达体系的建立。
背景技术：
随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达体系可用于生产具有研究或医疗价值的人或动物来源的蛋白质。虽然原核表达体系、酵母表达体系、以及昆虫表达体系表达量高，但由于其产品缺乏有效的加工修饰使其在药物生产中的应用受到极大限制。因此，目前已经投放市场，以及正在进行临床实验的治疗用蛋白质生物类药物，大多数来自哺乳动物细胞表达体系。
虽然哺乳动物表达体系所表达的蛋白在质量和安全性上具有竞争力，但是和酵母、细菌和昆虫体系相比其产量较低而成本较高。
哺乳动物表达体系的表达载体调控机理的研究中，人们可通过选择不同载体、不同增强子和启动子来获得外源基因的高表达，从而构建新的真核表达载体。另一方面，Cottet和Corthesy(Sreekrishna K，Webster T D，Dickson RC.Transformation of Kluyveromy ces L actis.with the Kanamycin(G418)resistance gene of Tr903.Gene，1984；2873～81)发现单纯增加蛋白的表达量并不足以导致重组蛋白的产量增加，因为利用哺乳动物表达体系多是引导蛋白分泌到培养基内，细胞用于蛋白的成熟和分泌的组分是影响其产量的瓶颈。因此增加重组蛋白的产量，不能仅仅依靠通过改善载体等手段，鉴别和清除细胞产生和分泌蛋白的瓶颈问题至关重要。因此表达体系的宿主细胞问题是制约目前哺乳动物细胞表达体系发展的根本问题，筛选优于以上细胞的新宿主类型应成为该领域重点解决的关键问题。
QM7属于骨骼肌细胞系，是从鹌鹑纤维肉瘤细胞QT6分离出来(Chen XJ，Saliola M，Falcone C et al.Sequence organization of the circular Plasmic p KD1from the yeast Kluyveromyces droxophilarum.Nucleic Acids Res，1986(14)4471～4481)。骨骼肌细胞的特性之一是在血清含量高的培养基中，细胞分裂、增殖；在低血清含量的培养基中，细胞退出细胞周期融合形成肌管。QM7虽非哺乳动物细胞，但和其非常相似。QM7有发达的类似于内质网的肌浆网，并且能分泌大量糖基化细胞外基质，说明它有完善的蛋白修饰加工体系。在进行细胞培养时，QM7细胞在10％血清的培养基中增殖旺盛，在0.5％血清的培养基中，细胞融合形成粗大的肌管。肌管仍可继续合成外源蛋白，而且转染阳性的细胞和阴性细胞融合后，可以利用后者的细胞器合成蛋白，这一特性也是其作为表达体系的优势之一。虽然QM7细胞在含0.5％血清的培养基内能分化形成肌管并存活较长时间，但这样浓度的血清仍可对后续纯化和未来的药物开发产生影响，合适的无血清培养基的筛选至关重要。

发明内容
本发明要解决的技术问题旨在克服上述已有技术的不足，提供了一种体外培养的骨骼肌细胞进行重组蛋白生产的配套体系，更进一步地，提供了以QM7为宿主细胞进行重组蛋白生产的配套体系，包括构建利于重组蛋白表达和检测的真核表达载体；筛选有效引导重组蛋白分泌的信号序列，增大了目的蛋白的分泌量；筛选有利于QM7细胞分化及重组蛋白纯化的无血清分化培养基，这种无血清培养基造价低并且利于后期纯化工作；利用构建的真核表达载体表达两种已知可以相互结合的蛋白，验证QM7表达体系用于Pull-Down检测的可行性；利用表达体系表达具有应用价值的重组蛋白PEX，为PEX作为重组蛋白药物进行大规模生产奠定了前期基础。
本发明采用的技术方案是
一种体外培养骨骼肌表达体系，包括含目的基因的表达载体的构建、表达载体转染宿主细胞群及筛选、目的基因在宿主细胞中的表达和表达产物的分离纯化、表达产物的活性检测等步骤，其特征在于所述的表达载体是在pcDNA3.0基础上，构建的带有myc10检测标签及6×his纯化标签的表达载体；且在所述的表达载体中插入人基质金属蛋白酶9(MMP-9)信号序列(见序列1)。
进一步地，本发明涉及的真核表达载体用以表达基质金属蛋白酶MMP-2C-末端片段PEX蛋白或人胰岛素样生长因子I(IGF-I)。
进一步地，本发明涉及的宿主细胞是QM7细胞。
进一步地，本发明涉及的宿主细胞的培养基采用含3μg/ml insulin的M199无血清分化培养基。
进一步地，本发明涉及的真核表达载体用以表达小鼠P53蛋白和SV40大T抗原，并用于检测表达蛋白间的相互作用。
本发明的与已有技术相比具有以下积极效果在表达载体中插入了myc检测标签及6×his纯化标签，利于目的蛋白的纯化及检测；在上述表达载体中插入了基质金属蛋白酶9(MMP-9)信号序列，增大了蛋白的分泌量；采用了QM7细胞作为宿主细胞表达蛋白，蛋白的表达量约为COS7的1.5-2.5倍；筛选出适合QM7细胞分化的无血清分化培养基，即含3μg/ml insulin的M199培养基，这种无血清培养基造价低并且利于后期纯化工作；MMP9的信号序列可以引导SV40大T抗原和小鼠p53蛋白成功分泌至细胞培养液中，并且这两种蛋白具备生物活性，二者可以相互作用结合，验证了QM7表达体系用于Pull-Down检测的可行性。
另外，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的C末端片段PEX是粘附分子αvβ3的拮抗活性片段，具有抑制血管发生、拮抗肿瘤的效应(Clare J J，Romanos M A，Rayment F B et al.Production of mouse epidermal growth factor I yeasthigh2level secretion using Pichia Pastoris strains containing multiple gene copies.Gene，1991，105205～212；Tschopp J F，Sverlow G Kosson R et al.High2 levelsecretion of glycosylated invertase in the methy2 lotrophic yeast，Pichia Pastoris.Biotechnology，1987(5)1305～1308)，抑制肿瘤的血管发生被认为是药物治疗肿瘤的有效、最佳合理手段，因此PEX有可能成为具有潜在应用前景的内源性抗肿瘤药物。本文所涉及的体外培养骨骼肌表达体系为PEX作为重组蛋白药物进行大规模生产奠定了前期基础。


图1表示本发明涉及的一种体外培养骨骼肌表达体系中构建的pM9/PEX/hismyc载体的一级结构及其所表达肽链一级结构的示意图。
图2表示本发明体外培养骨骼肌表达体系中不同信号肽对于促进PEX蛋白分泌效果的SDS-PAGE电泳图；图3表示本发明体外培养骨骼肌表达体系中不同信号肽对于促进IGF-I蛋白分泌效果的SDS-PAGE电泳图。
图4表示本发明体外培养骨骼肌表达体系用于Pull-Down检测的SDS-PAGE电泳图。
图5表示本发明体外培养骨骼肌表达体系用于Pull-Down检测的Western印迹图。
具体实施例方式
所用材料分子克隆所用的各种DNA限制性内切酶，Taq酶为New England Biolab产品；T4DNA连接酶购自Promega公司。HRP酶标羊抗兔IgG购自Jackson公司。ECL发光试剂盒购自Pharmacia公司。
实施例1和实施效果例1～4将说明本发明所涉及的体外培养骨骼肌表达体系的具体实施方式
。
实施例1一、载体的构建1.prGH/PEX/hismyc表达载体构建pIg/PEX/hismyc和prGH/PEX/hismyc是在pcDNA3.0基础上构建的鸡PEX的表达载体。PEX的C末端XhoI位点处融合有myc10肽抗原标签和6×his纯化标签的编码序列，N端HindIII和BamHI位点之间分别插入小鼠免疫球蛋白Ig轻链和大鼠生长激素(rGH)的信号序列。
用RT-PCR分别从大鼠脑垂体和十一日龄鸡胚胎扩增大鼠生长激素(rGH)信号肽序列和鸡MMP-2 C末端片段PEX序列。大鼠生长激素引物正义5’-GGCAAGCTT(Hind III)ACAGATCACTGAGTGG-3’、反义5’-AGAGGATCCT(BamH I)GGACAAGGGCATG-3’；鸡MMP-2C-末端PEX引物正义5’-CGGATCC(BamHI)TCTGCAAGCACG-3’，反义5’-CCTCTAGA(Xba I)GCAAGTCCTCTTCAGAAATCAGTTTT TG CTC GAG(Xho I)GCAACCCAACCAGTC。大鼠生长激素信号肽与PEX的PCR产物以约等分子比混合作为模板，以rGH的正义引物和PEX的反义引物PCR扩增使rGH信号肽与PEX相连接，再以该产物为模板用rGH的正义引物和引物5’-CTGGGCCC(Apa I)TAATGATGATGAT G ATGATGTCTAGA(Xba I)CAAGTCCTCTTCAG-3’在融合蛋白的C-端PCR加上myc抗原标签和6Xhis纯化标签的编码序列，Hind III与Apa I酶切后，T4DNA聚合酶连接装入相应酶切的真核表达载体pcDNA3.0(美国Invitrogen公司)。转化大肠杆菌DH5α，取酶解鉴定正确的克隆测序确认，用Tip-500(Qiagen公司)大量提取和纯化质粒备用。
2.pIg/PEX/hismyc表达载体构建Igκ链的分泌信号肽的合成其上游引物为5’GGG AAG CTT CAC ACACAC ACA CAT GAG CGT GCC GAC ACA GGT CCT GGG TTT GCT GCTGCT ATG GC 3’(含有HindIII位点)；下游引物为5’GAG GAT CCG GAT ATCACATCT CGC ATC TGTAAG CCATAG CAG CAG c 3’(含有BamHI位点)。上游引物与下游引物经退火粘链成双链简称Ig。Ig经HindIII和BamH I酶切后，与被同样酶切的prGH/PEX/hismyc相连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，得到pIg/PEX/hismyc重组体。
3、pM9/PEX/hismyc表达载体的构建及鉴定人基质金属蛋白酶9(MMP9)的信号序列为57bp(见序列1)，载体pcDNA3.0/MMP9中CMV启动子处有NdeI位点。上游引物设计于NdeI位点上游5’CGC CAATAG GGA CTT TCC 3’；下游引物在MMP9的信号序列3’端引入BamHI位点5’CCG GAT CCT GGG GGC AGC AAA GCA GC 3’。PCR产物经NdeI和BamH I酶切后，与被同样酶切的pIg/PEX/hismyc用T4DNA连接酶相连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，得到pM9/PEX/hismyc重组体。酶切鉴定并测序。该载体的构建包括以下步骤3.1 PCR以MMP9-pcDNA3.0为模板，进行PCR

PCR反应在热循环仪中进行，95℃预变性5min，循环反应程序为94℃变性1min，55℃退火1min；72℃延伸1min，30cycles，循环反应结束后，72℃，10min充分延伸，4℃保存。电泳观察结果3.2内切酶消化及目的片段的回收由于MMP9引物设计时在两端引入NdeI和BamH I酶切位点，故可以用NdeI和BamH I酶切MMP9PCR产物及载体pIg/PEX/hismyc，并通过酶切后产生的粘端将目的片段克隆到载体当中。
1)内切酶消化下列体系在37℃，消化3-4h

2)酶切后载体及目的片段的回收1％ agarose制备胶分离插入片段新鲜配制1％ agarose胶，将上述酶切产物同时上样，75V电泳50分钟，在紫外下切取含目的带的凝胶。
用Glassmilk回收凝胶中的DNA片段切下的凝胶称重后，按1g≈1ml计算，加入3倍体积的碘化钠试剂55℃溶解凝胶，加入5-10μl玻璃奶置室温15分钟，间歇2-3分钟混匀一次。离心10000转，2分钟，弃上清，用300-500μl洗脱缓冲液洗涤沉淀3次，最后一次弃上清后，再离心2分钟，尽量吸干上清。加15μl dd-H2O洗脱，55℃水浴15分钟，离心，保留上清。再次洗脱沉淀，两次洗脱液混合，取3μl电泳鉴定。
3.3目的片段与载体pIg/PEX/hismyc的连接上述酶切后纯化的MMP9DNA片段(BamH I/NdeI)和pIg/PEX/hismyc(BamH I/NdeI)用T4DNA连接酶进行连接。

室温3h，或14-16℃连接过夜即可进行转化。
3.4大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(inoue method)1)取-70℃冻存的细菌用接种环接种于琼脂平皿上，37℃，倒置培养16-20h；2)从平皿中挑取多克隆菌落，至250ml SOB中，225rpm，18℃，培养至细菌密度OD600＝0.6；3)冰浴10min，离心(4℃，2500×g，10min)，弃上清，沉淀用80ml预冷的TB轻轻悬浮，冰浴10min；4)离心(4℃，2500×g，10min)，沉淀用20ml预冷的TB轻轻悬浮，加入DMSO使其终浓度为7％，冰浴10min；5)每支100μl分装，-70℃冻存备用。
3.5细菌的转化1)新鲜制备或取出冻存的感受态菌，每100μl感受态菌加50-100ng质粒DNA，冰浴30分钟。
2)42℃热休克1分钟，立即插入冰中。
3)加入500μl SOC，37℃，225rpm培养0.5小时。
4)取适量铺盘，倒置培养于37℃，12-16h3.6质粒DNA的提取及纯化
1)小量质粒提取(碱裂解法)挑一单菌落置于5ml LB(AMP+)中；→37℃，225rpm，过夜培养后，收集菌体，离心(6000rpm，4℃，3min)；→弃上清，沉淀加入Solution A 100μl充分混匀，室温3-5min；→Solution B 200μl，缓慢颠倒混匀，室温3-5min(SolutionB，现配现用)；→加入Solution C 150μl，颠倒混匀，冰浴5min；离心(16,000rpm，4℃，5min)；→吸上层水相于另一Eppendorf管中，加2.0倍体积无水乙醇，混匀；→离心(16,000rpm，4℃，5min)；→弃上清，加入预冷70％乙醇1ml，离心(16,000rpm，4℃，1min)，吸弃上清，室温挥发至干，加适量TE/Rnase(10μg/ml)20-50μl，-20℃保存。
2)PEG法纯化质粒DNA质粒用于转染前应用PEG法进行纯化，以除去超螺旋结构，提高转染效率。纯化方法质粒DNA沉淀(250ml菌液)用400μl TE溶解；→加等体积(400μl)13％PEG+0.8mol/LNaCl，混匀，冰上放置20min；→离心(16,000rpm，4℃，15min)；→沉淀用70％乙醇洗，离心(16,000rpm，4℃，1min)；→吸弃上清，风干，沉淀用400μl TE溶解，并用1％agarose电泳鉴定。
3.7 PEX表达载体pM9/PEX/hismyc的鉴定把连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于LB(含氨苄青霉素)1.5％琼脂的盘上，37℃，倒置培养过夜。少量制备所挑选克隆的质粒.对重组的质粒进行HindIII与XbaI的双酶切鉴定，37℃ 2hrs酶切后样品行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察各克隆释放出0.6kb DNA片段，说明pcDNA3.0插入了600bp的外源基因，经测序证明插入序列正确，MMP9信号序列与PEX的读码框架一致。


pM9/PEX/hismyc载体的一级结构及其所表达肽链一级结构的示意图见图1。
二、真核细胞转染采用常规转染方法均可，优选采用以下转染真核细胞的方法采用脂质体lipofectamine(GIBCO/BRL)，2μg质粒与10μl脂质体在1ml无血清培养基中混合形成DNA/脂质体复合物，然后加入到接种有3×105QM7(来源于美国ATCC)细胞的35mm培养皿中。37℃ CO2孵箱中孵育3-5小时后换含有血清的完全培养基。
三、筛选为得到稳定转染的克隆，转染后48小时将细胞以105/10cm培养皿的密度接种，在含有400μg/ml G418的培养基中筛选阳性克隆。2-3周后收集所有的阳性克隆形成POOL，得到稳定表达PEX蛋白的细胞系。
四、目的蛋白的纯化由于所构建的载体带有His标签，可以用Ni-NTA方便的进行PEX蛋白纯化。纯化方法如下pM9/PEX/hismyc转染后的稳定表达PEX蛋白的QM7细胞3×105密度接种到35mm培养皿中，细胞汇片后，换含3μg/ml insulin的M199(Gibco公司)无血清分化培养基1.5ml培养细胞；每天收集上清，换新鲜分化培养基，连续两天共收集上清3ml，离心去除细胞。上清中加入Ni-NTAagrose(Qiagen公司)50μl室温振荡2h后离心弃上清，沉淀用洗液洗三遍后加入150mM咪唑洗脱液100μl振荡1min，离心吸取上清做SDS-PAGE分析，结果显示26KD处有目的片段。3ml上清中纯化量约为3μg。
五、目的蛋白的检测由于所构建的载体带有myc10肽抗原标签，可以用Western印迹方便的进行PEX蛋白检测。蛋白检测方法如下取上述PEX纯化产物3μl，进行Western印迹以确认纯化产物为目的蛋白。方法同前。可检测到约26KD的阳性条带，与理论推导的PEX分泌蛋白的分子量吻合。
六、目的蛋白PEX的生物活性测定将购买的新鲜种蛋在40℃的0.1％新洁尔灭溶液中浸泡3-5分钟，消毒后用净纱布擦干蛋壳表面溶液，置于37.5℃、60-70％湿度孵化(每天翻动3次，勿使蛋壳附着水)。孵化3天后将鸡蛋去壳，鸡胚移至平皿中继续培养.去壳时用75％酒精消毒切口及手指，气室端为上，牙科钻在种蛋上、中1/3处切割蛋壳，形成2-3CM的切口，双手拇指伸入切口处轻轻打开种蛋壳及壳膜，使鸡胚落入平皿中，保证卵黄膜向上，勿伤及白色壳膜，以免造成卵黄膜破坏导致鸡胚死亡。继续培养第5天加药(取玻璃纤维滤纸，用打孔器打d＝2mm d＝3mmd＝5mm d＝8mm不同规格的圆片，高压灭菌，加在尿囊膜血管分枝处，每片滴加纯化后的浓度为30ng/μl PEX蛋白溶液5μl；对照组加1×PBS 5μl。24h后重复给药1次，48小时后观察并照相。
给药第48小时后，揭开滤纸片，于解剖显微镜下(10倍)观察结果并照相记录。对照组血管生长正常；实验组血管生长受阻，表现为血管阻断。这表明，在体内150ng纯化的PEX蛋白具有明显的抑制血管生成的作用，证实QM7可以对重组蛋白进行比较完善的修饰，表达的蛋白具有生物活性。
实施效果例实施效果例1、MMP-9信号序列促进目的蛋白的分泌量1.1表达载体的构建1.1.1 pIGF-I/hismyc表达载体的构建以人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor I，IGF-I)的cDNA为模板，上游引物5’GGAAGC TTATGG GAAAAA TCA GCA G 3’(含有HindIII位点)；下游引物为5’CGC TCG AGA GCT GAC TTG GCA GGC 3’(含有XhoI位点)。将扩增的PCR产物以HindIII和XhoI酶切，将酶切产物(约350bp)与被同样酶切的prGH/PEX/hismyc相连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，得到pIGF-I/hismyc重组体。
pIGF-I/hismyc被HindIII和Xho I酶切，样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察各克隆释放出350bp的片段，说明pcDNA3.0插入了350bp的外源基因，经测序证明插入序列正确。
1..1.2 prGH/IGF-I/hismyc、pIg/IGF-I/hismyc、pM9/IGF-I/hismyc表达载体的构建以pIGF-I/hismyc为模板，上游引物5’CGG GAT CCT CGG ACC GGAGAC GCT CTG 3’(含有BamHI位点)；下游引物为5’CGC TCG AGA GCTGAC TTG GCA GGC 3’(含有XhoI位点)。将扩增的PCR产物以BamHI和XhoI酶切，将酶切产物(约210bp)分别与被同样酶切的prGH/PEX/hismyc、pIg/PEX/hismyc、pM9/PEX/hismyc相连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，得到prGH/IGF-I/hismyc、pIg/IGF-I/hismyc、pM9/IGF-I/hismyc重组体。
prGH/IGF-I/hismyc、pIg/IGF-I/hismyc、pM9/IGF-I/hismyc被BamHI和Xho I酶切后，样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察各克隆释放出210bp片段，说明pcDNA3.0插入了210bp的外源基因，经测序证明插入序列正确。
1.1.3IGF-I前肽表达载体pIGF-Ipre/hismyc的构建以IGF-I的cDNA为模板，上游引物5’GGAAGC TTA TGG GAA AAA TCAGCA G 3’(含有HindIII位点)；下游引物为5’GCC TCG AGC ATC CTG TAGTTC TTG TTT CC 3’(含有XhoI位点)。将扩增的PCR产物以HindIII和XhoI酶切，将酶切产物(约460bp)与被同样酶切的pIg/PEX/hismyc相连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，得到pIGF-Ipre/hismyc重组体，插入片段编码48个氨基酸的信号肽和70个氨基酸的成熟肽及35个氨基酸的E-DOMAIN。
pIGF-Ipre/hismyc被HindIII和Xho I酶切，样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察各克隆释放出约460bp的片段，说明pcDNA3.0插入了460bp的外源基因，经测序证明插入序列正确。
1.1.4prGH/IGF-Ipre/hismyc、pIg/IGF-Ipre/hismyc、pM9/IGF-Ipre/hismyc表达载体的构建以pIGF-I/hismyc为模板，上游引物5’CGG GAT CCT CGG ACC GGA GACGCT CTG 3’(含有BamHI位点)；下游引物为5’GCC TCG AGC ATC CTG TAGTTC TTG TTT CC 3’(含有XhoI位点)。将扩增的PCR产物以BamHI和XhoI酶切，将酶切产物(约315bp)分别与被同样酶切的prGH/PEX/hismyc、pIg/PEX/hismyc、pM9/PEX/hismyc相连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，得到prGH/IGF-Ipre/hismyc、pIg/IGF-Ipre/hismyc、pM9/IGF-Ipre/hismyc重组体。
prGH/IGF-Ipre/hismyc、pIg/IGF-Ipre/hismyc和pM9/IGF-Ipre/hismyc被BamHI和Xho I酶切，样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察各克隆均释放出315bp片段，说明pcDNA3.0插入了315bp的外源基因，经测序证明插入序列正确。
1.2 RT-PCR半定量细胞内目的基因mRNA表达水平1.2.1瞬时转染QM7细胞内PEX mRNA表达水平PEX的表达载体prGH/PEX/hismyc、pIg/PEX/hismyc和pM9/PEX/hismyc瞬时转染QM7细胞后6h，提取细胞总RNA，以逆转录的cDNA为模板，反应体系中同时加入PEX和GAPDH的引物进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，在近500bp和600bp处均出现特异条带，分别与GAPDH和PEX的分子量大小相符。PCR产物纯度较高，无明显非特异条带。运用AlphaImagerTM2200凝胶成像系统控制的AlphaEaseTM独立软件包照相、进行密度扫描半定量比较PEX片段和内对照GAPDH产物的含量。结果显示三种载体转染后6h QM7细胞中PEX和GAPDH光密度的比值没有差异，说明带有不同信号序列的PEX的表达载体瞬时转染后PEX的mRNA水平没有差别。
1.2.2瞬时转染后QM7细胞内IGF-I的mRNA表达水平IGF-I的表达载体pIGF-I/hismyc、prGH/IGF-I/hismyc、pIg/IGF-I/hismyc和pM9/IGF-I/hismyc瞬时转染QM7细胞后6h，提取细胞总RNA，以逆转录的cDNA为模板，反应体系中同时加入IGF-I和GAPDH的引物进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，在近500bp和200bp处均出现特异条带，分别与与GAPDH和IGF-I的分子量大小相符。PCR产物纯度较高，无明显非特异条带。运用AlphaImagerTM2200凝胶成像系统控制的AlphaEaseTM独立软件包照相、进行密度扫描半定量比较对IGF-I片段和内对照和GAPDH产物的含量。结果显示三种载体转染后6h QM7细胞中IGF-I和GAPDH光密度的比值没有差异，说明不同载体瞬时转染后IGF-I的mRNA水平没有差别。
1.2.3瞬时转染后QM7细胞内IGF-Ipre的mRNA表达水平IGF-Ipre的表达载体pIGF-Ipre/hismyc、prGH/IGF-Ipre/hismyc、pIg/IGF-Ipre/hismyc和pM9/IGF-Ipre/hismyc瞬时转染QM7细胞后6h，提取细胞总RNA，以逆转录的cDNA为模板，反应体系中同时加入IGF-Ipre和GAPDH的引物进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，在近500bp和300bp处均出现特异条带，分别与与GAPDH和IGF-Ipre的分子量大小相符。PCR产物纯度较高，无明显非特异条带。运用AlphaImagerTM2200凝胶成像系统控制的AlphaEaseTM独立软件包照相、进行密度扫描半定量比较对IGF-Ipre片段和内对照和GAPDH产物的含量。结果显示三种载体转染后6h QM7细胞中IGF-Ipre和GAPDH光密度的比值没有差异，说明不同载体瞬时转染后IGF-Ipre的mRNA水平没有差别。
1.3测定蛋白含量1.3.1细胞培养上清中PEX蛋白的检测PEX的表达载体prGH/PEX/hismyc、pIg/PEX/hismyc和pM9/PEX/hismyc及载体pcDNA3.0瞬时转染QM7细胞后48h，取细胞培养基5μl SDS-PAGE电泳后，用PEX抗体进行Westem杂交分析，结果如图2所示(图中显示载体条带1，pM9/PEX；条带2，pIg/PEX；条带3，prGH/PEX；条带4，pcDNA3.0)，三种PEX载体转染后的细胞培养基中均可检测到约26KD的阳性条带，与理论推导的PEX分泌蛋白的分子量吻合，空载体转染的培养基内未检测到条带。其中以pM9/PEX/hismyc的条带信号最强，提示三种信号肽均可有效引导PEX蛋白分泌，MMP9的信号肽引导蛋白分泌的效率最高。
1.3.2细胞培养上清中IGF-I蛋白的检测人IGF-I的四种表达载体pIGF-I/hismyc、prGH/IGF-I/hismyc、pIg/IGF-I/hismyc和pM9/IGF-I/hismyc及载体pcDNA3.0瞬时转染QM7细胞后48h，取细胞培养基5μl用myc抗体进行Westem杂交分析，结果如图3所示(图中显示载体条带1，pcDNA3.0；条带2，prGH/IGF-I/hismyc；条带3，pIg/IGF-I/hismyc；条带4，pM9/IGF-I/hismyc；条带5，pIGF-I/hismyc)，IGF-I载体转染后的细胞培养基中均可检测到约7.7KD的阳性条带，与理论值一致。空载体转染的培养基内未检测到条带。其中以pM9/IGF-I/hismyc的条带信号最强，prGH/IGF-I/hismyc的条带信号其次，提示四种信号肽均可有效引导IGF-I蛋白分泌，MMP9的信号肽引导蛋白分泌的效率最高。
1.3.3细胞培养上清中IGF-Ipre蛋白的检测取人IGF-I前肽的四种载体pIGF-Ipre/hismyc、prGH/IGF-Ipre/hismyc、pIg/IGF-Ipre/hismyc和pM9/IGF-Ipre/hismyc及载体pcDNA3.0瞬时转染QM7细胞后48h的细胞培养基5μl用myc抗体进行Western杂交分析，结果显示IGF-Ipre载体转染后的细胞培养基中均可检测到约14.9KD左右有阳性条带，与预测的分子量一致。其中也以pM9/IGF-Ipre/hismyc的条带信号最强。空载体转染的培养基内未检测到条带。
综上所述，首先用融合有以上不同信号序列的PEX表达载体瞬时转染QM7细胞，比较三种信号序列的分泌效率，筛选最佳引导外源蛋白分泌的信号序列。Western杂交分析表明，三种信号肽均成功引导PEX蛋白分泌到细胞上清中，以融合有MMP-9信号肽的载体信号最强。为了验证信号序列引导其它外源蛋白分泌的通用性，以IGF-I和IGF-I前肽和不同信号序列的表达载体转染QM7细胞，Westem杂交检测它们引导IGF-I和IGF-I前肽的分泌效率，结果与PEX相同。由于转染后6h，RT-PCR检测细胞内外源基因的mRNA水平，结果显示融合不同信号序列的载体mRNA水平没有差异，提示上清中重组蛋白含量的差异确实是分泌效率不同所引起的，并不是表达量的不同所引起。以上结果显示三种信号肽均可成功引导不同的外源蛋白分泌，其中MMP-9的信号肽引导外源蛋白分泌效率最高。
实施效果例2、QM7表达体系的优越性2.1瞬时转染后QM7与COS7表达体系的比较2.1.1两种细胞培养上清中蛋白含量的比较pM9/PEX/hismyc、pM9/IGF-I/hismyc和pM9/IGF-Ipre/hismyc载体瞬时转染COS7和QM7细胞后48h，取培养上清进行ELISA蛋白定量，结果表明，QM7上清中三种蛋白的含量分别为PEX，2.4mg/L；IGF-I，4.3mg/L；IGF-I前肽3.7mg/L。COS7上清中三种蛋白的含量分别为PEX，1.6mg/L；IGF-I，2.6mg/L；IGF-I前肽2.2mg/L。QM7上清中蛋白产量大约为COS7的1.5倍。
2.2.2两种细胞裂解液中蛋白含量的比较pM9/PEX/hismyc、pM9/IGF-I/hismyc和pM9/IGF-Ipre/hismyc载体瞬时转染COS7和QM7细胞后48h，取细胞裂解液进行ELISA蛋白定量，结果表明，QM7细胞裂解液中三种蛋白的含量分别为PEX，0.9mg/L；IGF-I，1.4mg/L；IGF-I前肽1.3mg/L。COS7上清中三种蛋白的含量分别为PEX，1.95mg/L；IGF-I，2.4mg/L；IGF-I前肽2.0mg/L。COS7细胞裂解液中蛋白含量均高于COS7。
2.2稳定表达PEX的QM7与COS7细胞系的比较2.2.1Western印迹检测目的蛋白pM9/PEX/hismyc载体瞬时转染后的QM7与COS7细胞用G418筛选得到稳定表达PEX的细胞系，细胞汇片换培养基后48h，取细胞培养基5μlSDS-PAGE电泳后，用PEX抗体进行Western杂交分析，两种细胞培养基中均可检测到约26KD的阳性条带，与理论推导的PEX分泌蛋白的分子量吻合。QM7的PEX含量明显高于COS7。
2.2.2ELISA检测PEX含量pM9/PEX/hismyc载体瞬时转染后的QM7与COS7细胞用G418筛选得到到阳性克隆的细胞POOL，细胞汇片换培养基后48h，采用ELISA检测细胞培养基中PEX蛋白的含量。QM7细胞上清蛋白含量约3.6mg/L；COS7细胞上清蛋白含量约1.6mg/L。
综上所述，COS7细胞中蛋白表达量高于QM7而蛋白分泌量低于QM7，可能是因为存在蛋白分泌的瓶颈问题。清除这个瓶颈问题的关键在于新宿主细胞类型的筛选。通过和COS7表达体系的比较发现，QM7引导蛋白分泌的效率高于COS7，提示QM7细胞内用于蛋白成熟和分泌的组分优于COS7。
实施效果例3、QM7细胞分化培养条件的优化本文配制了含胰岛素3μg、5μg/ml的M199培养基、含0.5％血清的M199传统分化培养基和用于CHO细胞培养的CHO-S-SFM II无血清培养基。从形态学和生化学两方面比较它们对QM7分化的影响。Giemsa染色结果表明，含胰岛素3μg、5μg/ml的M199培养基和含0.5％血清的M199培养基均可以促进细胞分化融合形成肌管，在时相和分化程度上没有显著差别。肌酸激酶CK是肌细胞特有的酶，随分化程度增高活性增强，检测结果表明CK活性和形态学指标变化一致。进一步证实含胰岛素的M199培养基可以促进细胞分化。含3μg/ml insulin的培养基促细胞分化程度和含5μg/ml insulin的培养基没有明显差别，因此可以选用含3μg/ml insulin的无血清分化培养基培养细胞，从而使后续纯化工作简单易行，同时又防止了外源蛋白的污染，为细胞作为表达体系提供了优化的培养体系。
实施效果例4、QM7表达体系可用于Pull-Down检测蛋白间相互作用的检测对于研究蛋白功能非常重要，而这有赖于蛋白的结构和生物活性。为了验证QM7表达体系用于Pull-Down检测的可行性，我们以编码SV40大T抗原和小鼠p53蛋白的载体转染QM7细胞，利用Pull-Down技术检测细胞上清中二者的结合情况。
材料和方法1.载体构建1.1p53-his-pcDNA3的构建以酵母双杂交的质粒pVA3(Matchmaker yeast two-hybrid system，Clontech)为模板，上游引物为5’CGGGATCC(BamH I)CTGTCACCGAGACCCC 3’；下游引物为5’CGTCTAGA(XbaI)GTCTGAGTCAGGCCCC 3’进行PCR扩增，得到的PCR产物编码小鼠p53蛋白(a.a.72-390)。PCR产物以BamH I和XbaI酶切，与同样酶切的pM9/PEX/hismyc载体连接，得到p53/his/pcDNA3，编码C末端融合6xHis的小鼠p53蛋白。
1.2T-myc-pcDNA3的构建以酵母双杂交的质粒pTD 1(Matchmaker yeast two-hybrid system，Clontech)为模板，上游引物为5’CGGGATCC(BamH I)GTGGAACTGATGAATGGGAGC 3’；下游引物为5’GGCTCGAG(XhoI)TGTTTCAGGTTCAGGGGGAG3’，进行PCR扩增，得到的PCR产物编码SV40大T抗原(a.a.86-708)。PCR产物以BamH I和XhoI酶切，与同样酶切的pM9/PEX/hismyc载体连接，得到T/hismyc/pcDNA3。再以T/hismyc/pcDNA3为模板，利用大T抗原的上游引物和引物5’GCGGGCCC(ApaI)TATCTAGA(XbaI)CAAGTCCTCTTCAG3，，进行PCR扩增的产物以BamH I和ApaI酶切，与同样酶切的pM9/PEX/hismyc载体连接，得到T/myc/pcDNA3，编码C末端融合myc的SV40大T抗原。
2.Pull-Down检测p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3分别转染和共转染QM7细胞，基因转染采用脂质体lipofectamine(GIBCO/BRL)。转染后48h收集细胞上清，离心15000r，4oC，10min去除细胞沉淀，取1ml上清中加入Ni-NTA agrose(QIAGEN)20ul室温振荡2h后离心弃上清，沉淀用洗液洗三遍后加入咪唑洗脱液40ul振荡1min，离心吸取上清做SDS-PAGE分析及Western印迹。一抗为抗myc的兔抗血清(11000稀释)，室温孵育1hr，II抗(HRP-Goat&rabit1∶40000稀释)，室温孵育1h。TTBS洗膜后，加入ECL化学发光试剂(Pharmacia公司)，曝光，冲片。
结果1.SDS-PAGE检测SDS-PAGE结果表明p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3共转染QM7的细胞上清与Ni-NTA agrose孵育后，洗脱液中有35KD和70KD左右的两种分子量的蛋白，分别与p53和大T抗原的分子量相符；p53/his/pcDNA3转染QM7的细胞上清与Ni-NTA agrose孵育后，洗脱液中有只有35KD分子量的蛋白，与p53分子量相符；T/myc/pcDNA3转染QM7的细胞上清与Ni-NTA agrose孵育后，洗脱液中没有这两种分子量的蛋白。结果如图4所示(图中显示载体条带1，T/myc/pcDNA3；条带2，p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3；条带3，p53/his/pcDNA3)。
2.Western印迹分析Western印迹结果表明p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3共转染QM7的细胞上清与Ni-NTA agrose孵育后的洗脱液中可检测到分子量约70KD的蛋白，与预期的大T抗原的分子量相符；p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3分别转染QM7的细胞上清与Ni-NTA agrose孵育后，其洗脱液中均未见阳性蛋白条带。结果如图5所示(图中显示载体条带1，T/myc/pcDNA3；条带2，p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3；条带3，p53/his/pcDNA3)。
综上所述，已知SV40大T抗原可以和小鼠p53蛋白结合(Li，B.and S.Fields.1993.Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40large T antigen by using the yeast twohybrid system.FASEB J.7957-963.)，本实验构建的质粒使p53蛋白C端融合6xHis，大T抗原C端融合myc标签。由于p53蛋白C端融合6xHis因此可以与Ni-NTA agrose结合从而作为bait蛋白，大T抗原为prey蛋白。SDS-PAGE结果表明p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3共转染QM7的细胞上清与Ni-NTA agrose孵育后，洗脱液中有35KD和70KD左右的两种分子量的蛋白，分别与p53和大T抗原的分子量相符；Western印迹结果表明在70KD处有阳性条带。以上结果证实以QM7作为宿主细胞时，MMP9的信号序列可以引导SV40大T抗原和小鼠p53蛋白成功分泌至细胞培养液中，并且其具备生物活性，二者可以相互作用结合，验证了QM7表达体系用于Pull-Down检测的可行性。
序列表<110>北京市肿瘤防治研究所<120>一种体外培养骨骼肌表达体系<130>ZBC1F050229<160>1<210>1<211>57<212>DNA<213>人<400>1atgagcctct ggcagcccct ggtcctggtg ctcctggtgc tgggctgctg ctttgct5权利要求
1.一种体外培养骨骼肌表达体系，主要包括含目的基因的表达载体的构建、表达载体转染宿主细胞群及筛选、目的基因在宿主细胞中的表达和表达产物的分离纯化、表达产物的活性检测的步骤，其特征在于所述的表达载体是在pcDNA3.0基础上，构建的带有myc10检测标签及6×his纯化标签的表达载体；且在所述的表达载体中插入人基质金属蛋白酶9(MMP-9)信号序列(见序列1)。
2.根据权利要求1所述的一种体外培养骨骼肌表达体系，其特征在于在表达PEX的载体的N端的HindIII和BamH I位点之间插入所述的信号序列，在C末端XhoI位点处融合有myc10肽抗原标签和6×his纯化标签的编码序列。
3.根据权利要求1所述的一种体外培养骨骼肌表达体系，其特征在于所述的真核表达载体用以表达基质金属蛋白酶-2(MMP-2)C末端片段PEX基因重组蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种体外培养骨骼肌表达体系，其特征在于所述的真核表达载体用以表达人胰岛素样生长因子I(IGF-I)。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的一种体外培养骨骼肌表达体系，其特征在于所述的宿主细胞是QM7细胞。
6.根据权利要求5所述的一种体外培养骨骼肌表达体系，其特征在于在转染宿主细胞及纯化目的蛋白时，使用含3～5μg/ml insulin的无血清分化培养基培养宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的一种体外培养骨骼肌表达体系，其特征在于所述的无血清分化培基是M199培养基。
8.根据权利要求6所述的一种体外培养骨骼肌表达体系，其特征在于在转染宿主细胞及纯化目的蛋白时，使用含3μg/ml insulin的无血清M199分化培养基培养宿主细胞。
9.根据权利要求5所述的一种体外培养骨骼肌表达体系，其特征在于所述的表达体系用于外分泌表达二种蛋白以检测相互间的作用。
全文摘要
本发明涉及了一种体外培养骨骼肌表达体系，包括含目的基因的表达载体的构建、表达载体转染宿主细胞群及筛选、目的基因在宿主细胞中的表达和表达产物的分离纯化等步骤，其特征在于所述的表达载体是在pcDNA3.0基础上，构建的带有myc10检测标签及6×his纯化标签的表达载体；且在所述的表达载体中插入人基质金属蛋白酶9(MMP－9)信号序列。本发明在表达载体中插入了基质金属蛋白酶9(MMP－9)信号序列，增大了蛋白的分泌量；采用了QM7细胞作为宿主细胞表达蛋白，增大了蛋白的表达量；筛选出适合QM7细胞分化的无血清分化培养基，培养基造价低并且利于后期纯化工作，且为PEX作为重组蛋白药物进行大规模生产奠定了前期基础。
文档编号C12N15/65GK1724677SQ20051008435
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月19日 优先权日2005年7月19日
发明者张志谦, 宋琳 申请人:北京市肿瘤防治研究所