专利名称：一种人梭曼水解酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和酶学领域中一种人梭曼水解酶。
背景技术：
磷酸三酯酶(PTE3.1.8)是一种可水解有机磷化学战剂的酶，由于它们的化学性质和序列不同，因而这些酶被国际生化和分子生物学组织(IUBMB)分成为对氧磷酶(Pon)(EC3.1.8.1)和二异丙基氟磷酸酶(DFPase，DFP酶)(EC3.1.8.2)，后者又进一步被分为Mazur型DFPase(40-90KDa)和鱿鱼型DFPase(35-40KDa)。
梭曼水解酶属于A酯酶，国际酶学会将之归入二异丙基氟磷酸(DFP)酶类(E.C3.1.1)，它可催化DFP、梭曼(一种国际上公认的难防难治的神经性毒剂)、沙林等含P-F键的G类有机磷毒剂。故又称G类有机磷毒剂水解酶(简称G酶)。G类有机磷毒剂是强烈的速杀性化学战剂，能不可逆地抑制体内胆碱酯酶的活性，并阻断假性胆碱酯酶、及真性胆碱酯酶等B类酯酶而引起中毒。有机磷化合物水解酶对有机磷化合物污染的净化及消毒、G类有机磷杀虫剂和神经性毒剂中毒的防护方面的潜在用途已引起人们的很大关注。
具有水解梭曼活性的酶包括Pseudomonas diminuta的磷酸三酯酶PTE(EC3.1.8)，Alteromonas的脯氨肽酶，及鱿鱼神经系统、肝胰脏及头足纲唾液腺线中的鱿鱼型DFPase(EC3.1.8.2)。近来一种Sencscence Marker蛋白-30从小鼠、大鼠及人体中分离出来，这三种蛋白序列具有高同源性，并且都具有水解梭曼的活性。Hoskin等从鱿鱼中纯化了二异丙基氟磷酸酶(Hoskin，F.G.C.，andLong，R.J..Purification of aDFP-hydrolyzing enzyme from squid head ganglion.Arch.Biochem.Biophys.1972，150.548-555)，另有几种细菌、小鼠、大鼠和人(Qingding Wang，Manji Sun，HanZhang，and Cuifen Huang，Purification and properties of Soman-HydrolyzingEnzyme from human liver.J biochemmolecular toxicology，1998，12(4)213-217)的DFPase被纯化。但国内外文献中未见到有关人源的DFPase的序列的报道。
目前，在蛋白质的分析中常采用的方法有凝胶内酶切，肽质量指纹图谱，基体辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)等。
凝胶内酶切的灵敏度高(Hoskin F.C.G.，Rosenberg P.，and Brzin M.Re-examination of the effect of DFP on electrical and cholinesterase activityof squid giant axon.Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1966，551231-1234)，是当前广泛采用的的样品制备方法。最常用的蛋白酶切是胰蛋白酶，它在蛋白质主链上精氨酸和赖氨酸残基的C端进行切割。
肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting，PMF)最初由Henzel及其同事提出(Hoskin F.C.G.Diisopropylfluorophosphate and Tabun..Enzymatichydrolysis and nerve function.Science，1971，1721243-1245)，肽质量指纹谱是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后所得全部肽段的质量图谱。分析时用基体辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定凝胶内酶切后多肽混合物的质量，获得肽质量指纹图谱。蛋白质酶切后多肽混合物的质量，可以在蛋白质序列数据库内进行理论预测，并对质谱实测多肽混合物的质量与理论预测的数据相比较，质谱实测到足够肽段的质量与数据库中某个蛋白质理论预测肽段的质量匹配时，可明确鉴定为同一蛋白质，并获得高分。这一方法中用质谱分析的是蛋白质被酶切后的多肽混合物，而不是分析蛋白质本身。电泳后凝胶上的蛋白质很难从凝胶上洗脱下来进行质谱分析，而且仅用蛋白质的分子量在数据库中检索鉴别是很不充分的。与之相反，多肽容易从凝胶上洗脱下来，相同质量蛋白质被酶切后生成的一组多肽的质量，能提供足够的信息在数据库检索鉴定。
基体辅助激光解析电离飞行时间质谱MALDI-TOF-MS适合分析绝大多数蛋白质，它具有灵敏度高，分辨率好、质量准确、高通量、谱峰简单等特点，是测定肽质量指纹谱十分有效的质谱仪，常规分析时多肽的灵敏度可达femtomol、attomol或更低。数据库检索时，实测蛋白质的酶切肽段与蛋白质数据库中所有蛋白的理论酶切肽段相比较，当与某个蛋白质的理论酶切肽段匹配达一定程度时，则被鉴定为该蛋白。
蛋白质的两步质谱快速鉴定中，MALDI-TOF-MS的PMF法是第一步。因为PMF法有它不足的地方，如数据库中可用的蛋白质序列数据不足时不能明确鉴定，小的酸性蛋白质酶切后不能产生足够的肽段时也不能明确鉴定，分离后凝胶上的一个斑点由于共分离作用含多个蛋白质时也不能鉴定。
电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)进行多肽的部分序列信息分析具有更高的专属性，它利用氨基酸的序列信息来查询数据库，一般两个肽段的MS/MS数据就可确定一个蛋白质，理论上一个9肽以上的肽段的MS/MS数据如检索不出结果，则很有可能为新蛋白。纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF比常用的三极四极串联质谱具有更高的分辩率和质量准确度，质量范围和线性范围宽，适合与HPLC联用而实现真正的蛋白质鉴定。可进行自动化串联质谱分析以获得准确性很高的肽段序列(HoskinF.C.G.and Long R.J.Purification of a DFP--hydrolyzing enzyme from squid headganglion.Arch.Biochem.Biophys.1972，150548-555)，从而保证数据库检索鉴定的准确性。
发明内容
本发明的目的是提供一种人梭曼水解酶。
本发明所提供的人梭曼水解酶，来源于人，分子量在35-37KD之间，具有序列表中的序列1的N-末端氨基酸序列；其氨基酸组成中包括30个L残基，27个K残基，24个G残基，各21个E、V和A残基，18个I残基，各15个D、S、R、T、P和F残基，12个Y残基，9个H残基，6个M残基以及3个C残基。
序列表中的序列1是由15个氨基酸残基组成的多肽，N-末端的第一个氨基酸为S，其中氨基酸残基F、P、L和M为疏水性氨基酸，N末端亲水性氨基酸较多(9/15)，疏水性氨基酸较少(6/15)。
梭曼水解酶的氨基酸组成中亲水性氨基酸较多，约156分子，疏水性氨基酸较少约126分子，所以梭曼水解酶属于亲水性蛋白质，这与它的催化功能是一致的；其中碱性氨基酸约有51个，酸性氨基酸约有36个，所以它属于偏碱性的蛋白质，等电点在pH 7.0-9.5之间。
所述人梭曼水解酶含有具有序列表中序列2、序列3和序列4的氨基酸残基序列的3个肽段肽段1、肽段2和肽段3。肽段1由13个氨基酸残基组成，亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的比例基本相同；肽段2由16个氨基酸残基组成，肽段3由17个氨基酸残基组成，肽段2、3中亲水性氨基酸较多，疏水性氨基酸较少。
位于肽段2的DKDGDGYLSAAELR序列(即序列3中的自氨基端第3位-16位氨基酸残基)是钙结合位点。
位于肽段2的DKDGDGY序列(即序列3中的自氨基端第3位-9位氨基酸残基)是酪氨酸激酶磷酸化位点。
位于肽段3的GTLTTK序列(即序列4中的自氨基端第12位-17位氨基酸残基)是酰基化位点，这一位点与其催化功能紧密相关。
位于肽段3的FSLFDKDGDG序列(即序列4中的自氨基端第3位-12位氨基酸残基)为上述人梭曼水解酶的活性中心部位。
编码上述人梭曼水解酶的DNA序列也属于本发明的保护范围。
本发明从人肝中分离纯化了梭曼水解酶，并获得了人梭曼水解酶的由15个氨基酸残基组成的N-末端氨基酸序列，含有钙结合位点和酪氨酸激酶磷酸化位点的16肽，含有酰基化位点及活性中心部位的17肽，以及一个13肽。本发明对于研究G类有机磷水解酶的结构和性质、体内代谢及毒理学，以及最终用于人体农药中毒和化学战剂中毒的防护均具有非常重要的理论和实际意义。
图1a为经过30KD的中空纤维超率后的人肝组织上清液的梭曼水解酶活性曲线图1b为经过150KD的中空纤维超率后的人肝组织上清液的梭曼水解酶活性曲线图2为人肝组织上清液的大于30KD小于150KD的超滤液的Sephadex G-50柱层析的洗脱峰的梭曼水解酶酶活性测定曲线图3为Sephadex G-50所得活性部分的Sephadex G-75柱层析的洗脱峰的梭曼水解酶酶活性测定曲线图4为Sephadex G-75所得活性部分的DEAE-Sepharose CL-6B线性梯度柱层析洗脱峰的梭曼水解酶酶活性测定曲线图5为DEAE-Sepharose CL-6B所得活性部分的Sephacryl-200HR柱层析洗脱峰的梭曼水解酶酶活性测定曲线图6为纯化的人梭曼水解酶的SDS-PAGE图谱图7a-7b为人梭曼水解酶的N-端氨基酸序列检测8为梭曼水解酶的氨基酸组成分析9a-图9b为图16的肽质量指纹谱的Mascot Search结果图10a为ESI-MS/MS图谱图10b为M/Z 793的带双电荷的肽段1的ESI-MS/MS图谱图10c为M/Z 878的带双电荷的肽段2的ESI-MS/MS图谱图10d为M/Z 923的带双电荷的肽段3的ESI-MS/MS图谱图11为用Clustal W软件比较钙调蛋白和人梭曼水解酶的氨基酸序列结果图12为人梭曼水解酶肽段序列与Prosite蛋白质序列库中的已知位点序列进行相似性检索结果图13为CLUSTAL W软件分析不同种属具有相同梭曼水解酶活性的进化树图14为通过BLAST服务器进行人梭曼水解酶与鱿鱼型的DFP酶的序列相似性比较结果图15a为计算机模拟的鱿鱼型的DFP酶肽段IELFGPDGGQ的空间结构图15b为计算机模拟的人梭曼水解酶肽段FSLFDKDGDG的空间结构图16为梭曼水解酶的MALDI-TOF-MS分析所得的肽质量指纹谱具体实施方式
实施例1、人梭曼水解酶的分离及纯化材料
DEAE-Sepharose CL 6B，Sephacryl S-200HR为Pharmacia公司产品；Sephadex G-50，Sephadex G-75为sigma公司产品；中空纤维柱(30KDa，150Kda北京旭成超滤设备厂)；Ultradex为Pharmacia公司产品；两性电解质(该两性电解质的具体组成成分为Ampholyes)为军事医学科学院产品。
器材微型紫外记录仪，日本ATTO公司产品；UV-250分光光度计为日本岛津公司产品；高速及超速冷冻离心机，日立公司产品。
1.人肝细胞可溶性提取液的制备取交通事故死亡后人的肝组织，-75℃保存，使用前去除大的血管组织及纤维组织，取约60g，剪碎，按1∶9(w/v)加入67mM磷酸钠钾缓冲液(PB，pH 7.2)，在组织匀浆机中匀浆1分钟×5次后，4℃，1600g离心20min，所得上清液再于超速冷冻离心机中，4℃，200000g离心1h，弃沉淀，上清保存于冰水中备用。
2.将人肝组织上清液进行低分子量(30KD)及高分子量(150KD)中空纤维超滤流速L/h，分别收集超滤后的两部分，进行活性追踪。(反应总体积为3ml，37℃恒温恒速搅拌，200ul酶样品预先加入反应缓冲液中，加18mlM Co2+溶液100ul，加入100ul梭曼至终浓度为1.6×10-2M。观察记录15分钟)。结果如图1a和图1b所示，表明大于30KD，小于150KD的部分是活性带。其中，大于30KD的部分与未加酶样品的空白对照相比P＜0.05X±SD，n＝3；小于于150KD的部分与未加酶样品的空白对照相比P＜0.05X±SD，n＝3。将活性部分保存于冰水中进行制备型平板等电聚焦。
3.制备型平板等电聚焦(1)取人肝组织上清液超滤后大于30KD小于150KD的活性部分(共含蛋白约2000mg)，4g Ultrodex加入95ml水及样品液+5ml载体两性电解质。
(2)称重后制板，根据Ultrodex瓶上标明的蒸发线吹胶至一定重量后，开始聚焦。
(3)聚焦条件8000V，3mA；阳极液磷酸1mol/L；阴极液氢氧化钠1mol/L。
(4)取胶将胶板固定在聚焦平板上，固定好后按不同梯度逐条刮取到洗脱小柱中，用67mM磷酸钠钾缓冲液(PBS，pH 7.2)洗脱后每一梯度逐一量取pH值，以确定其pH范围，用以设定相应的非酶对照(67mM磷酸钠钾缓冲液(PBS，pH 7.2)按各洗脱液的pH范围加0.1M氢氧化钠液调pH值，不加酶洗脱液，设为非酶对照)。
结果如表1所示，表明在pH7.0-9.5间聚焦的酶有催化活性，pH3.5-7.0间聚焦的酶没有催化活性。
表1.超滤后活性部分的制备型平板等电聚焦活性(请将表中的英文译为中文)
4、SephadexG-50，SephadexG-75，DEAE-Sepharose CL 6B，Sephacryl-200层析分离(1)Sephadex G-50柱层析分离将人肝组织上清液超滤所得的大于30KD小于150KD的超滤液上预先以67mM的磷酸钠钾缓冲液(pH 7.2)平衡的Sephadex G-50柱(2.5×120cm，柱床体积约300ml)。每次上样20ml，以平衡缓冲液洗脱，280nm检测，流速2.5ml/min，用部分收集器收集洗脱液，每管7ml，结果得到两个洗脱峰，其中第一个洗脱峰在500Min，第二洗脱峰在1200Min。对两个洗脱峰进行梭曼水解酶活性测定，结果如图2所示，表明梭曼水解酶活性集中在第一洗脱峰(70ml)中。活性部分又经超滤浓缩，保存于冰水中备用。
(2)Sephadex G-75柱层析分离将Sephadex G-50所得活性部分上预先以67mM的磷酸钠钾缓冲液(pH 7.2)平衡的Sephadex G-75柱。(1.5×100cm，柱床体积约150ml)，每次上样15ml，以平衡缓冲液洗脱，280nm检测，流速1.4ml/min，用部分收集器收集洗脱液，每管7ml，结果得到三个洗脱峰，其中第一个洗脱峰在500min，第二洗脱峰在800min，第三洗脱峰在1200min。对三个洗脱峰进行梭曼水解酶活性测定，结果如图3所示，表明梭曼水解酶活性集中在第二洗脱峰(35ml)中。活性部分经超滤浓缩，保存于冰水中备用。
(3)DEAE-Sepharose CL-6B线性梯度柱层析分离DEAE-Sepharose CL-6B(2.5×20cm，柱床体积约50ml)事先用67mMPB(pH7.2)平衡。将浓缩后的上述(2)中的第2峰活性组分上柱，每次上样5ml，用含有NaCl(0-1.5mol/L)的67mM PB(pH 7.2)进行线性梯度洗脱，流速0.5ml/min，用部分收集器收集洗脱组分，每管1ml，结果得到三个洗脱峰，其中第一个洗脱峰在100min，第二洗脱峰在200min，第三洗脱峰在400min。对三个洗脱峰进行梭曼水解酶活性测定，结果如图4所示，表明梭曼水解酶活性集中在第二洗脱峰(5ml)中。将活性组分经超滤浓缩后保存于冰水中备用。
(4)Sephacryl-200HR柱层析分离Sephacryl-200HR(1.6×120cm，柱床体积约190ml)先用67mM PB(pH 7.2)平衡，将浓缩后的上述(3)中的第2峰活性组分上柱，每次上样5ml，用67mM PB(pH7.2)洗脱，流速为0.3mL/min，用部分收集器收集洗脱组分，每管收集3ml，结果得到二个洗脱峰，其中第一个洗脱峰在400min，第二洗脱峰在1000min。对二个洗脱峰进行梭曼水解酶活性测定，结果如图5所示，表明梭曼水解酶活性集中在第一洗脱峰(10ml)中。将活性组分超滤浓缩后保存。
人肝中的梭曼水解酶是低丰度蛋白，所以分离纯化非常困难，由于人肝中的梭曼水解酶主要存在于细胞的可溶性部分，所以本实施例首先采用超速离心法提取人肝溶浆中的可溶性部分，以便去除大量存在于亚细胞结构中的许多种蛋白质，从而减少了后续纯化工作中的困难；同时考虑到过多的步骤有可能对酶活性的影响，所以将超速离心后的上清液直接上柱。但由于样品体积较大使得纯化工作量增大。随后选择用超滤结合活性追踪的方法将不具活性的小分子物质和大分子物质除去，又采用制备型平板等电聚焦的方法从等电点的角度进行大规模制备，这两种方法的优点是制备量大，并且分别从分子量和等电点水平去除了大量不具活性的蛋白，初步的大规模制备保证了以后在繁杂的制备步骤中有足够量的蛋白舍弃。通过上述两种方法初步制备后的样品再经凝胶过滤后，进一步对分子量不同的蛋白进行筛选，使活性提高了10倍；对蛋白再一次根据电荷不同进行DEAE-Sepharose梯度洗脱，经活性追踪证明三个峰中的第二个峰是活性峰，使活性提高了24.6倍；酶比活性达135nmol/min/mg，此步纯化后经SDS-PAGE和毛细管电泳证明活性峰含两种蛋白。再经S-200凝胶将其分离，特异催化活性达1070nmol/min/mg，纯化212.7倍(表2)。
在分离过程中发现，人肝中的梭曼水解酶性质较为稳定，4℃时等电聚焦20小时催化活性不变，而且在长达几天的分离纯化、浓缩过程中，催化活性仍较稳定。
表2.人梭曼水解酶的纯化结果
实施例2、人梭曼水解酶的生化性质试剂DEAE-Sepharose CL 6B，Sephacryl-200HR为Pharmacia公司产品；SephadexG-50，Sephadex G-75为sigma公司产品。
器材Beckman 121 MB型氨基酸自动分析仪(Beckman公司产品)，微型紫外记录仪(日本ATTO公司产品)；UV-250分光光度计(日本岛津公司产品)；高速及超速冷冻离心机(日立公司产品)；毛细管电泳仪MALDI-TOF-MS；ESI-MS/MS Reflex III加速电压为20kV，反射式正离子检测方式，(Bruker公司产品)；ESI-MS/MS的正交加速电喷雾串联质谱仪Q-TOF2(英国Micromass公司)。
1.SDS-PAGE采用5-15％聚丙烯酰胺梯度胶做垂直板电泳，电极缓冲液为Tris-甘氨酸-SDS(pH8.9)系统。每孔上样2ug。标准分子量Marker分别为溶菌酶(14.4KD)、碳酸酐酶(31KD)、卵清蛋白(43KD)、牛血清白蛋白(67KD)及碱性磷酸酶b(97.4KD)。样品与等量样品缓冲液混合，加二硫苏糖醇(DTT)使成20mM终浓度。沸水浴中煮沸5分钟，冷却后上样。电泳完毕后，用10％TCA固定，0.1考马斯亮兰染色液染色。结果如图6所示，表明纯化的人梭曼水解酶为一条带，分子量在35-37KD之间。图中，泳道1为纯化的人梭曼水解酶，泳道2为标准分子量Marker。
HPCE IEF分析结果表明出纯化的人梭曼水解酶(第一峰)已为纯品。
2.N-末端氨基酸序列分析先将纯化的人梭曼水解酶溶液对10mM的PB(PH 7.2)透析以降低盐浓度，经SDS-PAGE电泳后，电印迹转印PVDF膜，用蛋白质序列分析仪测定N-端氨基酸序列。结果如图7a和图7b所示，共测定了15个氨基酸残基，其序列如序列表中的序列1所示，N-末端的第一个氨基酸为S，其中氨基酸残基F、P、L和M为疏水性氨基酸，N末端亲水性氨基酸较多(9/15)，疏水性氨基酸较少(6/15)。经蛋白质氨基酸序列数据库检索与已知蛋白质的序列无同源性。
3.人梭曼水解酶的氨基酸组成将约含有100ug的酶样品溶液对水透析后冻干，加0.4ml 57mol/L HCl溶解，移到水解管中，抽成真空并封口，110℃水解24小时。取出后冷却，抽干HCl，加0.2ml柠檬酸缓冲液(pH 2.0)，溶解后用Beckman 121 MB型氨基酸自动分析仪分析氨基酸组成成份。结果如表3和图8所示，表明共测出17种氨基酸，梭曼水解酶中亲水性氨基酸较多，约156分子，疏水性氨基酸较少约126分子，所以梭曼水解酶属于亲水性蛋白质。这与它的催化功能是一致的；其中碱性氨基酸约有51个。酸性氨基酸约有36个，所以它属于偏碱性的蛋白质，这一结果也可从实施例1的等电聚焦结果(表1)得到证实，具有活性的酶在负极聚焦，等电点在pH 7.0-9.5之间。
表3.人梭曼水解酶的氨基酸组成
注N、Q及W不能测出4.人梭曼水解酶的胶内酶切、数据库查寻及部分肽片序列(1)人梭曼水解酶的胶内酶切脱色将SDS-PAGE中分子量为36KD的蛋白带切下并切成小块，水洗三次，用含50％乙腈的25ml碳酸氢铵溶液浸泡胶片，振荡10min，弃去溶液，重复1-3遍至胶片中的蓝色褪尽。
酶切真空离心将胶片干燥，加入5-10μl胰蛋白酶(0.01μg/μl溶解在25mmol/L碳酸氢铵溶液中(pH8.9)，4℃冰箱中放置15-30min，待酶液完全被吸收，37℃保温反应12小时以上。
肽提取加5％TFA50-100ul，于37℃保温1小时，吸出上清液冰冻干燥。
MALDI-TOF-MS的肽质量指纹谱分析及数据库检索用5％TFA溶液3-6μl溶解样品，以CHCA为基质用MALDI-TOF-MS分析，MALDI-TOF-MS为Bruker公司的Reflex III，加速电压为20kV。反射式正离子检测方式。检测结果如图16所示，图16是经上述方法提取的肽经MALDI-TOF-MS分析所得的肽质量指纹图谱。
数据库检索将MALDI-TOF-MS分析所得的肽质量指纹谱通过Mascot搜索引擎查询数据库Swissprot和NCBI进行分析，结果如图9a和图9b所示，表明所提供的两次肽指纹图谱分别得分为56分和52分，而Mascot Search有意义的结果分别应为65分(图9a)和72分(图9b)，所以可初步确定为未知蛋白。用MALDI-TOF-MS肽质量指纹谱鉴定蛋白质的成功率为50％，用此方法得到鉴定结果时，需要选用专属性更高的ESI-MS/MS方法进行鉴定。
(2)纳升电喷雾串联质谱的ESI-MS/MS序列分析及数据库检索溶解后的样品(纯化后的梭曼水解酶)用Millipore的C18从Ziptip脱盐后进行序列分析，首先做一个一级MS谱(图10a)，选择强度较高的M/Z 793、878、923的带双电荷的肽段进行MS/MS分析，经Maxent 3处理后又借助Masseq软件分析，获得的谱图及序列分析结果如图10b、图10c和图10d所示，得到分别具有序列表中序列2、3和4的氨基酸残基序列的3个肽段肽段1、肽段2和肽段3。图中峰793为分离得到的肽段1，峰878为分离到得的肽段2，峰923为分离得到的肽段3。肽段1由13个氨基酸残基组成，亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的比例基本相同；肽段2由16个氨基酸残基组成，肽段3由17个氨基酸残基组成，肽段2、3中亲水性氨基酸较多，疏水性氨基酸较少。
将上述三序列通过Mascot查询SWISSPROT和NCBInr数据库，均未得到有意义的结果，表明测试样品为新蛋白质。
本实施例对纯化的人梭曼水解酶采用SDS-PAGE检测，结果表明酶的分子量为36KD；氨基酸组份分析结果表明人肝中梭曼水解酶是一个碱性氨基酸组份较多的蛋白质；N-末端氨基酸序列分析结果发现它与蛋白库中的蛋白无同源性，氨基酸分析表明组成它的亲水性氨基酸较多9/15，是亲水性肽段；选用胰蛋白酶进行凝胶内酶切，获得的肽指纹图谱重复性较好，获得的肽指纹图谱信息在数据库检索没有得到有意义的结果，推测可能为未知蛋白；选用电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)与HPLC联用共获得了准确性很高的三个肽段序列，肽段1、2、3结果表明肽段1亲水性氨基酸和疏水性氨基酸比例大致相同，肽段2、3亲水性氨基酸较多，疏水性氨基酸较少。对上述三序列通过Mascot查询SWISSPROT和NCBInr数据库，查询结果表明测试样品为未知蛋白，这种查询方式的功能最为强大，质谱数据库中查不出有意义的结果，则表明测试样品为新蛋白质。
本实施例通过N-末端氨基酸序列分析、肽质量指纹图谱及电喷雾电离串联质谱3种测试手段均证明本发明分离纯化的人梭曼水解酶是一个新的蛋白质。
实施例3、人梭曼水解酶的活性位点预测及计算机检索将人梭曼水解酶酶解后得到的肽段N端肽段SFCDLKSPHGLQMLN；肽段1LDQLHWVSLAEFK；肽段2VFDKDGDGDGYLSAAELR；肽段3EAFSLFDKDGDGTLTTK进行以下分析。
1.BLAST服务器(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)通过BLAST服务器将人梭曼水解酶序列与蛋白质序列库中的已知序列进行序列相似性检索，结果表明人梭曼水解酶的一级结构与钙调蛋白有一定相似性。将得分最高的钙调蛋白序列与人梭曼水解酶的一级结构用Clustal W软件进行多序列比较，结果如图11所示，表明人梭曼水解酶的一级结构与钙调蛋白有一定相似性，而且C端残基保守性明显高于N端，这一结果提示肽段2、3位于接近C端处，而且酶活性中心可能在靠近C端处。
2.SWISS-PROT Prosite服务器通过Prosite服务器分别将人梭曼水解酶肽段序列与Prosite蛋白质序列库中的已知位点序列进行相似性检索，结果如图12所示，表明梭曼水解酶的肽段序列中共有三个特异位点，分别是钙结合位点(位于肽段2的DKDGDGYLSAAELR序列，即序列3中的自氨基端第3位-16位氨基酸残基)、磷酸化位点(位于肽段2的DKDGDGY序列，即序列3中的自氨基端第3位-9位氨基酸残基)及酰基化位点(位于肽段3的GTLTTK序列，即序列4中的自氨基端第12位-17位氨基酸残基)，它们都位于肽段2及3上，说明肽段2及3可能是人梭曼水解酶的活性片段。图12中，大写字母是相似的位点，小写字母是非相似位点。
3.用Clustal W软件对来源于不同种属具有相同梭曼水解酶活性的酶进行多序列比较，结果表明梭曼水解酶与鱿鱼型的DFP酶之间具有很高的序列相似性(图13)，而且C端的保守性明显高于N端。
4.通过BLAST服务器进行人梭曼水解酶与鱿鱼型的DFP酶的序列相似性比较通过BLAST服务器进行人梭曼水解酶与鱿鱼型的DFP酶的序列相似性比较，结果如图14所示，表明人梭曼水解酶序列与鱿鱼的DFP酶的序列具有很高的相似性，C端的保守性明显高于N端，其中肽段2、3DGDG序列是高度保守的，这一保守序列在图12的检索结果中为钙结合位点，据文献报道鱿鱼的DFP酶具有两个钙结合位点，第一个是低亲和力位点，与Glu21、Asn120、Asn175、Asp229结合，另一个是高亲和力位点，与Asp232、Leu273、His274结合，所以推测与鱿鱼型DFP酶220-240间的DGDGDGYLSAAE保守序列的相对应人梭曼水解酶序列是钙结合位点，而KDGDGDGY在图12的检索结果中为磷酸化位点。这也说明肽段2、3可能是含活性中心的肽段。
5.分别对两个可能含活性中心的肽段2、3与鱿鱼型DFPase配比率较高的部分结构进行计算机模拟，鱿鱼型的DFP酶肽段IELFGPDGGQ的空间结构如图15a所示，人梭曼水解酶肽段FSLFDKDGDG的空间结构如图15b所示，它们的计算机模拟参数比较结果如表4所示，表明人梭曼水解酶可能含活性中心的肽段序列与鱿鱼型的DFP酶的三维结构具有一定的相似性，模拟参数相似，说明人梭曼水解酶肽段FSLFDKDGDG可能是人梭曼水解酶的活性中心部位。
表4.鱿鱼型的DFP酶肽段IELFGPDGGQ与人梭曼水解酶肽段FSLFDKDGDG计算机模拟参数比较
本实施例将人梭曼水解酶序列与蛋白质序列库中的已知序列进行序列相似性检索，结果表明人梭曼水解酶的一级结构与钙调蛋白有一定相似性。但纯化的人梭曼水解酶的分子量(36KD)与钙调蛋白的分子量(15KD)相差较大，两者不是一种蛋白，推测可能是编码人梭曼水解酶的部分基因与钙调蛋白是共同的。
纯化的人梭曼水解酶经过与不同种属具有相同梭曼水解酶活性的酶进行多序列比较，结果表明梭曼水解酶与鱿鱼型的DFP酶之间具有很高的序列相似性，与其它种的具有相同梭曼水解酶活性酶的序列相似性较小。
纯化的人梭曼水解酶经过Swiss-Protsite位点检索结果表明位于第二肽段的DGDGDGYLSAAELR序列是钙结合位点，这段序列与鱿鱼型的DFP酶的序列也是保守的，位于第二肽段的DGDGDGDGY序列是酪氨酸激酶磷酸化位点，这段序列与鱿鱼型的DFP酶的序列也是保守的。位于第三肽段GTLTTK的序列是酰基化位点，这一位点与其催化功能紧密相关。
纯化的人梭曼水解酶与已知的鱿鱼型的DFP酶部分保守序列的空间结构相比较，结果表明两者的钙结合位点序列与酪氨酸激酶磷酸化位点无论一级结构还是空间结构相似性很高，各项力学参数也表明两者的伸展度、转角、非范得华力及总能量一致，说明这段保守结构从结构、稳定性、疏水特性等性质方面非常相似，结构保守性也表明这段序列具有共同的功能。
从系统进化树结果看，梭曼水解酶与鱿鱼型的DFP酶之间具有很高的序列相似性。
序列表<160>4<210>1<211>15<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>1Ser Phe Cys Asp Leu Lys Ser Pro His Gly Leu Gln Met Leu Asn1 5 10 15<210>2<211>13<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>2Leu Asp Gln Leu His Trp Val Ser Leu Ala Glu Phe Lys1 5 10<210>3<211>16<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>3Val Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ala Ala Glu Leu Arg1 5 10 15<210>4
<211>17<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>4Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Leu Thr Thr1 5 10 15Lys
权利要求
1.一种人梭曼水解酶，分子量在35-37KD之间，具有序列表中的序列1的N-末端氨基酸序列；其氨基酸组成中包括30个L残基，27个K残基，24个G残基，各21个E、V和A残基，18个I残基，各15个D、S、R、T、P和F残基，12个Y残基，9个H残基，6个M残基以及3个C残基。
2.根据权利要求1所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述人梭曼水解酶还含有具有序列表中序列2、3和4的氨基酸残基序列的3个肽段。
3.根据权利要求1或2所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述人梭曼水解酶的等电点在pH 7.0-9.5之间。
4.根据权利要求2所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述序列3中的自氨基端第3位-16位氨基酸残基为钙结合位点。
5.根据权利要求2所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述序列3中的自氨基端第3位-9位氨基酸残基序列为酪氨酸激酶磷酸化位点。
6.根据权利要求2所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述序列4中的自氨基端第12位-17位氨基酸残基为酰基化位点。
7.根据权利要求2所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述序列4中的自氨基端第3位-12位氨基酸残基为所述人梭曼水解酶的活性中心部位。
8.编码权利要求1-7所述人梭曼水解酶的DNA序列。
全文摘要
本发明公开了一种人梭曼水解酶。本发明所提供的人梭曼水解酶，分子量在35－37KD之间，具有序列表中的序列1的N－末端氨基酸序列，其氨基酸组成中包括30个L残基，27个K残基，24个G残基，各21个E、V和A残基，18个I残基，各15个D、S、R、T、P和F残基，12个Y残基，9个H残基，6个M残基以及3个C残基。该人梭曼水解酶还含有分别具有序列表中序列2、3和4的氨基酸残基序列的3个肽段。本发明对于研究G类有机磷水解酶的结构和性质、体内代谢及毒理学，以及最终用于人体农药中毒和化学战剂中毒的防护均具有非常重要的理论和实际意义。
文档编号C12N15/55GK1900275SQ200510084249
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月18日 优先权日2005年7月18日
发明者刘敏, 孙曼霁 申请人:中国人民解放军防化指挥工程学院