专利名称：：拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因(亦称降解基因)，属于应用环境微生物领域，用于农作物及土壤中菊酯类杀虫剂残留的去除，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复菊酯污染的水体等环境。
背景技术：
：农药的使用虽然提高了农业的生产效率及作物产量，但同时带来严重的环境问题，造成生态失衡农产品品质下降，并直接影响人民的身体健康。拟除虫菊酯杀虫剂是1974年M.Eliiott等人发现的一种高效广谱杀虫剂，目前，拟除虫菊酯类杀虫剂的年销售额为13-14亿美元，占世界农药销售额的20%，随着世界各国对高毒的有机磷、有机氯杀虫剂的限制使用，拟除虫菊酯的使用量将进一步增加。虽然菊酯类杀虫剂属于低毒类杀虫剂，但是它能损害人和动物中枢神经系统、具有致癌作用，尤其对蜜蜂、鱼类等具有强烈的毒害作用。随着近些年来环境保护的呼声越来越高，农药使用带来的环境问题日益引起人们的重视。有机农业、绿色农业的兴起就是在这种背景下发生的。但就目前的形势而言，人类仍面临饥饿、贫穷的困扰，全面实行有机农业、绿色农业生产，禁止农药的使用是不现实的。为了达到高产高效的目标，农药的地位在短期内是无法取代的。为了既能充分发挥农药高效保护效果，又能够解决农药残留，国内外进行了多方面的研究，提出了化学方法、物理方法、生物学方法等多种解决途径。在这些方法中生物学方法具有无毒、无残留、无二次污染的优势。微生物在农药残留的生物学解决途径中有着独特的作用。利用从微生物中提取的降解酶系来消除农药残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。将农药残留降解基因通过基因工程技术转移到作物中构建转基因作物，可以从根本上防止农药在作物体内积累，消除农药残留的危害。国外已有转抗除草剂基因水稻的报道，菊酯降解基因在该领域有巨大的应用潜力。
发明内容技术问题本发明的目的是提供拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因(亦称降解基因)，用于农作物及土壤中菊酯类杀虫剂残留的去除，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复菊酯污染的水体等环境。技术方案菊酯类杀虫剂水解酶基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.l。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为843bp，G+C含量为66.55%,编码280个氨基酸，其氨基酸序列为SEQIDN0.2。菊酯类杀虫剂水解酶基因片段与酶切好的PET-29a(+)进行酶连获得含菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重组质粒。酶连好的含菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组微生物BL21(DE3)。上述菊酯类杀虫剂水解酶基因可以在农作物、农产品、土壤、水体的菊酯残留去除方面得到应用。其所涉及的菊酯水解酶可以在农作物、农产品、土壤、水体的菊酯残留去除方面应用。有益效果1.用鸟枪法成功的从JQ1-11(5^/"gomo"ossp.JQl-ll，其GenBank注册号为DQ132883)中克隆出菊酯降解酶基因。2.该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为843bp，G+C含量为66.55%，编码280个氨基酸。3.通过PCR技术扩增末端含和J力ot酶切位点的完整的菊酯水解酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高表达载体PET-29a(+)(购自Novegen公司)的A^el和J力ol酶切位点上，转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达。4.本发明对菊酯水解酶基因表达的产物，做了酶活性测定，能高效的降解甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯。对100ppm上述的各类菊酯降解效果均大于93%。5.利用该基因构建的工程菌株能高效表达菊酯水解酶(活性水解酶蛋白的含量占细胞总蛋白含量的35%)，生产的酶制剂可用于土壤、蔬菜、茶叶、水果、中草药、烟草等的农药残留去除，及农产品深加工中降解农药残留，提高产品品质及增加附加值，它比其它的降解方法更加高效、经济、安全。并可进一步用于构建转基因作物彻底解决植株中农药残留问题，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复菊酯污染的水体等环境。图1菊酯水解酶基因克隆的策略图图2菊酯水解酶基因的DNA序列图3推测的菊酯水解酶氨基酸序列图4菊酯水解酶基因在BL21(PET-29a(+))中高效表达实验方案图具体实施方式1.菊酯水解酶基因的克隆1.15^w'/^a!o朋ssp.JQ1-11(GenBank注册号为DQ132883)总DNA的提取采用CTAB法提取高纯度、大分子量的JQ1-11总DNA，溶于TE(PH8.0)中，置于_20。C保藏，具体方法参考F，奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。1.2PUC118(SaMII)购买于宝生物工程(大连)有限公司。1.3总DNA的酶切5^i/^o膨朋ssp.JQ1-11总DNA采用Sa"3AI部分酶切。1.4DNA的回收酶切后的总DNA通过电泳(TAE缓冲液)进行纯化，采用axygenbiosciences(China)回收试剂盒进行回收，回收的DNA溶于10mmol/L的TrisCI(PH8.0)中，置于-20。C保藏。1.5酶连建立如下反应体系0.ltxg0.l^g0.PUC1180MI)总DNA片段IOX连接酶缓冲液T4DNA连接酶加蒸水至16"C温育12小时1.6制备大肠杆菌DH5a高效感受态细胞，具体方法参照J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。1.7转化取10W酶连产物转化200W感受态细胞，具体方法参照J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。涂含有甲氰菊酯(或氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯)，农药为甲醇或者丙酮溶解成的10，000mg/L的母液)200mg/L,Amp100mg/L的LB平板，培养24小时候挑取有透明水解圈的转化子，即是含菊酯水解酶基因的阳性转化子。1.8基因核苷酸序列测定宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定，菊酯类杀虫剂水解酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.l，根据菊酯类杀虫剂水解酶基因核苷酸序列所推到的280个氨基酸序列为SEQIDN0.2。2.菊酯水解酶基因在BL21(PET-29a(+))中的高效表达以左端5'-AGTCATCTCGAGCGGTAGATCAGCTCGGTCGGCT-3，和右端5，-AGTCCATATGACCGTCACCGATATCATCCTG-3，为引物，用PCR从5^M/3卵/朋assp.JQ1-11中扩增菊酯水解酶基因片段.扩增体系~(5U/u1)0.5u110XLAPCRBufferII(Mg2+Plus)5uldNTPMixture(各2.5mM)8u1模板DNA10ng引物l(20uM)lul引物2(20uM)lul灭菌蒸馏水upto50y1PCR扩增程序a.95°C变性3minb.95°C变性1.5min，58。C退火0.5min，72。C延伸1.Omin，进行30个循环c.72。C延伸10min，冷却到室温PCR产物用7VWel和双酶切酶切体系A^eIIn1勘I1u1■《lug灭菌的蒸馏水upto20ul在37。C水浴中，反应3小时以上酶切产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。PET-29a(+)用7VWel和i^ol双酶切(参考2.2)。2.3中的回收片段和2.4中酶切好的PET-29a(+)进行酶连(参考1.5)。酶连好的含菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组微生物BL21(DE3)。涂含有甲氰菊酯(或氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、功夫菊酯)200mg/L，Kan50mg/L，IPTG24mg/L的平板。挑取有透明水解圈的阳性转化子。验证阳性转化子表达的酶对菊酯类农药的降解功能阳性转化子在LB培养基中培养至0D6。。0.6到0.8之间，加IPTG至浓度lmM，30°C培养4个小时。100ml菌液离心，用10ml(50mM，pH7.0)PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎(AutoScience,UH—650Bultrasonicprocessor,30%intensity)5分钟。取200m!粗酶液加到3ml含100ppm甲氰菊酯(或氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯)的(50mM，pH7.0)PBS缓冲液中，在37°C的水浴5个小时。用6ml二氯甲烷分两次充分提取3ml的反应液，用气相色谱检测降解效果，检测条件如下ECD检测器，SPB-5(30mX250umX0.25um);进样口温度，260°C;柱温，240°C;检测器温度，300°C;气体流速，N240mL/min。甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯降解效果均在93%以上(如下表)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>序列表<110>南京农业大学<120>拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因<130>说明书<160>4<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>843<212>DNA<213>JQ1-11菌株(融i聊ffl顯ssp.)<220><221>菊酯水解酶基因<222>(1)..(843)<223><400>1atgaccgtcaccgatatcatcctgatccacggcgccttgaaccgcggcgcctgctatgac60gcggtcgtcccgcttctcgaagcgcgcggctaccgcgtccatgcgcccgacctgaccggc120catacgcccggcgatggcggccatttgtcggtcgtcgacatggagcattatacccgccca180gtcgctgacatcctggcacgggccgaggggcagtcgatccttctggggcacagcttgggc240ggtgcatccatctcgtggctggcgcagcaccatcccgacaaggtggccgggctgatctac300ctgaccgcggtcctcaccgcgcccggtgtaacgccggaaaccttcgtcctgcccggcgag360cccaaccggggcacgcegcacgcgctggacctgatccagccggtcgacgagggacgtggg420ctacaggcggatttctcgcgactggaacggctccgcgaag加catgggcgattatccc480ggcgagggaatgccgcctgccgaacatttcatccagacccagtcgaccgtgccctttggc540acgcccaatccgatggaggggcgcgcgctggaaatcccacgcctctatatcgaggcgctg600gacgatgtcgtgcttccgatcgccgtgcagcgtcagatgcagaaggagttccccggtccg660gtcgcggtcgtgtcgctgccggccagccatgcgccctattactcgatgcccgaacggctg720gccgaggcgatcgccgatttcgccgatgccccggccgagtatcgccagacggcgacgaag780gctgggcctgatcgaccagctggagcggacgggggtcgagccgaccgagctgatctaccg840tga843<210>2<211>280<212>PRT<213>JQ1-11菌株(5aW聊啦朋ssp.)<220><221>菊酯类杀虫剂水解酶基因所推导的蛋白质<222>(1)..(280)<223><400>2MetThrValThrAspHelieLeulieHisGlyAlaLeuAsnArgGly151015AlaCysTyrAspAlaValValProLeuLeuGluAlaArgGlyTyrArg202530ValHisAlaProAspLeuThrGlyHisThrProGlyAspGlyGlyHis354045LeuSerValValAspMetGluHisTyrThrArgProValAlaAspHe505560LeuAlaArgAlaGluGlyGinSerlieLeuLeuGlyHisSerLeuGly65707580GlyAlaSerlieSerTrpLeuAlaGinHisHisProAspLysValAla859095GlyLeulieTyrLeuThrAlaValLeuThrAlaProGlyValThrPro100105110GluThrPheValLeuProGlyGluProAsnArgGlyThrProHisAla115120125LeuAspLeulieGinProValAspGluGlyArgGlyLeuGinAlaAsp130135140PheSerArgLeuGluArgLeuArgGluValPheMetGlyAspTyrPro145150155160GlyGluGlyMetProProAlaGluHisPhelieGinThrGinSerThr165170175ValProPheGlyThrProAsnProMetGluGlyArgAlaLeuGluHe180185190ProArgLeuTyrlieGluAlaLeuAspAspValValLeuProlieAla195200205ValGinArgGinMetGinLysGluPheProGlyProValAlaValVal210215220SerLeuProAlaSerHisAlaProTyrTyrSerMetProGluArgLeu225230235240AlaGluAlalieAlaAspPheAlaAspAlaProAlaGluTyrArgGin245250255ThrAlaThrLysAlaGlyProAspArgProAlaGlyAlaAspGlyGly260265270ArgAlaAspArgAlaAspLeuPro275280<210>3<211>34<212>DNA<213>人工合成<220><221>从JQl-ll扩增菊酯水解酶基因引物左端<222>(1)..(34)<223><400>3agtcatctcgagcggtagatcagctcggtcggct34<210>431DNA人工合成<211><212><213><220><221><222><223><400>从JQl-ll扩增菊酯水解酶基因引物右端(1)..(31)4agtccatatgaccgtcaccgatatcatcctg3权利要求1.菊酯类杀虫剂水解酶基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。2.权利要求1所述的菊酯类杀虫剂水解酶基因核苷酸序列所推导的菊酯水解酶蛋白质，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.含权利要求1所述菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重组质粒。4.含权利要求3所述的重组质粒的重组微生物BL21(DE3)。5.权利要求1所述菊酯类杀虫剂水解酶基因在农作物、农产品、土壤、水体的菊酯残留去除方面的基因工程应用。6.权利要求2所述菊酯水解酶蛋白质在农作物、农产品、土壤、水体的菊酯残留去除方面的应用。全文摘要本发明拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因，属于应用环境微生物领域。本发明提供了菊酯类杀虫剂水解酶基因及其所推导的菊酯水解酶蛋白质。该基因全长为843bp，G+C含量为66.55％，编码280个氨基酸。利用该基因构建的工程菌株能高效表达菊酯水解酶，生产的酶制剂可用于土壤、蔬菜、茶叶、水果、中草药、烟草等的菊酯残留去除，及农产品深加工中降解菊酯农药残留，提高产品品质及增加附加值。并可进一步用于构建转基因作物彻底解决植株中农药残留问题，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复菊酯污染的水体等环境。文档编号C12N15/55GK101429515SQ200810243899公开日2009年5月13日申请日期2008年12月17日优先权日2008年12月17日发明者健何,恋李,李顺鹏,杭宝剑,王保战,鹏郭申请人:南京农业大学