一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法

专利名称：一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法
技术领域：
本发明涉及一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法，是利用启动 子置换技术提高淀粉液化芽孢杆菌的脂肽类抗生素fengycin产量方法，属于生物技术领 域。
二背景技术：
文摘1968年Arima(Biochemical and Biophysical Research Communication, 1968,31: 488-496.)等首次发现枯草芽孢杆菌(汉s^"h's)能够产生抗菌脂肽surfactin以来，抗 菌脂肽产生菌的筛选主要集中在枯草芽孢杆菌的不同菌株之间(中国农业科 学，2003,(12):1496-1501.微生物学报，2003 , 43 (5) : 647 - 652.)。近年来，进一步的研究表 明，除枯草芽孢杆菌外，淀粉液化芽孢杆菌(汉a/sj^oh》"e/acie/7s) ( Phytichemistry, 2002, 61 : 693-698.)、短小芽孢杆菌汲 p固D ( Journal of Fermentation and Bioengineering, 1992， 74: 255-216)等也能产生抗菌脂肽。
抗菌脂肽一般是革兰氏阳性芽孢杆菌产生的代谢产物。抗菌脂肽的分子是由亲水的 肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，文摘
抗菌脂肽除了具有抗菌活性之外还具有生物表面活性剂的特性(Molecular Microbiology,2005, 56:845-857.精细化工，2006，(2 ):121-125.)，在医药(Applied Microbiology and Biotechnology, 1999,51(5): 553-563. The Journal of Antibiotics, 1986， 39:755-761 )、农业(Phytichemistry, 2002, 61: 693-698)、食品及化妆品(食品工业科 技，2006， 4:91-93.]、石油开采(微生物学杂志，2005， 2:4-8农业生物技术学 报，2004， (3) :330-333.)和环境治理(Journal of hazardous materials, 2001,85(1-2): 111-125)
等领域有重要的应用前景，已引起广泛的关注。
其中fengycin等抗菌脂肽具有强烈的抗丝状霉菌作用，已有许多用来抑制植物病原 菌的研究实例。因此，fengycin在植物病害生物防治方面具有重要的应用前景。对农业生 产具有重要的意义。
但是，通常的菌株一般抗菌肽产量很低，迄今为止，脂肽产生菌的产量一般低于1.0g/L， 少的甚至在O.lg/L以下，因此，需要对生产菌株进行诱变，在这方面已有少量尝试，并 取得了良好效果(Journal of Natural Products, 2002,63: 1492-1496)。此外，随着对抗菌脂肽的合 成机理的认识和合成酶基因的定位、克隆和表达的成功，人们开始采用基因工程的手段 构建基因工程菌株用于抗菌脂肽的生产(中国农业科学,2003,(12):1496-1501)。
同源整合技术就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的 位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。它克服了随机整合的盲 目性和危险性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、可诱导性基因同源整合系 统的建立,使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。文摘(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Aug. 2005， p. 45774584. J. Bacteriol. 183:6265~6273.)。目前已有通过同
源整合技术使强启动子来置换抗菌肽合成酶操纵子的启动子，并提高了该抗菌肽的产量。 三
发明内容
技术问题
本发明的目的是通过分子生物方法提高fengycin合成酶基因簇的表达，获得fengycin 产量提高的淀粉液化芽孢杆菌置换菌株。 技术方案
一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法，是将野生型淀粉液化 芽孢杆菌ES-2的fengycin合成酶基因的启动子Ppps置换为启动子P59的方法。其特征 在于，
1)启动子P59序列的克隆
设计启动子Pm的引物
上游引物5 ， - ctttattgttttgccatt -3'
下游弓I物5 ， - ggataagaaagtgaaataacaaactgtcaaataaagta -3 ， 采用上述引物并以质粒pHB201做为模板，扩增获得一个长376bp的Ps9启动子序列；
2) fengycin合成酶基因同源片段及新霉素抗性基因的克隆 设计淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成酶基因5'端的DNA片段引物序列， 上游引物5 ， - tactttatttgaagtttgttatttcactttcttatcc國3 ，
下游引物5 ， - ccaaacttcttgtctg -3 ，
以淀粉液化芽孢杆菌ES-2基因组DNA为模板，扩增获得一个长450bp的fengycin 合成酶基因同源片段SEQIDNO.l，即淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成酶基因5'端部分 片段；
设计新霉素抗性基因的引物， 上游弓I物5 ， - ccggaattcgcgaccttccactcaccggtt -3 ， 下游弓I物5 ， - ccggaattccggggcaatgaaattagactat -3, 从质粒pMK3扩增得到新霉素抗性基因片段U53bp;
3) 同源整合载体的构建
将PCR产物分别纯化后，通过SOE PCR的方法将启动子P59DNA片段和fengycin合 成酶基因同源片段连接到一起，ddH20重溶，与pMD19-T载体连接，得到质粒载体 pMD19-Tl，然后在质粒载体pMD19-Tl的EcoRl位点加上新霉素抗性基因，得到质粒 载体pMD19-T2，将pMD19-T2转化大肠杆菌TOP10F'，获得同源整合载体转化的大肠 杆菌TOPI OF';
4) 同源整合载体转化淀粉液化芽孢杆菌野生菌株ES-2
将同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F'，提取同源整合载体质粒，转化感受态淀粉液化芽孢杆菌野生菌株ES-2，获得同源整合载体转化的淀粉液化芽孢杆菌ES-2菌株， 即启动子P59置换的菌株。
上述方法得到的置换菌株，其同源片段序列为SEQ IDNO 1，启动子P59序列为SEQ ID NO 2。
上述置换菌株的鉴定方法，其特征在于 设计引物
上游引物5 ， - ctttattgttttgccatt -3; 下游引物5，-ccaaacttcttcgtctg-3，
以启动子P59置换的菌株基因组DNA为模板，在100pl体系中，引物终浓度各为 lnM，dNTPs终浓度为0.2mM，淀粉液化芽孢杆菌基因组DNA10ng，4U pfu DNA聚合酶。 扩增程序为94。C 2min;30个循环94°C 50s,53。C 50s,72。C 90s; 72°C 10min;
如果扩增得到大小约826的DNA片段，即是启动子P59片段和淀粉液化芽孢杆菌 ES-2 fengycin合成酶基因5'端部分DNA片段连接到一起，并整合到野生淀粉液化芽孢 杆菌ES-2的基因组DNA中的DNA片段，即为启动子Ps9置换的菌株。
有益效果
迄今为止，人们已经采用同源整合技术已经采用强启动子repU置换了 iturin和 mycosubtilin的启动子，并最终获得该抗菌肽产量提高的菌株。本发明人通过同源整合技 术获得的启动子Ps9置换fengycin合成酶原来启动子的淀粉液化芽孢杆菌菌株，在国际中 首次报道通过同源整合技术获得fengycin产量提高的菌株。
本发明人通过PCR技术从淀粉液化芽孢杆菌菌株ES-2基因组中扩增得到fengycin 合成酶基因的长约450bp的同源片段，并将该片段通过SOEPCR方法和启动子P59连接， 并将连接到一起的片段克隆到质粒pMD19-T上，得到质粒pMD19-Tl， 最后在质粒 pMD19-Tl的EcoR I酶切位点连接上新霉素抗性基因做为筛选标记，从而构建了一个同 源整合载体pMD19-T2获得了强启动子置换的菌株。通过牛津杯法和高效液相技术检测 fengycin产量提高的菌株。
利用本发明获得fengycin产量提高菌株的方法，具有直接的目的性，可以直接从遗 传上改良抗菌肽生产菌株，在农业和工业上都具潜在的应用价值。同时对ES-2野生菌和 启动子置换菌株发酵并提取抗菌物质，并通过高效液相色谱检测fengycin的产量，最终 获得产fengycin的启动子置换菌株的fengycin产量为5704.77±258.89 mg/L，而野生菌的 fengycin产量为3455.05±113.84 mg/L，提高了 fengycin产量约0.65倍。(该实验已经重 复三次，数据都有标准差的，该菌株fengycin产量在国际报道中产量已经比较高了，由 于细菌本身生理条件的限制很难有大幅度的提高)。 四

图1同源整合载体构建示意图
图2启动子P59置换fengycin合成酶基因原来启动子的原理图
(P59:启动子P59， fen':从淀粉液化芽孢杆菌ES-2中扩增并通过SOE PCR和启动子连接到一起的DNA片段，并克隆到质粒pMD19-T上的450bp的DNA片段，Ppps: fengycin 合成酶基因原来的启动子，fen:基因组中fen，的同源序列，neo+:新霉素抗性基因) 五具体实施例方式
本发明的实现是通过克隆淀粉液化芽孢杆菌ES-2基因组DNA的fengycin的一个合 成酶基因fenA的5，端450bp的同源片段(含启动子Ppps)，并将该片段通过SOE PCR方 法和启动子P59连接，并将连接到一起的片段克隆到质粒pMD19-T上，得到质粒 pMD19-Tl，最后在质粒pMD19-Tl的EcoR I酶切位点连接上新霉素抗性基因做为筛选 标记，从而构建了一个同源整合载体pMD19-T2。并将该同源整合载体转化入淀粉液化 芽孢杆菌ES-2中，获得了强启动子置换的菌株。通过牛津杯法和高效液相技术检测 fengycin鉴定产量提高的置换菌株。
(一) 启动子P59序列的克隆
通过PCR方法从质粒pHB201上扩增得到组成型启动子P59(Bron S, et al. Protein secretion and possible roles for multiple signal peptidases for precursor processing in bacilli. J Biotechnol 1998, 64:3-13.)，该启动子能够在枯草等革兰氏阳性菌中启动一些基因高效表 达，在启动子P59的下游连接上fengycin基因合成酶的部分DNA片段作为同源片段，载 体上的同源片段和淀粉液化芽孢杆菌基因组上相应DNA片段发生单交换，使同源片段以 及下游的基因处于启动子P59的控制之下，从而可以得到启动子置换菌株。
参考Bacillus Genetic Stock Center(http:〃bacillus.biosci.ohio-state.edu/)中pHB201的序 列，利用primer primier 5. 0软件自行设计扩增启动子P59的引物 上游引物5 ， - ctttattgttttgccatt陽3'
下'游弓I #勿5 ， - ggataagaaagtgaaataacaaactgtcaaataaagta -3 ， 采用上述引物并以质粒pHB201做为模板，通过下述方法扩增得到启动子P59序列。 在lOOpl体系中，引物终浓度各为lpM,dNTPs终浓度为0.2mM,质粒 pHB201DNA10ng，4U pfo DNA聚合酶。扩增程序为94°C 2min;30 X (94°C 50s，53。C 50s,72。C 1: 30min);72。C 10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将 回收的PCR产物与TaKaRa公司pMD19-T vector连接，转化￡ co// DH5a，涂于含有 IPTG、 X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37°C培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养， 提取质粒，确定连接成功后送到金斯特公司测序。用计算机分析测序结果，获得一个长 376bp的P59启动子序列。
(二) fengycin合成酶基因同源片段及新霉素抗性基因的克隆 将淀粉液化芽孢杆菌ES-2(中国农业科学，2006,(11): 2327-2334)培养液离心收集
菌体，用上海生物工程公司基因组DNA试剂盒提取基因组DNA。
参考Genbank中淀粉液化芽孢杆菌FZB42的fengycin基因序列(登陆号AJ576102), 利用primer primier 5.0软件自行设计淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成酶基因5'端的DNA 片段(即同源片段)引物，
上、游引物5 ， - tactttatttgaagtttgttatttcactttcttatcc -3'下游引物5，- ccaaacttcttgtctg -3 ，
由上海生工合成。
在lOOpl体系中，引物终浓度各为lnM，dNTPs终浓度为0.2mM,淀粉液化芽孢杆菌 ES-2基因组DNA10ng，4U pfu DNA聚合酶。扩增程序为94°C 2min;30X(94。C 50s，53。C 50s,72。Cl: 30min);72°C 10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将 回收的PCR产物与TaKaRa公司pMD19-T vector连接，转化co// DH5a，涂于含有 IPTG、 X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37°C培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养， 提取质粒，确定连接成功后送到金斯特公司测序。用计算机分析测序结果，获得一个长 450bp的fengycin合成酶基因同源片段SEQ ID NO.l ，即淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成 酶基因5'端部分片段。
参考Genbank中质粒pMK3上新霉素基因的序列(EU549779)，利用primer primier 5.0 软件自行设计新霉素抗性基因的引物，
上游弓I物5, - ccggaattctgcaatgtggaattgggaac -3 ，
下游弓I物5 ， - ccggaattcccttattattaattcaattcgctca -3 ，
在100^1体系中，引物终浓度各为lpM,dNTPs终浓度为0.2mM,质粒 pHB201DNA10ng,4U pfu DNA聚合酶。扩增程序为94°C 2min;30 X (94°C 50s,53。C 50s,72°C 1: 30min);72°C 10min。)从质粒pMK3中扩增得到新霉素抗性基因片段U53bp 作为转化淀粉液化芽孢杆菌的筛选标记。
(三) 同源整合载体的构建
将PCR产物分别纯化后，通过SOE PCR的方法将启动子P59DNA片段和fengycin合 成酶基因同源片段连接到一起，ddH20重溶，与pMD19-T载体(购自大连宝生物公司) 连接，得到质粒载体pMD19-Tl，然后在质粒载体pMD19-Tl的EcoRl位点加上新霉素 抗性基因，得到质粒载体pMD19-T2，将pMD19-T2转化大肠杆菌TOP10F，(购自深圳勤 宝升公司),从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取 质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到金斯特公司 测序，获得同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F，。
(四) 同源整合载体转化淀粉液化芽孢杆菌野生菌株ES-2
将同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F'在37'C培养10-11小时后挑取小菌落,接入 含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基,70-卯rpm 3(TC培养过夜，采用质粒提取试剂盒(购 自上海生工)提取同源整合载体质粒，作为转化淀粉液化芽孢杆菌ES-2用。淀粉液化芽 孢杆菌电转化方法如下
1、感受态细胞的准备 过夜培养菌体，稀释16倍置于生长培养基(LB含有0.5M的山梨醇)，37C培养至 OD600为0.85-0.95，将菌体细胞在冰水中冷冻10分钟。4°C5000 x G离心5分钟收集菌 体细胞，在冰冷的电转化液中洗四次。(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%的甘油)。用培 养量的1/40电转化液重新悬浮菌体细胞。使细胞浓度达到1-1.3 x 1010cfo/ml;2、转化
在60uL感受态细胞中加如luL (50ng克/ixL) DNA，转移到电转杯中(lmm的电 击杯)，保温1-1.5分钟，加电压25uF、 200Q。时间4.5-5.0ms。释放电压后，立即象转 化过的细胞中加入lmL恢复培养基(LB含0.5M山梨醇、0.38M甘露醇)。在37'C培养 3h后，置于含有新霉素(5ug/mL)的培养基上筛选。37'C过夜培养,获得具有新霉素抗性 的菌株，即同源整合载体转化的淀粉液化芽孢杆菌ES-2菌株，也就是启动子P59置换的 菌株。
(五) 启动子置换菌株的鉴定方法
参考Genbank中淀粉液化芽孢杆菌FZB42的fengycin合成酶操纵子基因序列(编号 AJ576102 ) Bacillus Genetic Stock Center(http:/7bacillus.biosci.ohio-state.edu/)中质粒 pHB201上P59的序列)(376bp),利用primer primier 5.0软件自行设计启动子P59DNA 序列和淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成酶基因部分450bp DNA序列连接到一起的DNA 片段的引物
上游引物5 ， - ctttattgttttgccatt -3;
下游引物5，- ccaaacttcttcgtctg隱3 ， 以启动子P59置换的菌株基因组DNA为模板，在lOOpl体系中，引物终浓度各为 lpM,dNTPs终浓度为0.2mM，淀粉液化芽孢杆菌基因组DNA10ng,4U pfo DNA聚合酶。 扩增程序为94。C 2min;30X(94。C 50s,53。C 50s,72。C 1: 30min);72。C 10min。
将回收的PCR产物与TaKaRa公司pMD19-T vector连接，转化co//DH5a，涂于 含有IPTG、 X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37°C培养13-14小时，挑白色菌落，振荡 培养，提取质粒，确定连接成功后送到金斯特公司测序。用计算机分析测序结果，扩增 得到大小约826的DNA片段(SEQIDN0.2)，即启动子P59片段和淀粉液化芽孢杆菌 ES-2 fengycin合成酶基因5，端部分DNA片段连接到一起，并整合到野生淀粉液化芽孢 杆菌ES-2的基因组DNA中的DNA片段。从而使fengycin合成酶基因置于启动子P59 的控制之下。
(六) 启动子置换的菌株ES-2脂肽类抗生素fengycin的发酵和提取
5.1菌株抗菌物质的发酵将种子液以5c/。浓度接种于Landy发酵培养基中，在32°C和 180rpm/min下培养48h，得抗菌物质发酵液。
5.2抗菌提取物的制备发酵液在11.000 g下离心15min除去菌体，用HC1将上清夜调 节pH至2，然后轻微搅动或静止过夜，离心收集沉淀，再用NaOH中和，加入甲醇抽 提几次，获得抗菌提取物。
(七) 启动子置换菌株ES-2 fengycin产量的提高
按照(六)所述的方法同时对ES-2野生菌和启动子置换菌株发酵并提取抗菌物质， 并通过高效液相色谱检测fengycin的产量，最终获得产fengycin的启动子置换菌株的 fengycin产量为5704.77±258.89 mg/L，而野生菌的fengycin产量为3455.05 ± 113.84 mg/L，提高了 fengycin产量约0.65倍。序列表
<110>南京农业大学
<120> —种提高液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法
<130>说明书
<140> 00
<141> 2008-11-18
<160> 8
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 450
<212> DNA
<213> PCR扩增
<220>
<221> fenA基因同源片段 <222> (1)..(450) <223> <400> 1
gtcgaaattt aattgtaatt atttcacttt cttatcctct taaattgaaa tggagggatt 60 ccattgaaga acactgttta ttctttaact cacgcccaaa gaagagtgtg gtttacggag 120 ctgctcgaac cgggcacaag tatctgcaat ctcgcggcat gcgtcaaatt caggggggac 180 atcgattttg acgtactgcg ccatgcttta gatttttcta tctcgcaaaa tgattcgctc 240 aggtttcaac tgacagaagg ggacggatca gaaccccagc tgtatctggc ggggcatcgg 300 ccgatttctc tagagactgt tgattttact catactgatc aggcagagcg ggacgcatgg 360 attgacacgc agacccgtgt tccgttcaag ctgtttcatt cacctctgta tcactttact 420 ctgcttgtca tgtcagacga agaagtttgg 450 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213>人工合成 <400> 2
tactttattt gaagtttgtt atttcacttt cttatcc 37
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 3
ccaaacttct tgtctg 16
<210> 4
<211> 377
<212> DNA
<213> PCR扩增
<220>
<221>启动子P59序列 <222> (1)..(377) <223> <400> 4
ctttattgtt ttgccatttt aaaaggttca aataaaatat加cataaa attatcagat 60 gttttttaaa aaatgaaata aaagaagaaa aaaatagaaa atacactaac ccaaagaagc 120 gcgtaatatc gagggtttaa gagacaataa gaaaaaaaga ttgaaaaatg acattaaatt 180 cttgacaggg agagataggt ttgatagaat ataatagttg tcgcgagaga cgacgttgaa 240 gcgcgacaag ctagaccatt gaaaactgaa taaagaagaa tgactcatgt gatgtagcaa 300 tacatcaaaa atctgtcaat caataatgaa agacaagcca tcaattcggt gacttaaata 360 ctttatttga aagtttg 377 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213>人工合成 <400> 5ctttattgtt ttgccatt 18
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 6
ggataagaaa gtgaaataac aaactgtcaa ataaagta 38
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 7
ccggaattcg cgaccttcca ctcaccggtt 30
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 8
ccggaattcc ggggcaatga aattagacta t
权利要求
1、一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法，是将野生型淀粉液化芽孢杆菌ES-2的fengycin合成酶基因的启动子Ppps置换为启动子P59的方法。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，1)启动子P59序列的克隆设计启动子Ps9的引物上游引物5'- ctttattgttttgccatt -3 ，下游弓l物5，- ggataagaaagtgaaataacaaactgtcaaataaagta -3，采用上述引物并以质粒pHB201做为模板，扩增获得一个长376bp的Ps9启动子序列；2) fengycin合成酶基因同源片段及新霉素抗性基因的克隆设计淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成酶基因5'端的DNA片段引物序列，上游引物5，- tactttatttgaagtttgttatttcactttettatcc -3'下游引物5'國ccaaacttcttgtctg-3，以淀粉液化芽孢杆菌ES-2基因组DNA为模板，扩增获得一个长450bp的fengycin合成酶基因同源片段SEQIDNO.l，即淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成酶基因5'端部分片段；设计新霉素抗性基因的引物，上游弓i物5 ， - ccggaattcgcgaccttccactcaccggtt -3 ，下游弓I物5 ， - ccggaattccggggcaatgaaattagactat國3 ，从质粒pMK3扩增得到新霉素抗性基因片段1153bp;3) 同源整合载体的构建将PCR产物分别纯化后，通过SOE PCR的方法将启动子P59DNA片段和fengycin合成酶基因同源片段连接到一起，ddH20重溶，与pMD19-T载体连接，得到质粒载体pMD19-Tl，然后在质粒载体pMD19-Tl的EcoRl位点加上新霉素抗性基因，得到质粒载体pMD19-T2，将pMD19-T2转化大肠杆菌TOP10F'，获得同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F;4) 同源整合载体转化淀粉液化芽孢杆菌野生菌株ES-2将同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F，提取同源整合载体质粒，转化感受态淀粉液化芽孢杆菌野生菌株ES-2，获得同源整合载体转化的淀粉液化芽孢杆菌ES-2菌株，即启动子P59置换的菌株。
3、 权利要求1或2所述方法得到的置换菌株。
4、 权利要求3所述置换菌株的同源片段，其序列为SEQIDNOl。
5、 权利要求3所述置换菌株的启动子P59，其序列为SEQIDN0 2。
6、权利要求3所述置换菌株的鉴定方法，其特征在于设计引物-上游引物5 ，國ctttattgttttgccatt國3;下游弓I物5 ，- ccaaacttcttcgtctg -3 ，以启动子Ps9置换的菌株基因组DNA为模板，在100^1体系中，引物终浓度各为l[iM,dNTPs终浓度为0.2mM,淀粉液化芽孢杆菌基因组DNA10ng,4U pfu DNA聚合酶。扩增程序为94。C 2min;30个循环94°C 50s,53。C 50s,72。C 90s; 72°C 10min;如果扩增得到大小约826的DNA片段，即是启动子P59片段和淀粉液化芽孢杆菌ES-2 fengycin合成酶基因5'端部分DNA片段连接到一起，并整合到野生淀粉液化芽孢杆菌ES-2的基因组DNA中的DNA片段，即为启动子P59置换的菌株。
全文摘要
本发明涉及一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法，属于生物技术领域。是通过PCR方法从淀粉液化芽孢杆菌ES-2菌株基因组中扩增得到450bp的同源序列，从质粒pHB201上扩增启动子P₅₉序列，将上述两个DNA片段连接到一起，并克隆到质粒pMD19-T上，并连接上新霉素抗性基因做为筛选标记，从而构建了一个同源整合载体。将构建好的同源整合载体转化到野生淀粉液化芽孢杆菌ES-2中，启动子置换菌株的fengycin产量为5704.77±258.89mg/L，比野生菌的fengycin产量提高了约0.65倍。
文档编号C12N15/52GK101475944SQ20081024372
公开日2009年7月8日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者乌云达来, 别小妹, 卢亚萍, 吕凤霞, 孙会刚, 林 曹, 煜 王, 陆兆新 申请人:南京农业大学