专利名称：一种检测白血病易感性的试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病检测用的试剂盒，尤其是一种检测白血病易感性的试剂盒，通过检测人PDCD5基因启动子区的两个完全连锁不平衡的功能性单核苷酸多态性(SNP)位点来预测个体对白血病的易感性，并进一步涉及检测白血病易感性的方法。
背景技术：
细胞程序死亡(programmed cell death)是一个生理性的细胞自我毁灭的过程，在胚胎发育、生物体内环境的稳定及多细胞生物防御外在及内在伤害方面均起着非常重要的作用。凋亡过程的紊乱，可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性变如Alzheimer病及局部损伤等。细胞程序死亡相关分子的研究具有重要的理论研究意义和实用价值，针对细胞程序死亡分子设计的药物已经在临床用于肿瘤等疾病的治疗。
TFAR19(TF-1 cell apoptosis-related gene 19)是最近发现的一种新的凋亡调控基因，国际人类基因命名委员会将其命名为PDCD5(programmed celldeath 5)，其编码的蛋白主要定位于细胞内，在人类50余种组织中广泛分布。已发现PDCD5蛋白具有促进多种肿瘤细胞(TF-1，MGC2803，HeLa等)凋亡和抑制增殖的效应(中国专利No98101869.6；Biochem Biophy Res Comm，1999，254203-210)。
目前，国内外已有多家实验室利用不同技术发现PDCD5在疾病情况下，特别是在肿瘤中的表达明显下降。例如，国家人类基因组南方研究中心利用DNA芯片技术研究肝癌的差异表达基因，发现一些细胞凋亡相关基因如PDCD5，PDCD8，Bak，TRAF6和TRAIL等在肝癌中表达明显下降。Hedenfalk等利用DNA芯片技术分析遗传性乳腺癌组织的基因表达谱，发现BRCA1-突变肿瘤中PDCD5表达增加，而BRCA2-突变肿瘤中PDCD5表达减少。冯静等应用免疫组化方法检测PDCD5蛋白的表达与卵巢上皮性癌的FIGO分期、组织学分级、病理类型相关。随FIGO分期与组织学分级升高，PDCD5蛋白的表达下调。宋清华等在研究PDCD5在系统性红斑狼疮(SLE)发病中的作用时，发现PDCD5在活动期SLE患者的血清中抗体的表达量均高于稳定期和正常人群，这可能说明PDCD5与SLE的发病及病情有密切的关系。阮国瑞等利用15种不同荧光标记的单克隆抗体，将骨髓细胞分成不同的群体，通过流式细胞术检测未治成人慢性髓性白血病(CML)慢性期患者，CML加速^急变期患者及正常人骨髓不同群细胞内PDCD5的表达。结果显示CML病人骨髓总的有核细胞、粒细胞内中PDCD5分子表达明显低于正常人。PDCD5的异常表达可能在CML疾病进展中起一定作用。程爱新等研究PDCD5在正常及骨关节炎关节软骨中的表达规律时，发现在骨关节炎软骨细胞中PDCD5表达上调，并出现细胞核内积聚，推测它可能参与了骨关节炎软骨细胞的凋亡过程，在骨关节炎的发病中发挥作用。杜颖等在探讨PDCD5与甲状腺肿瘤之间关系时，发现PDCD5在正常甲状腺组织细胞中几乎未见表达，在甲状腺腺瘤患者的腺瘤细胞中呈强阳性表达，而在甲状腺乳头状癌患者甲状腺癌细胞中则呈阴性表达，提示细胞增殖与凋亡之间的平衡失调在甲状腺癌发病机制中具有重要作用。刘朝晖等发现PDCD5在正常宫颈及CIN I级组织中多呈强阳性表达，在CIN II级以上及宫颈癌组织表达较低。在整体上，PDCD5的表达随宫颈病变的进展，呈下降的趋势，但CIN I表达较正常升高。各级病变之间差异均有显著性。这一实验结果说明，PDCD5可能在不同程度上参与了宫颈癌及癌前病变发生过程中的宫颈细胞凋亡的调控。何焱玲等发现银屑病患者皮损增生的表皮组织细胞内PDCD5蛋白的表达明显降低，表皮单细胞表达PDCD5促凋亡分子的平均荧光强度和阳性率较正常人显著降低，皮损组织细胞表达PDCD5显著低于正常人。推测银屑病患者局部皮损表皮细胞的过度增殖与促凋亡分子PDCD5表达的下调有关，与表皮细胞的凋亡及终末分化过程的调节异常密切相关。
SNP(single nucleotide polymorphism)，即单核苷酸多态性标记，是一类基于单碱基变异引起的DNA多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占大约90％。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感性、和对环境因素、药物反应的差异。SNP可以划分为两种形式一类为基因编码区(coding region)的功能性变异，另一类遍布于整个基因组的非编码区(调控区、内含子和剪接连接区等)的单核苷酸改变。其中位于基因上游5’调控区的SNPs因其可能影响基因的转录表达水平，而受到越来越多的关注。前述众多研究结果提示，PDCD5的异常表达与疾病(如肿瘤、心血管疾病、自身免疫病、神经系统疾病等)密切相关。因此，对PDCD5基因上游5’调控区功能性SNPs的发现及分析可能有助于肿瘤及涉及细胞凋亡异常的疾病的诊断。
发明内容
本申请的发明人发现了PDCD5基因上游5’调控区的单核苷酸多态性位点SNP与人体对白血病的易感性相关，从而提供了一种检测白血病易感性的试剂盒。
本发明人通过广泛而深入的研究，已经发现了PDCD5基因上游5’调控区的SEQ ID NO1所示序列中154位A→G和170位G→A是两个完全连锁不平衡SNPs，即，第154位碱基由A转换至G总是与第170位碱基由G转换至A同时发生。图l中的R代表PDCD5部分基因组SEQ ID NO1的单核苷酸多态性位点(SNP)，所揭示的SNP位点(R)位于该基因的120至180位之间，其代表碱基A/G多态性，即该位点既可以为A，也可以为G。
基于这两个SNP位点，可以设计适当长度的引物，用于经PCR扩增而预测慢性髓性白血病易感性。
在本发明人发现了上述PDCD5基因上游5’调控区的两个SNPs可用来评估个体对白血病的易感性的基础上，提供了一种检测白血病易感性的试剂盒。
该试剂盒包括检测PDCD5基因上游5’调控区SEQ ID NO1中第154位和第170位的两个SNPs的特异性引物；以及检测该SNPs位点的限制性内切酶。
试剂盒中的引物是针对SEQ ID NO1中所示的SNPs位点而设计，特异性地扩增出SEQ ID NO1中包含SNP位点(R)的片段。设计的引物长度一般为18-20个核苷酸。优选地，所述引物选自表1中的一组。
下表1列举了本发明的引物的一些组合，引物的解链温度(Tm)以及这些组合得到的产物大小。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这些列出的引物及其组合。
表1
本发明试剂盒中检测该SNPs位点的限制性内切酶优选是Nar I或Kas I或Sfo I或Ehe I，这是由于第170位G多态型产生一个Nar I或Kas I或Sfo I或Ehe I核酸内切酶位点而第154位A破坏一个Nar I或Kas I或Sfo I或EheI酶切位点，用Nar I或Kas I或Sfo I或Ehe I酶进行的酶切可轻易检测出154位A→G和170位G→A的SNP。
本发明还涉及一种检测白血病易感性的方法，该方法包括下述步骤1)提取受试者的基因组DNA；2)以受试者的基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用的引物为检测PDCD5基因上游5’调控区SEQ ID NO1中第154位和第170位的两个SNPs的特异性引物；3)用检测SEQ ID NO1中第154位和第170位点的限制性内切酶对步骤2)获得的PCR产物进行酶切；4)对步骤3)的酶切产物进行分析，当酶切产物电泳图谱显示被测样品具有SEQ ID NO1序列中154位A→G和170位G→A两个完全连锁不平衡SNPs时，则受试者为白血病易感性。
该方法中的引物优选为表1中的任意一组序列；更优选为表1中的组7序列。
该方法中的限制性内切酶优选Nar I或Kas I或Sfo I或Ehe I。
用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是血液、组织等样品。
采用本发明的试剂盒从测试样品中扩增出PDCD5基因上游5’调控区的部分序列后，对序列进行基因分析。本领域的技术人员知道，有大量的分析技术可用于检测PDCD5基因上游5’调控区中所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于)DNA测序、杂交测序；酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、Mini-sequencing、Taqman技术、分子信标；RFLP；SSCP；变性高效液相色谱法(DHPLC)。分析前述检测扩增产物与野生型的PDCD5基因上游5’调控区相比，154位170位的碱基是否存在变化；如果154位碱基由A转换至G并且第170位碱基由G转换至A，则可以认为个体具有白血病的易感性。
图1为本发明的PDCD5基因上游5’调控区的SNP序列。
图2为154G/170A基因型及154A/170G基因型启动子转染HEK293细胞后的活性检测结果图3为撤血清诱导凋亡条件下，154G/170A基因型及154A/170G基因型启动子转染Hela细胞后的活性检测结果图4为TNF-α诱导凋亡条件下，154G/170A基因型及154A/170G基因型启动子转染Hela细胞后的活性检测结果具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1.SNP的获得步骤1基因组DNA的提取采用小量外周血白细胞基因组DNA快速抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)，取人全血2ml提取基因组DNA；浓度校正至50ng/μl后，用于常规PCR扩增。
步骤2SNP的获得对步骤1中提取的基因组DNA进行特异性PCR扩增，扩增产物纯化后进行直接测序，将测定的各PCR扩增产物序列进行比较，从而得出序列的差异，获得SNP。其中，PCR反应条件为95℃、3分钟，进行35个循环的95℃30秒，68℃1分钟，最后72℃7分钟。引物是有义引物5’-CGGGGAATCGGGCCTCTGC-3’(SEQ ID NO2)反义引物5’-CAAGCTCCTCGTCCGCCATG-3’(SEQ ID NO3)扩增产物经测序后可始终观察到154位GA杂合型与170位AG杂合型总是同时出现。
实施例2.检测试剂盒步骤1DNA模板的提取用常规方法抽取人外周血2ml，常规方法提取这些血样中的基因组DNA。
步骤2PCR反应制备一检测PDCD5基因相关疾病易感性的检测试剂盒，其中，含有下列可扩增出154位和170位SNP的引物对有义引物5’-GCTCCGGGCTGGATTGGTG-3’(SEQ ID NO6)反义引物5’-CATGGCTCGGCGTCAGCG-3’(SEQ ID NO12)PCR反应条件为95℃、3分钟，进行35个循环的95℃ 30秒，68℃ 1分钟，最后72℃ 7分钟。
步骤3基因分析对扩增产物用RFLP技术进行基因型分析，由于第170位G多态型产生一个Nar I核酸内切酶位点而第154位A破坏一个Nar I酶切位点，用Nar I酶进行的酶切可轻易检测出154位A→G和170位G→A的SNP，结果并显示154G变异型与170A完全连锁不平衡；其中154AA/170GG野生型酶切条带为20bp和101bp；白血病易感性的154AG/170GA杂合型酶切条带为20bp、37bp、84bp和101bp，白血病易感性的154GG/170AA多态纯合型酶切条带为37bp和84bp。
实施例3.PDCD5启动子区154A＞G/170G＞A多态性的功能效应分析步骤1、154G/170A基因型及154A/170G基因型启动子区报告载体的构建将含有154G/170A突变基因型及154A/170G野生基因型的PDCD5启动子区转录起始位点上游第643位到转录起始位点下游91位的一个743bp的DNA片段克隆入pGL3-Basic(Promega公司)报告质粒中，构建出含有154G/170A突变型的荧光素酶报告基因质粒pGL3-PDCD5-170A(154G/170A)和含有154A/170G野生型pGL3-PDCD5-170G(154A/170G)的荧光素酶报告基因质粒。
步骤2、154G/170A基因型及154A/170G基因型启动子活性的检测将阴性对照pGL3-Basic、阳性对照pGL3-SV40(Promega公司)、pGL3-PDCD5-170A和pGL3-PDCD5-170G分别转染到HEK293细胞中，24小时后收集细胞，转染pGL3-PDCD5-170A的细胞中荧光素酶的活性比转染pGL3-PDCD5-170G的细胞低80％，提示154G/170A突变基因型降低了启动子的转录活性，使靶基因的表达水平下降(图2)。我们在Hela、U937和Raji细胞系中也得到了类似的结果。
步骤3、在撤血清诱导凋亡条件下，154G/170A基因型及154A/170G基因型启动子活性的检测将阴性对照pGL3-Basic、阳性对照pGL3-SV40、pGL3-PDCD5-170A和pGL3-PDCD5-170G分别转染到Hela细胞中，24小时后撤血清培养，于撤血清后0、12、24和36小时分别检测细胞中荧光素酶的活性，发现转染pGL3-PDCD5-170A的荧光素酶活性在各个时间点都显著低于转染pGL3-PDCD5-170G的细胞，且随着凋亡诱导时间的增加，前者(突变型)的荧光素酶活性无明显变化，而后者(野生型)随诱导时间荧光素酶活性持续增加，提示在撤血清诱导凋亡条件下，突变型启动子转录活性明显低于野生型，并对凋亡诱导不敏感(图3)。
步骤4、在TNF-α诱导下，154G/170A基因型及154A/170G基因型启动子活性的检测将pGL3-PDCD5-170A和pGL3-PDCD5-170G分别转染到Hela细胞中，24小时后，以5ug/ml相同剂量的CHX(放线菌酮)加上不同浓度的TNF-α(CHX 5ug/ml+0、CHX 5ug/ml+TNF-α 1ng/ml、CHX 5ug/ml+TNF-α10ng/ml、CHX 5ug/ml+TNF-α 50ng/ml)于细胞中，24小时后收集细胞检测荧光素酶的活性，发现转染pGL3-PDCD5-170A的荧光素酶活性在各个浓度都显著低于转染pGL3-PDCD5-170G的细胞，且随着TNF-α浓度的增加，前者(突变型)的荧光素酶活性无明显变化，而后者(野生型)随TNF-α浓度增加荧光素酶活性持续增加，提示在TNF-α诱导凋亡条件下，突变型启动子转录活性明显低于野生型，并对凋亡诱导不敏感(图4)。
实施例4.PDCD5基因上游5’调控区SNPs与慢性髓性白血病易感性的相关研究步骤1慢性髓性白血病患者及正常对照标本的收集慢性髓性白血病组外周血样本采自北京大学人民医院血液病研究所，共83份；正常对照组标本选自北京大学第一医院DNA标本库及健康个体，共211份，按实施例1所示方法提取基因组DNA。
步骤2SNP位点基因分型分析l)RFLP基因分型。采用如SEQ ID NO6和SEQ ID NO12所示的序列为正反向引物，进行待检样本的PCR扩增，扩增产物用Nar I核酸内切酶消化，电泳后根据条带位置判定基因型。
2)测序分型。取20％经RFLP分型的样本进行测序分型，以验证RFLP分型的准确性。
分型结果证实154G变异型与170A完全连锁不平衡，它们在人群中的等位基因频率完全相同。
在病例组和对照组中，等位基因的频率及基因型频率见表2。进行统计学处理，154G+/170A+基因型在病例组中显著高于对照组，x2检测P＜0.05，说明154G+/170A+基因型与慢性髓性白血病相关，PDCD5是慢性髓性白血病的一个易感基因。
表2.PDCD5基因多态性位点基因型和等位基因在CML组和健康对照组中的分布CML(N＝83) 健康对照(N＝211)N(％)PDCD5-154/170基因型*AA/GG 65(78.31) 186(88.15)AG/GA 18(21.69) 23(10.90)GG/AA 0(0) 2(0.095)G+/A+18(21.69) 11(11.85)等位基因A/G 148(89.16)395(93.6)G/A 18(10.84) 27(6.4)PDCD5基因上游5’调控区154位和170位SNPs完全连锁不平衡，斜线左侧为154位SNPs基因型或等位基因，右侧为完全对应的170位点的情况*由于多态纯合基因型(GG/AA)的频率较低，故将该基因型与杂合基因型(GA/AG)合并为多态阳性基因型(G+/A+)。154G+/170A+基因型在病例组中显著高于对照组，x2＝4.88，P＜0.05
FPI05193 sequence listingSEQUENCE LISTING<110>北京大学<120>一种检测白血病易感性的试剂盒和方法<130>FP105193<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>300<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1aggcgccgat cacgggtggg aggtggatcc cggaggcccc gccccaggcc ccgcccctcc 60gtgcgcccaa gctcgaccgc ctgaaatcgg ggaatcgggc ctctgccggc gccctggcag120cggcgcgggg cgtggctccg ggctggattg gtgacgcctg ggccccgcgg gcgcctgcgc180agtggtcaag gccgcgctcg cgccgagggg ctgcgagagt gaccgcggct gctccagcgc240tgacgccgag ccatggcgga cgaggagctt gaggcgctga ggagacagag gctggccgag300<210>2<211>19<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>2cggggaatcg ggcctctgc 19<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>3caagctcctc gtccgccatg 20<210>4<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>4ctccgggctg gattggtg 18<210>5<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>5ctggattggt ggcgcctg 18
FPI05193 sequence listing<210>6<211>19<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>6gctggattgg tggcgcctg 19<210>7<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>7gctccgggct ggattggt 18<210>8<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>8aagctcctcg tccgccat 18<210>9<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>9ctcaagctcc tcgtccgc 18<210>10<211>19<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>10caagctcctc gtccgccat 19<210>11<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>11cctcaagctc ctcgtccg 18<210>12
FPI05193 sequence listing<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>12catggctcgg cgtcagcg 18<210>13<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>13tcaagctcct cgtccgcc 18
权利要求
1.一种检测白血病易感性的试剂盒，包括检测人PDCD5基因上游5’调控区SEQ ID NO1中第154位和第170位的两个SNPs的特异性引物；以及检测该SNPs位点的限制性内切酶。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物选自表1中的任意一组序列。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物选自表1中的组7序列。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的限制性内切酶为NarI或KasI或SfoI或EheI。
5.一种检测白血病易感性的方法，包括下述步骤1)提取受试者的基因组DNA；2)以受试者的基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用的引物为检测PDCD5基因上游5’调控区SEQ ID NO1中第154位和第170位的两个SNPs的特异性引物；3)用检测SEQ ID NO1中第154位和第170位点的限制性内切酶对步骤2)获得的PCR产物进行酶切；4)对步骤3)的酶切产物进行分析，当酶切产物电泳图谱显示被测样品具有SEQ ID NO1序列中154位A→G和170位G→A两个完全连锁不平衡SNPs时，则受试者为白血病易感性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的引物选自表1中的任意一组序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的引物选自表1中的组7序列。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的限制性内切酶为NarI或KasI或SfoI或EheI。
全文摘要
本发明公开了一种检测白血病易感性的试剂盒。该试剂盒包括检测PDCD5基因上游5’调控区SEQ ID NO1中第154位和第170位的两个SNPs的特异性引物；以及检测该SNPs位点的限制性内切酶。本发明的试剂盒通过检测人PDCD5基因启动子区的两个完全连锁不平衡的功能性单核苷酸多态性(SNP)位点来预测个体对白血病的易感性。
文档编号C12Q1/68GK1724692SQ200510084348
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月19日 优先权日2005年7月19日
发明者赵红珊, 马曦, 阮国瑞, 马大龙, 王莹, 李启艳, 朱平 申请人:北京大学