专利名称：捕获载体及用该载体进行基因捕获的方法
技术领域：
本发明涉及利用基因捕获进行的随机突变ES克隆技术。
背景技术：
据说由于人类基因组计划进行顺利，人类基因组结构分析将于2003年前完成。现在逐个分离基因并单独分析它们的功能的时代即将结束，我们已经进入了基因组的“结构分析”时代。
仅有基因组的核酸序列功能信息是不够的。因而需要新的分析系统进行功能分析。而且人类基因组分析的一个主要目的是阐明人类疾病致病基因，但这些疾病并不能仅通过其致病基因的结构来解释。
在鉴定了致病基因后为了分析疾病的发展过程和开发新的治疗方法，生产个体模型是必不可少的工作。
另一方面，如果将基因组结构划分为基因区和非基因区，则认为这两部分有独立的功能，因此需对这两部分的功能都进行分析(
图1)。从整个基因组的角度来看，每个基因仅执行总体功能中的一部分功能。基因组并不仅仅是基因的集合，可能还有其未知的功能。事实上，新概念“位置效应突变”已经建立。由此推测基因组还有未知功能的区域。
基因区由调节区和编码区组成。目前，基因组功能分析的目标是编码区。相比之下，小鼠与人所拥有的基因的种类几乎相等。因此调节区域的功能分析是重要的。小鼠基因和人基因之间在物种上存在差异。据认为这种差异并非由于蛋白不同而是由于基因表达的调节上有所不同。
有关基因表达调节中的转录因子等的功能可以通过其相关基因编码区的序列予以阐明。因为许多与转录因子相结合的元件存在于一个基因的调节区，所以目前分析这些元件的功能极为困难。但功能分析技术，可以考虑使用细菌人工染色体。
据认为编码区的功能分析可以在mRNA水平，蛋白水平，组织/器官水平和个体(即整个动物)水平上进行。据信可以用DNA芯片在mRNA水平进行这样的分析。另一方面，因为在体外多种组织和器官衍生的系统是直接由ES细胞演化而来且将来许多这样的系统有望得到发展，所以对于在其它水平上进行功能分析，用胚胎干(ES)细胞看来是最好的方法。而且，用ES细胞的好处还在于可以建立个体水平的分析系统。
由上述内容可以理解，在ES细胞水平上的基因剔除和剔除了相关基因的剔除小鼠的生产在基因组功能分析方面有极为重要的作用。
迄今为止，在剔除小鼠的生产中，利用ES细胞进行同源重组起着主要的作用。但是考虑到这种方法不是单独地生产剔除小鼠，从生产剔除小鼠的策略角度综合考虑，则这一方法有着严重的问题。
首先，这一方法需要过多的时间。在生产剔除小鼠的过程中，分离用ES细胞通过同源重组产生的剔除ES克隆是限速步骤。即便是熟练的研究人员，要分离一个剔除ES克隆也至少需要3个月的时间。这样用一年的时间仅能剔除四个基因，照此速度要将每一个突变引入105个基因需要2500个研究人员工作一年。据估计全世界每年生产约1000剔除小鼠鼠系。这意味着需要100年的时间来生产105个剔除ES克隆。与将于2003年完成的人类基因组结构分析的进展相比是十分不现实的。
其次，这种方法耗资巨大。生产一个剔除小鼠系至少需要2百万到4百万日元，还不包括人员消耗和折旧的消耗。生产105个剔除小鼠样本就需要2000亿到4000亿日元。
如上所述，用ES细胞进行常规的同源重组存在问题，而基因组又是巨大的。但基因组中基因的数量是有限的。因而需要从基因组中分离出那些具有重要功能的基因。在许多情况下，只有在生产出剔除了相关基因的剔除小鼠后，该基因的功能才得以阐明。因此剔除小鼠与划时代的药物的开发直接相关，而且具有极高的附加值。这样的环境下，在此情况下，大规模地随机生产突变小鼠成了全球性的“战略”。目前，据认为在生产随机突变小鼠方面下述的三种方法是合理的。
第一种方法是使用一种诱变剂乙基亚硝基脲(ENU)。在欧洲已经启动了一项用ENU进行大范围突变生产的计划。在德国，动物遗传研究所的Balling博士和其他人员在1997即启动了这项计划，其作为人类基因组计划的一部分。英国，在Smithkline Beecham的支持下，Brown博士和其他人员在Harwell的MRC小鼠基因组中心也开始了这项计划，其目的在于建立主要在脑/神经系统突变的突变小鼠。迄今为止，这两个小组已经建立了约200个表现显性遗传的突变小鼠系。这一计划正比预期的更为有效地进行着。美国已决定在CaseWestern Reserve大学，橡树脊国家实验室(Oak Ridge NationalLaboratory)等处以巨资(每年60亿日元)启动小鼠基因组结构分析和用ENU方法生产突变体。
将ENU施用于成年雄鼠时，ENU在减数分裂前作用于精原细胞，随机地导致每个精原细胞产生约50到100个点突变。突变的出现频率为1/1000/配子/位点。因此，将一只经过处理的雄鼠与一只正常的雌鼠交配，其F1代可以出现许多种突变小鼠。在使用ENU的方法中，为研究某一特定位点对1000只小鼠进行筛选，就筛选几率而言可以得到一只该位点突变的小鼠。因而人们认为这一方法是高效的。
第二种方法是使用苯丁酸氮芥，这也是一种诱变剂。这种方法与用ENU的方法引起精原细胞的突变频率相同。但这些突变是缺失突变，且有时可能有1兆碱基的缺失。
第三种方法是基因捕获的方法，基因捕获是以寻找未知基因为目的的一种技术，该技术将包含标记基因的捕获载体引入ES细胞，然后监测标记基因的表达。捕获载体随机地整合进ES细胞中，结果大多数情况下使内源基因(在细胞或组织中固有的基因)遭到破坏。因此以这样的ES细胞制备嵌合小鼠可以生产出多种剔除小鼠。
但每一种方法，无论是使用诱变剂还是进行基因捕获都有其优点和缺陷(表1)。
表1
按照ENU方法生产突变小鼠容易，但由于需要进行杂交分离，所以建立个体突变系并不容易。而且为了鉴定突变基因，首先要用多态DNA标记通过连锁分析鉴定相关位点，然后再通过定位克隆分离该基因。因此ENU方法需要进行复杂的操作。
按照苯丁酸氮芥方法生产突变小鼠容易，但需要鉴定缺失位点。为此需要使用若干多态DNA标记进行分析。另外，一般来说使用如苯丁酸氮芥等诱变剂的方法往往需要大的饲育空间。因而应用这样的方法需要大量的人力物力的投入。
尽管基因捕获的方法也需要人力和生产突变小鼠的技术，但突变的基因易于鉴定，而且可以根据饲育空间的大小来进行实验。基因捕获ES克隆本身就是基因组功能分析的宝贵资源。在这一点上基因捕获技术也明显地区别于其它方法。
世界上已有一些实验室开始用基因捕获技术来生产突变体。在美国一家叫作Lexicon Genetics Incorporated的私人公司正利用反转录载体通过基因捕获进行随机破坏。但普通的技术人员基于下述原因难于使用这样的服务。简言之，即使基因捕获成功，内源基因是否已破坏并不确定；是否能生产种系嵌合小鼠也不清楚；需要额外的支出来生产嵌合小鼠；使用该项服务需要相当多的费用。在德国，作为ENU项目的一部分，人们也在进行基因捕获，目的在于建立12,000个克隆。不管以何种方式，这些正在开展的工作着重于分析所捕获基因，而不是建立小鼠系。
发明内容
本发明所解决的问题在于克服传统的基因捕获方法中存在的缺陷，开发一种新的“可交换基因捕获方法”，利用该方法可以理想地大量建立ES捕获克隆，并利用所捕获克隆生产小鼠突变体。因而本发明的一个目的是提供捕获载体；基因捕获方法；引入了捕获基因的转基因动物或剔除动物和捕获的基因。
根据为解决上述问题而进行的广泛深入研究的结果，本发明人提出将噬菌体衍生的重组系统Cre-loxP用于基因捕获。从而完成了本发明。Cre是一种可以识别loxP序列并可在该位点引起突变的重组酶。
本专利申请提供下述发明
(1)一种捕获载体，其包含由倒转重复序列1，间隔序列和倒转重复序列2依照这一顺序组成的loxP序列，该loxP序列是突变的loxP，其中的部分倒转重复序列1或2发生了突变。
lox 71(例如该序列如SEQ ID NO15所示)为部分倒转重复序列1发生突变的突变loxP的具体实例。lox66(例如该序列如SEQ ID NO16所示)为部分倒转重复序列2发生突变的突变loxP的具体实例。
(2)一种载体，该载体通过两种捕获载体重组而形成，一种捕获载体包含其中部分倒转重复序列1发生突变的突变loxP，另一种捕获载体包含其中部分倒转重复序列2发生突变的突变loxP。
(3)一种捕获载体，选自下述的(a)到(i)(a)SD-SA-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP(b)SP-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP(c)SA-lox71-IRES-M--loxP-pA-PV-SP(d)SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-Pa-PV-SP(e)lox71-M-loxP-pA-lox2272-pV-lox511(f)lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511(g)(lox71-整合的SA)-M-loxP-pA-lox2272-pV-lox511(h)(lox71-整合的SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511(i)(lox71-整合的SA)-M-loxP-pA-lox2272-启动子-M-lox511-SD，其中SP代表任意序列；SA代表剪接受体；SD代表剪接供体；IRES代表内部的核糖体进入位点；M代表标记基因；puro代表嘌呤霉素抗性基因；pA代表poly(A)序列；PV代表质粒载体。
在上述的捕获载体(a)到(i)中，β-geo基因作为标记基因的具体实例，pBR322，pUC质粒(pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，等)，pSP质粒(pSP64，pSP65，pSP73等)和pGEM质粒(pGEM-3，pGEM-4，pGEM-3Z，等)作为可举出的质粒载体的具体实例。
(4)一种包括将上述的任意一种捕获载体引入胚胎干细胞的基因捕获方法，和通过该方法引入了捕获载体的胚胎干细胞。
(5)一种包括将上述胚胎干细胞引入动物的生产转基因动物或剔除动物的方法，和由该方法生产的转基因动物或剔除动物。
作为具体实例，上述动物可选自小鼠，大鼠，兔，豚鼠，猪，绵羊和山羊。
下面对本发明进行详细描述。本说明书包括日本专利申请No.11-200997的说明书和/或附图的内容，并且本申请要求上述申请的优先权。
本发明涉及基因捕获方法，引入了捕获基因的转基因动物或剔除动物以及被捕获的基因。图2是依照本发明的基因捕获方法的概要。为达到本发明的目的，首先构建捕获载体，然后将其引入胚胎干细胞，接下来分离筛选捕获克隆(图2A-C)。图2是以pUHachi载体为例进行说明的。接下来，生产嵌合动物(如嵌合小鼠)，然后生产由捕获克隆衍生的突变小鼠(图2F-G)。另一方面，用所捕获并筛选出的克隆除通过质粒拯救对基因组进行恢复外，还对所捕获的基因进行分离、测序(图2C-E)。而且该克隆经受电穿孔和用如嘌呤霉素这样的药物进行筛选，由此捕获所需基因。表达所捕获基因，接下来生产ES克隆衍生的小鼠系(图2H-I)。
本发明概述如下(包括探索研究)(1)总体效率(1-1)通过胚胎体的形成进行筛选将106个新霉素抗性克隆悬浮培养以形成胚胎体，分析了在ES细胞阶段和分化诱导后β-半乳糖苷酶的表达。结果发现90个捕获克隆(86％)在上述的任一阶段均表达β-半乳糖苷酶。
(1-2)筛选指示单克隆整合的克隆从109个在胚胎体形成过程中表达标记基因的捕获克隆中抽提DNA，然后分析了捕获载体的整合方式。结果75个克隆(70％)是单拷贝整合。其中24个克隆(22％)是完全的(即保留了质粒的复制起点)，40个克隆(37％)缺少pUC。即使pUC丢失了也可以利用lox71位点再插入。因此，这64个克隆(59％)是有用的(表4)。
(1-3)种系嵌合体生产的效率用上述的捕获克隆生产嵌合小鼠。结果由约一半的上述克隆获得了种系嵌合小鼠。
(1-4)完整实验的总结实验发现起初筛选的约26％的新霉素抗性克隆进行到了实验的最后阶段。鉴于种系嵌合体生产的效率日益提高，可以相信整体的效率会进一步提高。但是目前所达到的效率对研究实践已经足够了。
(2)基因捕获方法的效率按照到目前所获得的实验结果，已建立了24个捕获系。其中的13个已经进行了基因水平的分析。它们的核苷酸序列用BLAST程序在Genbank和EMBL数据库中进行了比较。结果如下9个克隆各自捕获了一个已知基因；3个克隆各自捕获了一个EST；余下的一个克隆捕获了一个未知基因(表2)。按照到目前为止其他研究者的报道，10-25％的捕获基因是已知基因；10-20％是ESTs；50-80％是未知基因；2-10％是重复。
表2
(3)所捕获的基因发明人利用胚胎体形成筛选方法通过确定已知基因的种类来检验是否那些涉及发育和细胞生长的基因都能被有效地捕获。结果发现已知基因是转录因子CBP(CREB结合蛋白)和Sp1；与细胞周期相关的细胞周期蛋白B2；与信号转导相关的CrkH和pHPS1-2；rRNA，suil，hnRNPL和RNA聚合酶I；及线粒体DNA(表3)。由此发现捕获到了非常普通的基因。这些基因中的大部分与细胞生长相关。这表明利用胚胎体形成的筛选系统取得了良好的结果。
表3
(4)确定由捕获造成的基因破坏事实上内源基因能否通过基因捕获而破坏是非常重要的一点。因此发明人分析了6个已知基因的捕获位点的结构。结果发现捕获载体插入到一个基因的启动子区域；一个基因的外显子区域；4个基因的内含子区域。所有的基因均被全部或部分破坏。由此可以证明用本发明的基因捕获的方法可以有效地破坏内源基因(图10)。
在下文将更详细地描述本发明。
1.捕获载体的构建基因捕获是利用引入ES细胞的捕获载体偶然地和随机地整合到小鼠内源基因中来捕获基因组上的未知基因的方法。“基因捕获”是指捕获载体进入基因组上的特定基因中并截获该基因。用于截获基因的载体称为“捕获载体”。基因具有增强子，启动子，外显子，poly(A)序列，等等。捕获载体能截获它们中的任何一种。为了这一目的，宜应用对于特定的截获具有合适结构的捕获载体。
一般来讲，外显子捕获载体由带有单独的剪接受体的报告基因，药物筛选标记基因和一种质粒组成。只有当这些载体整合到小鼠内源基因的下游时，报告基因才能表达。这意味着可以通过监控捕获载体上报告基因的表达来获知该载体整合到内源基因中了。如果象pUC19这样的质粒连接到捕获载体上，所捕获的内源基因可以通过所谓的质粒拯救技术来分离。“质粒拯救”是指在由电穿孔法等转化的细胞中通过氨苄青霉素筛选恢复所需基因的技术(图2E)。此外，由于内源基因已在捕获时被破坏，可以立即生产剔除小鼠。而且由于报告基因在内源基因的表达调节区域的控制下表达，则可容易地分析该基因的组织特异性和时间特异性。
在传统的基因捕获方法中，即使小鼠的内源基因可以被完全地破坏，却无法向其中引入见于人类遗传疾病中的细微突变，如单个氨基酸的替换。也不可能用人的基因替换已破坏的小鼠的基因。为解决这些问题，本发明对Cre-loxP系统(源于噬菌体的重组系统)进行了修饰并将其用于基因捕获的捕获载体中。结果在因整合了捕获载体而破坏了小鼠基因后，可以将任何基因插入到捕获载体的突变loxP位点。依照本发明，可以引入细微突变，如见于人类遗传疾病中的单个氨基酸的替换。也可以用人的基因替换已捕获的基因。本发明的捕获载体可以用于捕获多种基因。特别是，其优选地用于外显子的捕获和启动子的捕获。
loxP(交换位点，P1)是一个34bp的序列(5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’)(SEQ ID NO3)。5’端的13个碱基(称为“倒转重复序列1”)和3’端的13个碱基(称为“倒转重复序列2”)组成倒转重复序列，它们由8bp的间隔序列(gcatacat)分开(图3)。此处所用的术语“倒转重复序列”是指位于间隔序列一侧的序列与位于间隔序列另一侧的序列反方向互补。换句话说，一个序列的正义链在反方向上与另一序列的反义链同源。这两个重复序列方向相反，形成双链时有一个相同序列的重复。因此它们叫做倒转重复序列。如图3所示，双链中的一条链(例如正义链)中的倒转重复序列1(5’-ataacttcgtata-3’；SEQ ID NO4)(图3的左侧)沿5’→3’方向与倒转重复序列2(5’-tatacgaagttat-3’；SEQ ID NO5)(图3的右侧)沿3′→5′方向互补。
与普通的序列不同loxP有方向性。因此在本发明中当loxP以上述的5′→3′方向表示时，在其表示符号中包含一个向左的箭头(例如 )。
Cre(引起重组)是指引起遗传重组的重组酶，当识别上述重复序列后，切割该间隔序列，将间隔序列中的“cataca”留作粘性末端(图3)。
在细菌中，重组出现在两个loxP位点之间，产生插入和缺失反应。若能在哺乳动物细胞中引起插入反应，则任何所需基因均可随后插入。这可以极大地扩展基因捕获的适用性。事实上，由于哺乳动物细胞具有大细胞核，带有缺失的loxP的环状DNA分子将会弥散，所以很难观察到插入反应。
为了解决上述问题，本发明人详细介绍了一种方法，其中为了引起插入反应将突变引入loxP序列，并且一个基因插入基因组后，该基因不会被缺失(即不从基因组中去除)。为实施该方法，发明人制备了两种突变的loxP序列(图4)。
简要地说，本发明人通过将替换突变引入到loxP的一个倒转重复序列中(正义链)(ATAACTTCGTATA；如图4b左侧所示)，使突变的序列成为(TACCGTTCGTATA)(带下划线的部分发生了改变)而新建立了一个突变体。这一突变体命名为″lox71″(SgQ ID NO15；图4b)。另一个突变体是通过下述方式构建的，即将替换突变引入到loxP的另一个倒转重复序列中(正义链)(TATACGAAGTTAT；如图4b右侧所示)，使突变后的序列成为TATACGAACGGTA(SEQ ID NO2)(带下划线的部分发生了改变)。这一突变体命名为″lox66″(SEQ ID NO16；图4b)。
当基因组上的lox71和质粒上的lox66发生重组时，两个重复序列均发生突变的loxP序列(命名为″lox71/66″；TACCGTTCGTATAGCATACAT TATACGAACGGTA；SEQ ID NO6)位于插DNA的5’端(图4a见左侧)，野生型的loxP序列(ATAACTTCGTATA GCATACATTATACGAAGTTAT；SEQ ID NO3)(图4a，见左侧)位于插入DNA的3’端。结果Cre不再识别lox71/66，因而不能引起与loxP的重组。当两个野生型的loxP序列之间发生同源重组时，包含切除的loxP的环状DNA在物理上被分隔开。因而反应趋向于缺失而非插入。另一方面，当lox71用于染色体，而lox66用在环状DNA分子上，Cre难于识别由DNA的整合而产生的lox71/66，因而反应趋向于插入而非缺失，插入物的插入状态得以保持(图5)。值得注意的是，在本发明中，lox66可能用于染色体，而lox71可能用于环状DNA分子上。
事实上，当突变的loxP(下文中有时指“突变lox”)例如lox71已事先整合到ES细胞中，包含其它突变loxP(例如lox66)的质粒再引入其中，该质粒整合到染色体上。因此，如果这一lox71已事先整合进基因捕获载体中，则可能在其后利用lox66插入任何所需基因。这样依照本发明，用已事先引入了细微突变的基因或人基因替换所捕获的基因即成为可能。
使用这一突变的lox(lox71或lox66)的基因捕获载体可由下述方式构建(见图6)。此处值得注意的是下列的捕获载体仅仅是作为介绍，而并非限定。这样，尽管lox71在下列载体中作为突变的lox的实例，利用lox66而非lox71的载体也包含在本发明的范围内。
(a)U8SP-SA-lox7I-IRES-M-pA-loxP-PV-SP(b)U8deltaSP-lox71-IRES-M-pA-loxP-PV-SP(c)pU-HachiSA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP(d)pU-12SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP(e)pU-15lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511(f)pU-16lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511(g)pU-17(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511(h)pU-18(整合了lox71的SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511(i)(整合了lox71的SA)-M-loxP-PA-lox2272-启动子-M-lox511-SD在上述的载体组分中SP代表任意序列；SA代表剪接受体；SD代表剪接供体；IRES代表内部的核糖体进入位点；M代表标记基因；puro代表嘌呤霉素抗性基因；pA代表poly(A)序列；PV代表质粒载体。
当捕获载体整合进基因组DNA后，大部分情况下将有部分载体缺失，结果使载体失去部分重要功能。SP作为虚设的序列添加在载体上以防止这种缺失。这一序列可以根据情况进行选择。SP序列的长度在100-1000bp，优选300-400bp。任何已知的序列均可以作为SP序列。例如可以用部分兔β-球蛋白基因。
剪接受体是指在剪接时可以连接到外显子3’末端的序列。
剪接供体是指在剪接时可以连接到外显子5’末端的序列。
IRES，称为“内部核糖体进入位点”是在蛋白合成中核糖体上与氨酰t-RNA相结合的位点(A位点)，它是允许以CAP非依赖方式起始翻译的序列。
标记基因作为一个基因标记用以检测本发明的载体是否捕获了目的基因。标记基因的具体实例包括大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ基因)或lacZ基因与新霉素(G418)抗性基因(β-geo基因)的融合基因，CAT基因，GFP基因，SV40大T基因，新霉素抗性基因，嘌呤霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，和杀稻瘟菌素抗性基因。
质粒载体用于在基因捕获后通过质粒拯救分离内源基因。质粒拯救是一种由所用质粒的一部分恢复整合到捕获载体里的质粒(其可在大肠杆菌中复制)的临近区域的方法。例如若基因组DNA的片段连接到该质粒上，可通过内切酶的作用切除包括该质粒和与该质粒相连的基因组DNA片段的一个片段。该切除片段环化后引入大肠杆菌进行增殖。结果该质粒侧翼区的上述基因组DNA片段得以恢复。特定的载体的实例包括pBR322，pUC质粒(pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，等)，pSP质粒(pSP64，pSP65，等)和pGEM质粒(pGEM-3，pGEM-4，pGEM-3Z，等)。另外，supF，氨苄抗性基因，复制起点，或克隆的酶切位点(例如，多克隆位点)可以单独或适当组合后连接到质粒载体上。
上述(a)中所示载体命名为“U8”。U8的基础部分(SA-IRES-β-geo-pA；图7)来自pGT1.8IRESbetageo。pGT1.8IRESbetageo包含源于小鼠En-2基因的剪接受体，IRES和β-geo。lox71插入这一质粒的BglII位点，接下来用SalI处理从而提供一个SalI片段。另一方面，通过向质粒载体(例如pUC19)中插入180bp的SP序列，loxP和poly(A)信号构建质粒pEBN-Seti。将上面制备的SalI片段插入这一质粒的SalI位点即构建了U8。因此，这一捕获载体的结构如下所述(从5’端起，按下述顺序)任意序列，剪接受体，lox71，IRES，β-geo，pA，loxP，pUC19，和任意序列(图7)。
上述(b)中所示载体命名为“U8delta”。U8delta可由U8缺失剪接受体而获得。这一载体具有如下结构，即lox71连接到报告基因β-geo之前，loxP在β-geo之后。这一载体给出这样的结构是由于，中间的IRES和β-geo可以在载体整合后通过Cre瞬间表达完全去除。结果，质粒pUC定位到邻近位于该质粒上游的小鼠内源基因的位置。因此，可以容易地分离小鼠内源基因。
上述(c)中所示载体命名为“pU-Hachi”。这一载体由SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP 组成。pU-Hachi 载体源于pGT1.8IRESβ-geo，包含小鼠En-2基因的SA序列和与脑心肌炎病毒衍生的IRES序列相连接的β-geo序列。lox71的一个BamHI片段插入pGT1.8IRESβ-geo的BglII位点。然后向去除了lacZ序列的经修饰载体中插入SP序列，loxP序列和来自小鼠磷酸甘油酸激酶-1(PGK)的poly A附加信号序列构建一个质粒。SP序列用于保护捕获载体的3’末端。可以通过将SA-IRES-lox71-β-geo中的SalI片段插入到上述质粒的SalI位点上构建载体pU-Hachi。
上述(d)中所示载体命名为“pU-12”。这一载体由SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP组成。为构建这一pU-12捕获载体，首先用嘌呤霉素抗性基因+PGKpoly(A)信号替换pE3NSE7的PGK poly(A)信号。然后将lox511插入其中的BglII位点下游。再将质粒pU-Hachi上SA-IRES-lox71-β-geo中的SalI片段插入到所得质粒的酶切位点中，由此获得了pU-12。
上述(e)中所示载体命名为“pU-15”。这一载体由lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511。“lox2272”是一个突变的loxP，其中的间隔序列(gcatacat)变为ggatactt(即第二个碱基“c”变为“g”，第七个碱基“a”变为“t”)。“lox511”是一个突变的loxP，其中的间隔序列(gcatacat)变为gtatacat(即第二个碱基“c”变为“t”)。由于lox511和lox2272在间隔序列中存在突变，尽管两个lox511序列或lox2272序列彼此之间可以重组，但它们不会与其它loxP序列例如野生型的loxP或lox71进行重组。lox511和lox2272在载体上的顺序可以改变，任何一个都可以在前(这样可以使其它载体利用这些突变)。
上述(f)中所示载体命名为“pU-16”。这一载体由lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511组成，它可以通过在pU-15的lox71和β-geo之间插入IRES而构建。
上述(g)中所示载体命名为″pU-17″。在这一载体中，lox71整合到SA的区域中。该载体由如下方式构建。简言之，通过向例如pSP质粒中插入lox511，loxP，PGK poly(A)信号和lox2272而构建一个质粒。然后将lox71插入pU-Hachi的SA中再顺次插入β-geo。将这一质粒与上面构建的质粒相连接即获得pU-17。
上述(h)中所示载体命名为″pU-18″。与pU-17一样，这一载体也含有整合于SA中的lox71。将IRES插入到pU-17中的SA和β-geo之间即获得pU-18。
上述(i)中所示的载体是由(整合到SA中的lox71)-M-loxP-pA-lox2272-启动子-M-lox511-SD组成。这一载体是顺次将启动子和M插入到pU-17中代替PV，并将SD连接到lox511后而构建的。这一载体上添加了启动子。这一启动子并没有特殊的限定。任何启动子都可以使用。可列举出的例子包括在下述转化子制备部分中所描述的源于细菌或酵母的启动子；RNA聚合酶启动子，如SP6RNA聚合酶启动子，T7RNA聚合酶启动子，T3RNA聚合酶启动子；或源于哺乳动物的启动子，如EF1(延伸因子1)启动子，PGK(磷酸甘油激酶)启动子，MCI(多瘤增强子/单纯疱疹胸苷激酶)启动子。
2.基因捕获用上述制备的载体进行两步基因捕获。第一步是传统的基因捕获。“传统的基因捕获”是指将上述捕获载体引入ES细胞捕获在ES细胞中固有的内源基因。通过这些步骤，ES细胞中的内源基因遭到破坏。用这些ES细胞可以制备下述的剔除小鼠。将所捕获的内源基因分离出来后，可以在大肠杆菌中用定点诱变等方法向这一基因中引入细微突变(图8；“基因X’”)。可以使用诸如Kunkel方法，间隙双螺旋法等以及以这些方法为基础的其它方法向基因X中引入突变。例如可以用诱变试剂盒(例如突变体-K或突变体-G可从TakaraShuzo购得)进行定点诱变或用LA PCR体外诱变系列试剂盒引入突变。
第二步基因捕获是指将连接到lox66下游的突变内源基因引入ES细胞。通过这些步骤可以在第一步基因捕获中引入的捕获载体中的lox71位点和第二步中引入的载体的lox66位点之间发生重组。结果经修饰的基因可以由[(lox71/66)--(基因X’)-(loxP)]组成(图8)的盒的形式引入ES细胞。
按照这些方法，所引入的不仅是经修饰的内源基因还可以是人的基因。任何基因均可引入。在本发明中将这一方法命名为可交换的基因捕获。
3.捕获载体整合克隆的筛选(ES细胞)如果基因捕获载体引入了受体细胞即可从所得克隆中筛选新霉素抗性克隆，据认为这些克隆含有整合在小鼠内源基因下游的捕获载体。从这些克隆中抽提DNA进行Southern blotting分析，由此筛选有单拷贝捕获载体整合的克隆。本发明人发现这一筛选方法能够有效地筛选小鼠基因捕获克隆。因此这可在本发明中作为筛选系统。
(1)分离新霉素抗性克隆在本发明中可以用电穿孔，微注射等方法将捕获载体引入ES细胞。例如，通过电穿孔(用BioRad GenePulser在800V，和3μF下)将100μl捕获载体引入3×107悬浮于0.8ml磷酸盐缓冲盐液中的TT2ES细胞，所得细胞在G418(浓度为200μl)存在下培养，一周后分离新霉素抗性克隆。
基因捕获载体随机地整合进ES细胞基因组中。因此仅将该捕获载体引入ES细胞并不一定意味着整合到基因中。该载体也可能整合到非基因区。但是由于该载体包含药物抗性基因neo(新霉素抗性基因)，表达这一基因的细胞都是新霉素(也称为G418)抗性的。换句话说，这些在新霉素存在下能存活的细胞表达新霉素抗性基因。捕获载体上的新霉素抗性基因只有整合于在该ES细胞中表达的小鼠基因下游时才能表达。这样新霉素抗性基因的表达即意味着其已整合于某一基因的下游。
(2)通过整合方式筛选ES克隆通过常规的方法从ES细胞中抽提DNA，通过Southern blotting等方法分析整合方式。如果Southern blot的结果为一条带，则可以断定只有一个拷贝的载体整合进去了。由此筛选出以这种方式表达的DNA。进行这些操作是为了筛选那些在其中可以容易地通过质粒拯救分离小鼠内源基因的克隆。
4.通过生产嵌合动物建立捕获系(转基因动物)通过标准的方法生产嵌合动物(图9)。本发明中对所生产的嵌合动物的种类并没有特殊的限定。例如可列举出的动物有小鼠，大鼠，豚鼠，兔，山羊，绵羊，猪或狗等等。在本发明中小鼠是优选的，因为其容易操作和繁殖。
由新霉素抗性筛选出的ES细胞与来自动物的桑椹胚(即形成ES细胞和桑椹胚的聚合体)凝集以制备嵌合动物胚胎(例如那些发育为囊胚泡的)。所得的胚胎转入所饲育的已通过与不育雄雄性动物交配已进入假孕状态雌性动物的子宫中。如果上述动物是小鼠则转化17天后，子代小鼠即可出生。从子代动物中筛选嵌合动物。尽管那些具有高分额嵌合的很可能是种系嵌合动物，但还是需要将这样的嵌合动物与正常动物杂交进行确证。
接下来，嵌合动物与正常的雌性动物杂交获得F1代，由此建立突变动物系。下面的分析仅仅是对那些已作为捕获系(转基因动物)建立起来的动物进行的。而且，F1代的精子和用上述精子通过体外受精获得的两细胞阶段的胚胎可以通过超速冷冻技术冷冻保存起来。
(1)表达方式的分析将F1代动物杂交然后分析胚胎(对于小鼠是9.5-天胚胎)的表达方式和成年动物。
(2)表型分析对于每一个建立的动物系，分析其杂合和纯合动物的表型。通过肉眼观察，通过解剖内部观察，对每一器官的组织切片显微镜检，通过X射线照射检测骨骼系统，以及行为和记忆的检测和血液检测。
(3)所捕获基因的分离和结构分析以及染色体图谱的制备从捕获克隆中分离所捕获的DNA，鉴定其中的核酸序列(如下所述)。然后利用所得到的序列信息进行同源性比较。结果所捕获的DNA分别归于下列四组之一已知基因，ESTs(表达序列标签)未知基因或重复。如果该DNA是EST或未知基因，则可制备染色体图谱。可以通过荧光原位杂交(FISH)，用微卫星探针等进行相关分析，或通过照射分析杂交细胞来制备染色体图谱，。一旦DNA在染色体上的位置确定了，将这一位置与存在于突变小鼠中的突变基因的位置相比较，检验相关位置是否与它们之一相符合。
(4)数据库的构建对于每一个建立的种系，根据标记基因在胚胎(若为小鼠，10-天胚胎)和成年动物中的表达方式；F1和F2代动物的表型；所捕获的内源DNA的核酸序列；以及若该DNA是EST或未知基因，其在染色体上的位置建立数据库。
5.剔除动物本发明中的剔除动物是指通过处理使特定基因功能丧失的动物。所述的处理过程将在下文中描述。
可用于本发明中的动物包括小鼠，大鼠，豚鼠，兔，山羊，绵羊，猪和狗。在本发明中优选小鼠，这是由于小鼠易于操作和繁殖。
从基因组文库中或通过PCR从动物的ES细胞制备的基因组DNA中可获得含未知基因的基因组DNA片段。然后将该片段整合到本发明的捕获载体中。这一操作的结果是未知基因中外显子的功能遭到破坏。在捕获载体中，为了进行负筛选事先连上了胸腺嘧啶激酶(tk)基因或白喉毒素(DT)基因。通过电穿孔等方法将这一载体引入ES细胞。所得细胞在新霉素存在下培养进行正筛选和核酸类似物FIAU(氟代碘代腺苷尿嘧啶)或白喉毒素进行负筛选。通过这些筛选仅有捕获载体整合的ES细胞得以存留下来。在这些ES克隆中含已破坏的外显子的基因即被剔除了。所得细胞转入所饲育的雌性动物的子宫中。然后从子代动物中筛选嵌合动物。将这些嵌合动物与正常动物杂交获得杂合动物。然后通过杂合动物之间杂交获得纯合动物。
为确证得到了剔除小鼠，用X-射线照射F1代小鼠检测其骨畸形(例如形状改变)。或者也可以通过观察小鼠外表是否存在畸形，在解剖时观察各种组织和器官是否存在畸形来确证。也可以抽提组织中的RNA通过Northern blotting分析相关基因的表达方式来确证。如果有必要还可以采集血样进行血液检测和血清生化实验。
6.基因分离，重组载体构建和转化子的制备(1)基因的分离在本发明中上述的捕获基因可以进行克隆和结构分析。
可以通过常规的方法从捕获克隆中分离DNA。例如，若用捕获克隆中的mRNA进行克隆则首先用胍，酚等试剂处理该克隆，以从捕获克隆中抽提总RNA。用亲和柱的方法从总RNA中分离poly(A+)RNA(mRNA)，例如用寡脱氧胸苷纤维素或用含聚U-Sepharose的Sepharose2B作为载体，或者采用分批的方法。用这一mRNA作模板，以寡脱氧胸苷为引物由反转录酶合成单链cDNA。然后再将所得的双链cDNA插入合适的表达载体(如λgt11)即可构建cDNA文库。
依照上述所获得的基因易于测序。可以通过已知的方法，例如Maxam Gibert的化学修饰法或用DNA聚合酶以双脱氧核酸链终止法进行测序。通常所述基因的序列通过自动测序仪进行确定。当相关基因的5’端和3’端不确定时，全部的核酸序列可以通过5’RACE或3’RACE来鉴定。RACE(cDNA末端快速扩增法)是本领域的公知技术(Frohman，M.A.等Methods Enzymol.Vol.218，pp.340-358(1993))，进行RACE的试剂盒是可商购的(MarathonTMcDNA扩增试剂盒，Clontech)。一旦本发明的基因的核酸序列确定了，该基因即可通过化学合成或用根据这一序列合成的引物进行PCR而获得该基因。
(2)重组载体的构建纯化所需的DNA片段并与载体DNA相连接。对于载体，任何载体均可使用，例如噬菌体载体或质粒载体。将所需的DNA连接到载体上是本领域所公知的技术(J.Sambrook等Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。进而由所得载体构建重组载体并将其引入大肠杆菌等。筛选合适的克隆以制备所需的重组载体。
(3)转化将本发明的重组载体引入使所需基因能够表达的宿主中以获得本发明的转化子。对于宿主并没有特殊的限定，只要其能表达本发明的DNA。宿主的特定实例包括细菌，酵母，动物细胞和昆虫细胞。
当用细菌例如大肠杆菌作为宿主时，优选本发明的载体能在宿主中自我复制，且由启动子，核糖体结合序列，本发明的基因和转录终止序列组成。还可以包括控制启动子的基因。大肠杆菌的特异例子包括大肠杆菌K12和DH1，芽孢杆菌的例子包括枯草芽孢杆菌。关于启动子，可以使用任何启动子只要它能指导所需基因在如大肠杆菌等宿主中表达即可。举例来说，来自大肠杆菌或噬菌体的启动子，例如trp启动子，lac启动子，PL启动子和PR启动子均可以使用。也可以使用人工设计和修饰的启动子，例如tac启动子。关于将重组载体引入细菌宿主的方法，任何将DNA引入细菌中的方法均可以使用。例如用钙离子法(Cohen，S.N.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，692110-2114(1972))，电穿孔法(Becker，D.M.等Methods Enzymol.，194182-187(1990))之类。
当用酵母作为宿主时，可以使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Shizosaccharomyces pombe)等。作为启动子，只要其可指导所需基因在酵母中表达均可以使用。例如gal1启动子gal10启动子，热激蛋白启动子，MFα1启动子，PH05启动子，PGK启动子，GAP启动子，ADH启动子和AOX1启动子都是可列举出的例子。作为向酵母中引入重组载体的方法，任何向酵母中引入重组载体的方法均可以使用。例如电穿孔法，原生质体转化法(Hinnen，A.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929-1933(1978)，)醋酸锂转化法(Itoh，H.，J.Bacteriol.，153163-168(1983))等都可以使用。
当用动物细胞作为宿主细胞时，COS细胞，Vero细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，小鼠骨髓瘤细胞等皆可使用。可以用作启动子的有SRα启动子，SV40启动子，LTR启动子，EF1启动子，PGK启动子，MC1启动子等。另外，人巨细胞病毒早期基因启动子等也可以使用。作为向动物细胞中引入重组载体的方法，电穿孔法，磷酸钙法，脂质转染法等皆可使用。
当将昆虫细胞用作载体时，可以使用Sf9细胞，Sf21细胞等。作为向昆虫细胞中引入重组载体的方法，磷酸钙法，脂质转染法，电穿孔法等皆可使用。
附图的简要描述图1示出基因区和非基因区结构分析的内容。
图2简要描述了捕获载体的构建要点和依照本发明的基因捕获。
图3示出loxP的结构。
图4示出lox71和lox66之间的重组。
图5当使用loxP序列时DNA片段的插入。
图6示出本发明的载体。
图7是捕获载体pU-Hachi的构建流程图。
图8示出本发明的两步可交换基因捕获法。
图9通过生产嵌合动物来建立捕获系的要点。
图10示出捕获载体上的多个整合位点。
图11是小鼠尾骨弯曲突变的照片。
实施本发明的最佳方式下面参考实施例对本发明进行更加详细的描述。值得注意的是本发明的技术范围并不局限于这些实施例。
实施例1多种基因捕获载体的构建(1)pU-Hachi捕获载体的构建pU-Hachi源于pGT1.8IRES β-geo，并包含小鼠En-2基因的SA序列和与脑心肌炎病毒的IRES序列相连的β-geo序列。首先lox7 1的BamHI片段插入pGT1.8IRESβ-geo的BglII位点。然后将180bp(SP)序列(兔β球蛋白基因的一部分)，loxP序列，小鼠磷酸甘油酸激酶-1的polyA附加信号插入到经修饰后去除了lacZ序列的载体pUC19中构建质粒pEBN-SE7ti。SP序列用于保护捕获载体的3’末端。将SA-IRES-lox7 1-β-geo的SalI片段插入pEBN-SE7ti的SalI位点，即获得了pU-Hachi。
(2)pU-12捕获载体的构建为构建pU-12捕获载体，首先用嘌呤霉素抗性基因+PGK poly(A)信号替换pE3NSE7的PGK poly(A)信号。然后将lox511插入到BglII位点下游构建一个质粒。将pU-Hachi中SA-IRES-lox7 1-β-geo上的SalI片段插入上述质粒的SalI位点，即构建了pU-12。
(3)捕获载体pU-17的构建首先将lox511，loxP，PGK poly(A)信号和lox2272依次插入质粒pSP73(Promega)构建质粒pSP5PP2。接下来，从pU-Hachi的SA的两个BamHI位点中位于上游的一个BamHI位点处将pU-Hachi切开。到pU-Hachi的SA中位于上游的BamHI位点的一段DNA片段，lox71序列，从pU-Hachi的SA中位于下游的BamHI位点到KpnI位点的一段DNA片段，和β-geo的NcoI-SalI片段依次插入pBluescriptII KS+质粒中以构建质粒pSK+S71Aβ-geo。从这一质粒中切除包括lox71的SA-β-geo的一段XbaI片段将其插入pSP5PP2的Spe I位点以构建pU-17。
实施例2ES细胞克隆的筛选以pU-Hachi捕获载体，100μg用SpeI消化的DNA和3×107的细胞进行电穿孔实验。细胞悬浮于0.8ml的PBS中用BioRadGenePulser在800V和3μF的条件下进行电穿孔。48小时后，将细胞在200μg/ml G418存在下进行培养。这一筛选要持续7天。所得克隆置于24-孔培养板中繁殖并将所得克隆冷冻保存。通过Southernblotting分析捕获克隆以筛选那些以单拷贝方式整合的细胞株。
为了从该捕获克隆中去除β-geo序列，将pCAGGS-Cre(Zraki，K.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92160-164，1995；Araki，K.等Nucl.Acids Res.，25868-872，1997；Arake，K等，J.Biochem.Tokyo，122977-982，1997)以环状的形式进行电穿孔。除所用细胞的数量为1.5×107、PBS的体积为0.4ml外，电穿孔的条件与上述相同。
将一半经上述方式处理过的细胞置于100mm的平皿上培养48小时。然后以1×103细胞每皿的浓度将上述细胞重新涂布于100mm的平皿上以形成克隆。一周后，挑出克隆进行扩增以制备DNA。
在为将捕获载体靶向整合到lox71位点而设计的共电穿孔中，每种靶向质粒(p662IEGPPac，p662INZPPac or p66PGKPac-5)的用量为20μg，且pCAGGS-Cre为环状形式。
将lox66片段和PGK启动子-嘌呤霉素抗性基因编码序列插入到pSP73载体(Promega)中以构建质粒p66PGKPac-5。由pSP73载体(Promega)，IRES序列，EGFP基因(Clontech)，PGK启动子，Pca基因and lox66序列构建p662IEGPPac质粒。质粒p662INZPPac是用与SV40大T基因衍生的核定位信号相融合的lacZ基因替换p662IEGPPac中的PGK基因而构建的。
将细胞悬浮于PBS(1×107cells/0.8ml)中，在200V和950μF的条件下进行电穿孔。48小时后以2μg/ml嘌呤霉素用3天的时间筛选所得细胞。然后将细胞转入正常的培养基中。电穿孔后9天将克隆挑出进行扩增。
用已知的方法生产胚胎体(EBs)(Abe，K.，Niwa，H.等，Exp.Cell Res.22927-34，1996)。按照(Glossler，A.and Zachgo，J.，基因捕获A Practical Approach，Joyner，A.(ed.)，OxfordUniversity Press，Oxford，1993，pp.151-227)中所介绍的方法用5-溴-4氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)染色以鉴定ES细胞和EBs中的β-半乳糖苷酶活性。
将捕获载体pU-Hachi线性化引入TT2ES细胞。结果分离出109个克隆。制备每一克隆的基因组DNA以pUC探针进行Southernblotting，并且用至少3种限制酶检验捕获载体整合方式。
经鉴定69％的克隆为一条带。由于lox71位点的存在对于Cre-介导的整合是必需的，因此通过PstI消化以及用lacZ为探针进行Southern blotting对此进行了验证。结果发现10％的克隆中缺失lox71。将余下59％的单拷贝整合且保留了lox71位点的克隆筛选出来做进一步的分析。
表4
为鉴定用捕获载体对内源基因进行的捕获，在胚胎体形成前后用X-gal将细胞染色。如表5所示，所检测的克隆中有97％在分化的特定阶段表现出β-gal活性。这意味着与其它IRES-β-geo载体相比，pU-Hachi捕获载体可执行有效的基因捕获。
表5
实施例3克隆的选择效率为选择那些整合了单拷贝捕获载体的克隆，从所筛选的新霉素抗性克隆中抽提DNA进行Southern blotting分析。
简要地说，用SDS/蛋白酶K裂解细胞，酚/氯仿(1∶1体积比)处理两次后用乙醇沉淀，再溶于TE缓冲液中(10mM Tris-HCl，pH7.5/1mM EDTA)。用合适的限制酶消化6微克基因组DNA，在0.9％的琼脂糖凝胶上电泳后印记到尼龙膜(Boehringer Mannheim)上。用DIG DNA标记检测试剂盒(Boehringer Mannheim)进行杂交。
对于PCR分析，将DNA在下述缓冲液中按94℃下变性1分钟，55℃下退火2分钟72℃延伸2分钟的程序循环反应28次。
PCR中所用的引物如下β-geo检测引物Z1(正向)5’-gcgttacccaacttaatcg-3’(SEQ ID NO7)Z2(反向)5’-tgtgagcgagtaacaacc-3’(SEQ ID NO8)检测pUC载体中复制起点区域的引物Ori2(正向)5’-gccagtggcgataagtcgtgtc-3’(SEQ ID NO9)Ori3(反向)5’-cacagaatcaggggataacgc-3’(SEQ ID NO10)反应溶液
将一半的PCR产物上样于琼脂糖凝胶进行分析。
质粒拯救(即恢复所捕获的基因)按如下方式进行。
简要地说，用合适的内切酶消化基因组DNA(20μg)后以400μl反应体积进行连接以获得环状分子。酚/氯仿抽提后乙醇沉淀，所得DNA悬浮于10μl TE中。用一半的上述DNA悬浮液通过电穿孔转化大肠杆菌(STBL2；生命技术)依照BioRad GenePulser手册进行电穿孔。将经电穿孔的细胞在循环生长培养基中于30℃下震荡1小时。浓缩后将样品涂布与LB/琼脂平板上利用氨苄进行筛选。对所拯救的质粒进行酶切图谱分析和序列测定。用热测序酶荧光标记引物循环测序试剂盒(Amersham)测定核苷酸的序列。结果，如表6所示获得了存在高频率重组的克隆。
表6
实施例4嵌合小鼠的生产和基因分析(1)将克隆引入小鼠将捕获ES克隆与来自ICR小鼠8细胞阶段的胚胎相凝集，培养过夜。第二天将已形成囊胚的ES细胞与胚胎的凝集物挑选出来。这些嵌合胚胎中的约20个转入所饲养的已与不育雄鼠预交配的雌性小鼠的子宫。17天后子代小鼠出生。出生后8周若已达到性成熟，即将这些嵌合小鼠与正常的雌性小鼠杂交以获得ES克隆衍生的F1代小鼠。
(2)表型分析对F1代小鼠进行X-射线照射，观察到骨骼中存在畸形缺陷。
(3)所捕获基因的分析由于所捕获的基因一定与β-geo形成融合mRNA，这一推定可以用于鉴定所捕获的基因。
简要地说，从X-gal染色呈阳性的F1代小鼠组织中抽提mRNA。由所抽提的mRNA用Thermoscript RT-PCR系统(GIBCO BRL)以SA内的序列为引物合成单链cDNA。接下来，可以用5’RACE系统(GIBCOBRL)获得相应于与该载体上SA中外显子相连的所捕获基因上游的一段cDNA片段。将所得cDNA片段克隆到质粒载体上进行测序。
(4)结果表7示出对所捕获基因的分析结果的例子表7
在上述所获得的基因中，分析了PCM1基因。结果获得了在SEQ IDNOS11到13(5’RACE部分序列)中示出的序列。这些序列与已知的PCM1基因部分匹配。而且，Ayu8-021克隆所获得的小鼠表现出尾骨弯曲的突变(弯曲的尾)(图11)。对这一突变的基因片段进行测序获得了如SEQ ID NO14所示的序列。
在本发明的说明书中所提及的所有出版物，专利和专利申请均全文引入作为参考。
工业实用性本发明提供了基因捕获载体和基因捕获方法。依照本发明，第一(1)可以有效地生产剔除小鼠。在大多数情况下，通过将捕获载体整合到基因中可将小鼠基因剔除。因此，用捕获载体诱导的ES细胞可以生产鼠基因剔除的小鼠。通过筛选新霉素抗性克隆，再在这些克隆中筛选整合了单拷贝捕获载体的克隆即可有效地生产剔除小鼠。按照传统的同源重组法，一个研究人员一年最多可以生产4个剔除小鼠鼠系。而按照本发明的方法，作为一个研究人员，如果他/她每周建立6系，一年工作40周则可以建立240个小鼠鼠系。这样本发明的方法比传统的方法效率高出60多倍。
(2)利用本发明的方法还可以详细地分析基因的功能在本发明的基因捕获方法中，可以事先在一个看来具有某种功能的基因的任何部分诱导突变，将所得的突变基因整合到载体中。然后将整合了突变基因的载体引入小鼠再分析其表型。
(3)利用本发明的方法可以生产与人密切相关的疾病的模型小鼠依照本发明的方法，可以将具有与在人类疾病中发现的相同突变的人类基因引入小鼠中替换相应的小鼠基因，由此创建比传统模型更接近人的疾病模型小鼠。
纯文本的序列表SEQ ID NO1合成DNASEQ ID NO2合成DNASEQ ID NO3合成DNASEQ ID NO4合成DNASEQ ID NO5合成DNASEQ ID N06同源重组序列SEQ ID NO7合成DNASEQ ID NO8合成DNASEQ ID NO9合成DNASEQ ID NO10合成DNA
参考文献(1)与基因捕获相关的1)Wurst，W.等.，Genetics 139889-899，1995.
2)Chowdhury，K.等.，Nucleic Acids Res.251531-1536，1997.
3)Hicks，G.G.等，Nature Genetics 16338-344，1997.
4)Zarnbrowicz，B.P.等.，Nature 392608-611，1998.
(2)与Cre-loxP系统相关的1)Sauer，B.and Henderson，N.Proc.Nati.Acad.Sci.USA855166-5170，1988.
2)Lakso，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896232-6236，1992。
3)Gu，H.等，于1993年证明的在个体转换区域免疫球蛋白转换重组的独立控制。
4)Albert，H.等.，Plant J.7649-659，1995.
5)Scbwenk，F.等.，Nucleic Acids Res.235080-5081，1995.
(3)与基因捕获相关的参考文献列表1)Miyazaki，J.等，Gene 79269-277，1989.
2)Niwa，H.等，Gene 108193-200，1991.
3)Niwa，H.等，J.Biochem，113343-349，1993.
4)Niwa，H.等，Gene 169197-201，1996，5)Abe，K.，Niwa，H.等.，Exp.Cell Res.22927-34，1996.
6)Araki，K.等，Nuc]eic Acid Res.25868-872，1997.
7)Araki，K.等，J.Biochem.122977-982，1997.
8)Oike，Y等，Human Mol.Genet-In Press9)Oike，Y等，Blood in press
序列表<110>株式会社基因转移(TRANSGENIC INC.)<120>捕获载体及用该载体进行基因捕获的方法<130>PH-976PCT<150>JP99/200997<151>1999-07-14<160>16<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>1taccgttcgt ata 13<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>2tatacgaacg gta 13<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA
<400>
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>4ataacttcgt ata13<210>5<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>5tatacgaagt tat13<210>6<211>34<212>DNA<213>其他<220>
<223>同源重组序列<400>6taccgttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA
<400>7gcgttaccca acttaatcg 19<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>8tgtgagcgag taacaacc 18<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>9gccagtggcg ataagtcgtg tc 22<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>10cacagaatca ggggataacg c 21<210>11<211>400<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<400>11agaaacttaa acagcggata aacttcagtg atttanatca gagaagtatt ggaagtgatt 60
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<223>人工序列说明合成DNA<400>16ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 3权利要求
1.一种基因捕获方法，其包括将一种捕获载体引入胚胎干细胞中，所述捕获载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列1的一部分是突变的。
2.一种基因捕获方法，其包括将一种捕获载体引入胚胎干细胞中，所述捕获载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列2的一部分是突变的。
3.一种基因捕获方法，其包括向胚胎干细胞中引入(a)一种捕获载体，该载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列1的一部分是突变的；和(b)一种捕获载体，该载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列2的一部分是突变的。
4.一种通过基因捕获方法产生的胚胎干细胞，所述方法包括向非人类胚胎干细胞中引入捕获载体，其中捕获载体选自下列(a)至(i)(a)SP-SA-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(b)SP-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(c)SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP；(d)SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP；(e)lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(f)lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(g)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(h)(整合了lox71的SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；和(i)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-启动子-M-lox511-SD；其中SP代表任意序列；SA代表剪接受体；SD代表剪接供体；IRES代表内部的核糖体进入位点；M代表标记基因；puro代表嘌呤霉素抗性基因；pA代表poly(A)序列；PV代表质粒载体。
5.权利要求4的胚胎干细胞，其中质粒载体选自pBR、pUC、pSP和pGEM中的任一种。
6.一种胚胎干细胞，它是通过权利要求1-3中任一项的方法产生的。
7.一种非人类转基因动物细胞，其包含选自下列(a)至(i)的载体(a)SP-SA-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(b)SP-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(c)SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP；(d)SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP；(e)lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(f)lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(g)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(h)(整合了lox71的SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；和(i)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-启动子-M-lox511-SD；其中SP代表任意序列；SA代表剪接受体；SD代表剪接供体；IRES代表内部的核糖体进入位点；M代表标记基因；puro代表嘌呤霉素抗性基因；pA代表poly(A)序列；PV代表质粒载体。
8.权利要求7的非人类转基因动物细胞，其中质粒载体选自pBR、pUC、pSP和pGEM中的任一种。
9.一种非人类转基因动物细胞，其包含一种载体，所述载体是通过下列(a)和(b)重组产生的(a)一种捕获载体，该载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列1的一部分是突变的；和(b)一种捕获载体，该载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列2的一部分是突变的。
10.权利要求9的非人类转基因动物细胞，其中所述载体不能与其它loxP序列进行重组。
11.权利要求7-10中任一项的非人类转基因动物细胞，其中所述的动物细胞是小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、绵羊或山羊细胞。
12.一种非人类转基因动物细胞，其中所述动物是通过向非人类动物引入一种胚胎干细胞而产生的，所述胚胎干细胞包含选自下列(a)至(i)的载体(a)SP-SA-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(b)SP-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(c)SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP；(d)SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP；(e)lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(f)lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(g)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(h)(整合了lox71的SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；和(i)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-启动子-M-lox511-SD；其中SP代表任意序列；SA代表剪接受体；SD代表剪接供体；IRES代表内部的核糖体进入位点；M代表标记基因；puro代表嘌呤霉素抗性基因；pA代表poly(A)序列；PV代表质粒载体。
13.权利要求12的非人类转基因动物细胞，其中质粒载体选自pBR、pUC、pSP和pGEM中的任一种。
14.一种非人类转基因动物细胞，其中所述动物是通过将一种胚胎干细胞引入非人类动物而产生的，所述胚胎干细胞包含通过下列(a)和(b)重组产生的载体(a)一种捕获载体，该载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列1的一部分是突变的；和(b)一种捕获载体，该载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列2的一部分是突变的。
15.权利要求9的非人类转基因动物细胞，其中所述载体不能与其它loxP序列进行重组。
16.一种非人类转基因动物细胞，其中所述动物是通过将一种胚胎干细胞引入非人类动物而产生的，所述胚胎干细胞是通过基因捕获方法产生的，所述基因捕获方法包括向非人类胚胎干细胞中引入捕获载体，所述捕获载体选自下列(a)至(i)(a)SP-SA-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(b)SP-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(c)SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP；(d)SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP；(e)lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(f)lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(g)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(h)(整合了lox71的SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；和(i)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-启动子-M-lox511-SD；其中SP代表任意序列；SA代表剪接受体；SD代表剪接供体；IRES代表内部的核糖体进入位点；M代表标记基因；puro代表嘌呤霉素抗性基因；pA代表poly(A)序列；PV代表质粒载体。
17.权利要求16的非人类转基因动物细胞，其中质粒载体选自pBR、pUC、pSP和pGEM中的任一种。
18.一种非人类转基因动物细胞，其中所述动物是通过将一种胚胎干细胞引入非人类动物而产生的，所述胚胎干细胞是通过权利要求1-3中任一项的方法产生的。
19.一种非人类剔除动物细胞，其包含选自下列(a)至(i)的载体(a)SP-SA-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(b)SP-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(c)SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP；(d)SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP；(e)lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(f)lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(g)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(h)(整合了lox71的SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；和(i)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-启动子-M-lox511-SD；其中SP代表任意序列；SA代表剪接受体；SD代表剪接供体；IRES代表内部的核糖体进入位点；M代表标记基因；puro代表嘌呤霉素抗性基因；pA代表poly(A)序列；PV代表质粒载体。
20.权利要求19的非人类剔除动物细胞，其中质粒载体选自pBR、pUC、pSP和pGEM中的任一种。
21.一种非人类剔除动物细胞，其包含通过下列(a)和(b)重组产生的载体(a)一种捕获载体，该载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列1的一部分是突变的；和(b)一种捕获载体，该载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列2的一部分是突变的。
22.权利要求21的非人类剔除动物细胞，其中所述载体不能与其它loxP序列进行重组。
23.权利要求19-22中任一项的非人类剔除动物细胞，其中所述的动物细胞是小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、绵羊或山羊细胞。
24.一种非人类剔除动物细胞，其中所述动物是通过将一种胚胎干细胞引入动物而产生的，所述胚胎干细胞包含选自下列(a)至(i)的载体(a)SP-SA-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(b)SP-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(c)SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP；(d)SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP；(e)lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(f)lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(g)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(h)(整合了lox71的SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；和(i)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-启动子-M-lox511-SD；其中SP代表任意序列；SA代表剪接受体；SD代表剪接供体；IRES代表内部的核糖体进入位点；M代表标记基因；puro代表嘌呤霉素抗性基因；pA代表poly(A)序列；PV代表质粒载体。
25.权利要求24的非人类剔除动物细胞，其中质粒载体选自pBR、pUC、pSP和pGEM中的任一种。
26.一种非人类剔除动物细胞，其中所述动物是通过将一种胚胎干细胞引入动物而产生的，所述胚胎干细胞包含通过下列(a)和(b)重组产生的载体(a)一种捕获载体，该载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列1的一部分是突变的；和(b)一种捕获载体，该载体包含loxP序列，该序列依次包含倒转重复序列1、间隔序列和倒转重复序列2，所述loxP序列是突变loxP序列，其中所述倒转重复序列2的一部分是突变的。
27.权利要求26的非人类剔除动物细胞，其中所述载体不能与其它loxP序列进行重组。
28.一种非人类剔除动物细胞，其中所述动物是通过向非人类动物引入一种胚胎干细胞而产生的，所述胚胎干细胞是通过基因捕获方法产生的，所述基因捕获方法包括向非人类胚胎干细胞中引入捕获载体，所述捕获载体选自下列(a)至(i)(a)SP-SA-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(b)SP-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP；(c)SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP；(d)SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP；(e)lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(f)lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(g)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；(h)(整合了lox71的SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511；和(i)(整合了lox71的SA)-M-loxP-pA-lox2272-启动子-M-lox511-SD；其中SP代表任意序列；SA代表剪接受体；SD代表剪接供体；IRES代表内部的核糖体进入位点；M代表标记基因；puro代表嘌呤霉素抗性基因；pA代表poly(A)序列；PV代表质粒载体。
29.权利要求28的非人类剔除动物细胞，其中质粒载体选自pBR、pUC、pSP和pGEM中的任一种。
30.一种非人类剔除动物细胞，其中所述动物是通过向非人类动物引入一种胚胎干细胞而产生的，所述胚胎干细胞是通过权利要求1-3中任一项的方法产生的。
全文摘要
一种包含突变的loxP序列的捕获载体，其中loxP序列由倒转重复序列1，间隔序列和倒转重复序列2依次构成的，所述的倒转重复序列1或2的部分被转移了一种突变。
文档编号C12N15/63GK1721529SQ20051008446
公开日2006年1月18日 申请日期2000年5月2日 优先权日1999年7月14日
发明者山村研一, 荒木喜美 申请人:株式会社基因转移