专利名称：一种骨骼肌特异性capn3启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子遗 传学领域，具体涉及了一种骨骼肌特异性表达基因5'调控区特异性启动子及其在转基因猪中的应用。
背景技术：
真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达的调节由转录因子特异性结合于调控区相关元件，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究模式。在特异高效表达的转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达，必须构建一个可以特异高效表达的动物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。钙蛋白酶3(CalpaStatin 3，CAPN3)是典型的组织特异性钙蛋白酶，主要存在于肌Z线处，是导致肌原纤维蛋白降解的关键因素，与骨骼肌生长代谢密切相关，利用其基因调控区的相关元件构建骨骼肌特异性表达载体是一种有效的方法。但是上述的研究均还处在起步阶段，对于转基因猪的培育和肉品品质的提高均没有起到较好的促进作用。
发明内容
基于上述的原因，本发明的发明人经过研究发现猪钙蛋白酶3基因5'调控区具有骨骼肌特异性启动特性，并利用这一特性设计了一种骨骼肌特异性表达启动子载体，该启动子可以在转基因猪的培育中应用。该启动子载体具有骨骼肌特异性启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该启动子在骨髂肌中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为转基因载体提供了一种重要的元件。本发明所提供的骨骼肌特异性表达基因5'调控区特异性启动子，其基因序列如 Seq IDNo 1 所示；除了上述的启动子之外，还可以是该启动子的变体或者片段，均具有如Seq ID No 1所示的基因序列。“变体”是指对猪CAPN3启动子Seq ID No :1序列进行一个或者多个碱基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或者添加所产生的序列，该序列仍然表现出类似于Seq ID No 1序列的活性。“片段”是指基本DNA序列的一个或者多个区域，其仍然类似于猪CAPN3启动子Seq IDNo 1的活性。具有上述序列的启动子或其变体，或者片段，具有骨骼肌特异性启动特性，而在骨骼肌之外的多种细胞中均无启动活性，该基因启动子在骨骼肌中能特异性地启动下游基因的表达，可以满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，并能应用于转基因猪的培育中。应用上述的核酸时，一般采用重组核酸序列，其中含有上述的启动子或其变体，或者片段，这样就可以使于启动子下游的目的基因在骨骼肌中特异性表达，作为分析、开发、 改造骨骼肌特性的研究模型。还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目的基因的重组核酸，通过显微注射等基因导入技术获得转基因胚胎，用于建立转基因动物。重组核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一种功能基因，主要包括提高肌肉品质基因，加快生长速度基因，抗病基因，提高饲料报酬的基因以及生产特定药物的基因，这样就 可以在获得骨骼肌特异性启动特性之外，提高该重组核酸序列的性能，为转基因猪的培养提供更多的功能性方向，增加其附加产值，如将去饱和脂肪酸酶基因在该启动子指导下表达可以特异性提高骨骼肌中不饱和脂肪酸的含量，提高肉品营养价值。在获得了上述的重组核酸序列之后，还可以用其建立特殊的表达系统，以便更好的应用于转基因猪的培育过程。将目的基因重组至该启动子下游，通过基因转入技术使调控区与目的基因共同整合进染色体中，获得转基因动物，在该启动子作用下目的基因仅在骨骼肌中表达，在其他组织器官中不表达，降低目的基因对动物的影响，提高转基因的效 本发明主要通过报告基因分析确定该启动子的启动特征。首先构建无启动子绿色荧光蛋白载体，为保证报告基因正确翻译，在绿色荧光蛋白基因上游插入内部核糖体进入位点(IRES)。然后通过PCR或者片段捕获等技术获得骨骼肌中特异性表达的钙蛋白酶 35'调控区，长度为1059bp，插入内部核糖体位点上游，得到启动子报告基因分析载体，将 CMV启动子(589bp)连入空载体中作为阳性对照，空载体为阴性对照。质粒去内毒素后，转染C2C12小鼠成肌细胞系，同时转染猪原代肾上皮细胞等多种细胞为对照，转染24h后更换含马血清的诱导培养基至成肌细胞，诱导细胞分化融合，48h后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，分析启动子特性。当上述的启动子，或者重组核酸序列或者表达系统被应用到转基因猪的培育中后，可以有效的提高培育的效果，且通过添加各种功能性基因，使得转基因猪可以获得更好的肌肉品质，更高的生长速度，更好的抗病性以及降低饲养成本，还可以在特定药物的生产中得到更为广泛的应用，对于该领域的研究有着很好的参考价值。
图1为CAPN3F和CAPN3R弓丨物PCR扩增CAPN35 ‘调控区片段电泳图，泳道1为PCR 产物，M 为 DL2000Maker ；图2为无启动子CMV Enhancer-IRES-AcGFP载体图谱；图 3 为转染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h 小鼠 C2C 12 细胞照片，左侧为200倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP 表达，CAPN3Promoter有启动活性；图 4 为转染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h 猪 PIEC 细胞照片，左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，无GFP表达，CAPN3Promoter无启动活性；
图 5 为转染 CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h 猪 PIEC 细胞照片，
左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP 表达，转染技术有效；图 6 为转染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h 大鼠心肌细胞系 H9c2照片，左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，无GFP表达，CAPN3Promoter无启动活性；图7为转染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h大鼠心肌细胞系H9c2照片，左侧为 100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP表达，转染技术有效；图 8 为转染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h 小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1照片，左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片， 无GFP表达，CAPN3Promoter无启动活性；图9为转染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1照片， 左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP表达，转染技术有效；图 10 为转染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 4他人肝细胞系 HL-7702照片，左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，无 GFP表达，CAPN3Promoter无启动活性；图11为转染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h人肝细胞系HL-7702照片，左侧为 100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP表达，转染技术有效；图 12 为转染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h 原代猪肾细胞照片，左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，无GFP表达， CAPN3Promoter无启动活性；图13为转染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h原代猪肾细胞照片，左侧为200倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP表达，转染技术有效；
具体实施例方式在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。实施例1无启动子IRES-AcGFP载体构建为了避免分析序列中ATG对报告基因翻译的影响，保证下游报告基因GFP的正确表达，特构建无启动子IRES-AcGFP载体，该载体包含一个内部核糖体进入元件，该方法有利于保留转录起始位点下游的调控元件，可以获得更大的调控区分析区间。以 pIRES2-AcGFPl为骨架，用Ase I.Nhe I酶切，回收4723bp片段，得到无CMV启动子的载体； PCR扩增CMV Enhancer元件，下游引物加入Xba I酶切位点及保护性碱基，加粗表示。CMV Enhancer Forward 核酸序列如 Seq ID No :2 所示,CMV Enhancer Reverse 核酸序列如 Seq ID No 3 所示。
引.物名称引物序列载体位置
CMV Enhancer ForwardGGATAACCGTATTACCGCCATGC1
CMV Enhancer Reverse_GCTCTAGACAAAACAAACTCCCATTG485_按照如下体系配制PCR反应液
2 χ PrimeSTAR GC Buffer 10 μ
dNTP Mixture ( 2.5 mM each)2 μ
CMV Enhancer Forward0.3μΜ ( final conc.)CMV Enhancer Reverse0.3μΜ ( final conc.) pIRES2-AcGFPl 质粒DNA1 ng PrimeSTAR HS DNA Polymerase ( 2.5 U/μΙ)0.2 μ H2O补足至20 μ PCR程序设定如下
95 "C 40 sec -η60°C 15 sec31Cycles 72 °C 40 sec _将扩增后的产物与6 X Loading buffer混合上样至1 % TAE琼脂糖凝胶，5V/cm 电泳20min后切胶回收目的片段，按Axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物，用AseI (Fermentas)和Xba I (Fermentas)酶切纯化产物，酶切之后琼脂糖切胶回收得到粘性末端的CMV Enhancer，将CMV Enhancer元件与酶切后的载体用Rapid DNA Ligation (Fermentas)连接，克隆转化，获得含CMV Ehancer无启动子的pIRES-AcGFP，该载体同时作为阴性对照载体。将完整的CMV启动子正向连入该载体中，得到阳性对照载体。将包含阴性对照和阳性对照载体的菌液按照1 500的比例分别接种至含卡那霉素50 μ g/ ml LB培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4°C 6000 Xg收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN)说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1. 8-1. 9之间。实施例2启动子报告基因载体的构建基因组提取取大约克夏猪耳组织，按照TIANamp genomic DNA (天根)试剂盒说明书进行基因组DNA提取。跟据NCBI (Gene ID :NW_003299273. 1)设计如下，上下游引物加入Bgl II酶切位点及保护性碱基，加粗表示，CAPN3F核酸序列如Seq ID No 4所示，CAPN3R核酸序列如Seq IDNo 5 所示。
引物名称引物序列位置
CAPN3F GAAGATCTTCGTCTCCTTACAGCCTGGGTAG_1059
CAPN3R GAAGATCTTCGATACGGCTACCTTTAAGGAAAG “1
按照如下体系配制PCR反应液
权利要求
1.一种骨骼肌特异性CAPN3启动子，其特征在于该启动子的基因序列如％(1 ID No 1所示。
2.一种重组核酸序列，其特征在于序列中包含有基因序列如kq ID No :1所示的启动子或者该启动子的变体，或者片段。
3.根据权利要求2所属的重组核酸序列，其特征在于序列中还包含有至少一种功能基因，所述功能基因包括提高肌肉品质基因或加快生长速度基因或抗病基因或提高饲料报酬的基因或生产特定药物的基因或其组合。
4.一种表达系统，其特征在于包含有如权利要求2或3所述的重组核酸序列。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种骨骼肌特异性启动子及其应用，特别提供了一种骨骼肌特异性表达基因5′调控区特异性启动子及其在转基因猪中的应用，该启动子只在骨骼肌中具有启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子只在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，因此能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为通过转基因技术来提高猪肉的品质提供了一种重要的元件。
文档编号C12N15/85GK102154288SQ20101061712
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者姜运良, 康丽, 张旭, 张渝洁, 梁森 申请人:山东农业大学