miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，属于细胞生 物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 骨骼肌卫星细胞是肌组织的前体细胞、可塑性强，具有骨骼肌的许多重要生物特 性，肌卫星细胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌细胞肥大、数目增多以及肌纤维转化的重 要机制.骨骼肌卫星细胞增殖分化过程十分复杂，涉及到大量基因的表达及网络调控。 研宄证实，miRNA在肌肉发育和肌细胞增殖与分化中发挥了关键性的调控作用（Luo et al.，2013)。因此研宄miRNA在肌肉发育和肌细胞增殖与分化中分子机制可为肌肉损伤修 复、肌肉再生等其他领域学科研宄提供重要的理论基础，在改良家畜肌肉品质的畜牧业生 产领域中具有广阔的应用前景。本研宄对牛的骨骼肌卫星细胞进行分离，建立其体外培养 的方法，并诱导分化使其成为肌细胞，对骨骼肌细胞中的标志性分子肌球蛋白重链和结蛋 白进行免疫荧光染色，以证明分离的骨骼肌卫星细胞的性质和纯度。肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MHC)是肌球蛋白的组成成分之一，是构成骨骼肌纤维内粗肌丝的主要成分， 是骨骼肌纤维中表达最多的蛋白，是肌肉分化的指标之一。结蛋白（Desmin)是肌组织中 重要的中等径骨架纤维蛋白，其在肌肉形态的形成与维持、细胞之间的信息传递、肌细胞分 化调控等多方面具有非常重要的意义，由于专一性地出现在肌肉细胞及肌细胞来源的肿瘤 细胞里，在平滑肌、骨骼肌和心肌细胞中表达，在维持肌细胞的完整性以及肌小节之间的 信息传递中发挥作用（Li et al.，1993)。所以目前认为它可以作为肌肉分化的指标，用 于发育生物学的研宄。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA， 是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶[该酶是一种核糖核酸 内切酶，属于RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐 步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为 19-21bp的双链RNAs(d SRNAs)，每个片段的3'端都有2个碱基突出。以上内容出自好搜百 科http://baike. haosou. com/doc/5447817-5686185. html]加工后生成。其在细胞内具有 多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基 因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个 miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研宄的逐步深入， 将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。miRNA广泛 存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框（ORF)。 成熟的miRNA，5^端有一个磷酸基团，3'端为羟基。编码miRNAs的基因最初产生一个长 的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA 前体（pre-miRNA)并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA5r端的磷酸基团和3'端 羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNAS'端第一个碱基对U(尿 苷）有强烈的倾向性，而对G(鸟苷）却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第 四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C(胞苷）。这些分子能够与那些和它的序列互补的 mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基 因的沉默。这种方式是身体调苄基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三 分之一的基因。miR-2400是存在于牛体内的miRNA，在miRBase数据库中的基本信息如图 I(http://www. mirbase. org/cgi-bin/query. pi ? terms = miR_2400&submit = Search) 〇 miR-2400的茎环序列信息如图2。成熟miR-2400序列为：CCAGCACAGGCAGCUCGGACUGA，具体 信息如图 3,图中的参考文献：Glazov EA，Kongsuwan K，Assavalapsakul W，Horwood PF， Mitter N, Mahony TJ. Repertoire of bovine miRNA and miRNA-like small regulatory RNAs expressed upon viral infection. PLoS One. 2009,27,4 (7):e6349. doi:10.1371/ journal, pone. 0006349。该文献发现了 miR-2400,但没有对其生物学功能进行报道。如何 研宄miR-2400是否具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物学功能成为急需解决的一大难 题？所以，发明miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能及其检测方法，验证 miR-2400是否具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能是必要的。
【发明内容】
[0003] 为了研宄miR-2400是否具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的难题，本 发明提供了 miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，该miR-2400显著促 进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能通过对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养，采用含 2%马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观 察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况；牛骨骼肌卫星细胞分化后，MHC和 Desmin在细胞具有阳性表达信号，从而证明本研宄分离培养的为牛骨骼肌卫星细胞，且具 有分化为肌管的能力；在牛的骨骼肌卫星细胞分化过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检 测miR-2400的表达量，采用EdU(5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷）、PCNA(增殖细胞核抗 原）免疫荧光、CCK-8(Cell Counting Kit-8,简称 CCK-8)以及 CCND2[G1/S-特异性周期 蛋白-D2]和CDK6 [周期蛋白依赖性激酶6]表达量的荧光定量RT-PCR检测miR-2400对骨 骼肌卫星细胞增殖的影响；在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，随着分化天数和分化程度的 增加，miR-2400的表达量明显下降；EdU结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的 增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；PCNA免疫 荧光结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制 剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCK-8检测结果为miR-2400过表达后，牛骨骼 肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降 低；CCND2和⑶K6表达量的荧光定量RT-PCR结果为miR-2400过表达后，与增殖相关的基 因 CCND2和⑶K6表达量明显上升，转miR-2400抑制剂后与增殖相关的基因 CCND2和⑶K6 表达量明显下降；以上所有结果均表明miR-2400在调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化过 程中具有一定的作用，能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005] miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，其特征在于：通过对牛骨 骼肌卫星细胞进行体外分离培养，采用含2%马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞 分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表 达情况；牛骨骼肌卫星细胞分化后，MHC和Desmin在细胞具有阳性表达信号，从而证明本研 宄分离培养的为牛骨骼肌卫星细胞，且具有分化为肌管的能力；在牛的骨骼肌卫星细胞分 化过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的表达量，采用EdU、PCNA免疫荧光、 CCK-8以及CCND2和⑶K6表达量的荧光定量RT-PCR检测miR-2400对骨骼肌卫星细胞增殖 的影响；在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，随着分化天数和分化程度的增加，miR-2400的 表达量明显下降；EdU结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转 miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；PCNA免疫荧光结果为miR-2400 过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细 胞的增殖率明显降低；CCK-8检测结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率 明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCND2和⑶K6表 达量的荧光定量RT-PCR结果为miR-2400过表达后，与增殖相关的基因 CCND2和⑶K6表达 量明显上升，转miR-2400抑制剂后与增殖相关的基因 CCND2和⑶K6表达量明显下降；以上 所有结果均表明miR-2400在调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中具有一定的作用， 能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。
[0006] 所述的牛骨骼肌卫星细胞的体外分离培养的具体步骤：⑴取5-10克新生小