山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，特别是一种山羊骨骼肌卫星细胞的体外培养方法，包括如下步骤：（1）取样；（2）消化；（3）过滤；（4）初代培养；（5）诱导培养。本发明方法可快速通过体外培养获得山羊骨骼肌卫星细胞，所培养的细胞形态均一，繁殖活力强，在分化诱导后具有融合成肌管得能力。本发明山羊肌卫星细胞的体外培养方法不但操作简便，而且大大节省了培养成本，具有一定的经济意义，且可以获得大量传代稳定性好的细胞；山羊肌卫星细胞的体外培养可以为探索肌肉分化途径的分子机制及改善肌肉性状的转基因动物生产提供丰富的细胞来源，具有一定的理论和应用价值。
【专利说明】山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别是一种山羊骨骼肌卫星细胞的体外培养方法。
【背景技术】
[0002]骨骼肌组织中的成肌细胞是以肌卫星细胞(satellite cell, SC)的形式而存在；实验表明骨胳肌中的肌卫星细胞有自我更新及成肌、成骨、成脂肪等能力，亦称之为“肌肉干细胞”，这种细胞是向成肌细胞系定向的一种前体细胞；肌肉再生过程主要是由肌卫星细胞来完成的；肌卫星细胞位于肌纤维的肌膜与基底膜之间，一般为小梭形扁平的单核细胞；当肌肉组织受到刺激时如骨骼肌受损时，卫星细胞就会被激活，大量分裂、增殖并相互融合形成再生肌纤维；激活的卫星细胞与受损伤细胞融合以修复受损伤细胞，或几个成肌细胞融合形成肌管，进而生成新的肌细胞。卫星细胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌细胞肥大、数目增多以及肌纤维转化的重要机制。肌卫星细胞体外分离培养成为研究肌肉分化途径及性状改良的分子机制的重要技术平台，为改良家畜肌肉品质及畜牧业生产领域奠定研究基础。
[0003]目前，山羊肌卫星细胞的分离培养还未见报告，而肌纤维卫星细胞的功能研究对山羊育种具有重要的意思，建立一套完整的山羊肌纤维卫星细胞的体外培养方法非常必要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对目前仍无山羊肌纤维卫星细胞的体外培养方法的缺陷，提供一种山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，它能实现山羊骨骼肌卫星细胞的体外扩增，为进一步的分子生物学研究提供一种方法基础。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，包括如下步骤:
(1)取样:在无菌条件下，取山羊背最长肌放入冰盒，立即带回实验室；
(2)消化:将肉样用剪刀剪碎，加入含有胰酶和I型胶原酶的D-Hanks液中，37°C条件下消化60~120min,得到细胞悬浮液；
(3)过滤:过滤细胞悬液，然后离心，所得细胞沉淀用D-Hanks液重悬并离心，再用细胞生长培养液重悬细胞；
(4)初代培养:将悬浮的细胞接种于以多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中，采用差速贴壁法培养细胞ppl至pp6，将pp6中的细胞培养至汇合率为95%，然后采用质量浓度为0.25%的胰酶进行传代，即完成山羊肌卫星细胞的体外分离培养；
(5)诱导分化。
[0006]进一步的:所述步骤(2)中D-Hanks 液由 8g 的 NaCl、0.6g 的 Na2HP04.2H20、4g 的KC1、0.6g的ΚΗ2Ρ04、3.5g的NaHC03、5g的青链霉素、1.0g的两性霉素B和1000mL三蒸水组成。[0007]进一步的:所述步骤(2)中D-Hanks液中胰酶含量为0.25g，I型胶原酶含量为
0.2g0
[0008]进一步的:所述步骤(3)中过滤筛孔孔径为400目。
[0009]进一步的:所述步骤(4)细胞生长培养液由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、lg的青链霉素和lg的两性霉素B组成，pH值为7.2。
[0010]进一步的:所述步骤(4)中传代的比例为1: 1。
[0011]进一步的:所述步骤(5)诱导分化包括如下步骤:
A、采用100μ 1的DMEM高糖培养液对4 μ g的pEGFP-1RES_Myf6质粒和8 μ 1的PEI转染试剂分别进行孵育5min，然后混合并孵育15min，得PE1-质粒复合物；
B、取体外分离培养的山羊肌卫星细胞并培养至汇合率为75%，弃掉培养液，用DMEM高糖培养液清洗山羊肌卫星细胞两次，然后补加1.8ml的DMEM高糖培养液，再将PE1-质粒复合物逐滴滴加到山羊肌卫星细胞表面并作用4h，然后更换为细胞生长培养液A培养24h，再更换为细胞生长培养液B，在温度为37°C并装有5%C02的培养箱中诱导分化48~72h，即完成山羊肌卫星细胞的诱导分化。
[0012]进一步的:所述步骤B中细胞生长培养液A由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、lg的青链霉素和lg的两性霉素B组成，pH值为7.2。
[0013]进一步的:所述步骤B中细胞生长培养液B由98ml的DMEM高糖培养液、2ml的胎牛血清组成，pH值为7.2。
[0014]本发明的有益技术效果是:
(1)本发明方法可快速通过体外培养获得山羊骨骼肌卫星细胞，所培养的细胞形态均一，繁殖活力强，在分化诱导后具有融合成肌管得能力。本发明山羊肌卫星细胞的体外培养方法不但操作简便，而且大大节省了培养成本，具有一定的经济意义，且可以获得大量传代稳定性好的细胞。
[0015](2)山羊肌卫星细胞的体外培养可以为探索肌肉分化途径的分子机制及改善肌肉性状的转基因动物生产提供丰富的细胞来源，具有一定的理论和应用价值。
【具体实施方式】
[0016]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0017]实施例一
山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，包括如下步骤:
(1)取样:在无菌条件下，取山羊背最长肌放入冰盒，立即带回实验室；
(2)消化:将肉样用剪刀剪碎(1mm2)，加入含有0.25g胰酶和0.2g I型胶原酶的D-Hanks (由 8g 的 NaCl、0.6g 的 Na2HP04.2H20、4g 的 KC1、0.6g 的 ΚΗ2Ρ04、3.5g 的 NaHC03、5g的青链霉素、1.0g的两性霉素B和1000mL三蒸水组成)液中，37°C条件下消化60~120min，得到细胞悬浮液；·
(3)过滤:利用筛孔为400目的过滤筛过滤细胞悬液，然后离心，所得细胞沉淀用D-Hanks液重悬并离心，再用细胞生长培养液(70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、10ml的胎牛血清、lg的青链霉素和lg的两性霉素B组成，pH值为7.2)重悬细胞；
(4)初代培养:将悬浮的细胞接种于以多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中，采用差速贴壁法培养细胞ppl至pp6，将pp6中的细胞培养至汇合率为95%，然后采用质量浓度为0.25%的胰酶进行传代(1: 1)，即完成山羊肌卫星细胞的体外分离培养；
(5)诱导分化
A、采用100μ 1的DMEM高糖培养液对4 μ g的pEGFP-1RES_Myf6质粒和8 μ 1的PEI转染试剂分别进行孵育5min，然后混合并孵育15min，得PE1-质粒复合物；
B、取体外分离培养的山羊肌卫星细胞并培养至汇合率为75%，弃掉培养液，用DMEM高糖培养液清洗山羊肌卫星细胞两次，然后补加1.8ml的DMEM高糖培养液，再将PE1-质粒复合物逐滴滴加到山羊肌卫星细胞表面并作用4h，然后更换为细胞生长培养液A (70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、10ml的胎牛血清、lg的青链霉素和lg的两性霉素B组成，pH值为7.2)培养24h，再更换为细胞生长培养液B (DMEM高糖培养液、2ml的胎牛血清组成，pH值为7.2)，在温度为37°C并装有5%C02的培养箱中诱导分化48~72h，即完成山羊肌卫星细胞的诱导分化。
[0018]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的 任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)取样:在无菌条件下，取山羊背最长肌放入冰盒，立即带回实验室；(2)消化:将肉样用剪刀剪碎，加入含有胰酶和I型胶原酶的D-Hanks液，37°C条件下消化60~120min，得到细胞悬浮液；(3)过滤:过滤细胞悬液，然后离心，所得细胞沉淀用D-Hanks液重悬并离心，再用细胞生长培养液重悬细胞；(4)初代培养:将悬浮的细胞接种于以多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中，采用差速贴壁法培养细胞ppl至pp6，将pp6中的细胞培养至汇合率为95%，然后采用质量浓度为0.25%的胰酶进行传代，即完成山羊肌卫星细胞的体外分离培养；(5)诱导分化。
2.根据权利要求1所述山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于:所述步骤(2)中 D-Hanks 液由 8g 的 NaCl、0.6g 的 Na2HP04.2H20、4g 的 KC1、0.6g 的 ΚΗ2Ρ04、3.5g 的 NaHC03、5g的青链霉素、1.0g的两性霉素B和1000mL三蒸水组成。
3.根据权利要求1所述 山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于:所述步骤(2)中D-Hanks液中胰酶含量为0.25g, I型胶原酶含量为0.2g。
4.根据权利要求1所述山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于:所述步骤(3)中过滤筛孔孔径为400目。
5.根据权利要求1所述山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于:所述步骤(3)细胞生长培养液由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、10ml的胎牛血清、lg的青链霉素和lg的两性霉素B组成，pH值为7.2。
6.根据权利要求1所述山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于:所述步骤(4)中传代的比例为1: 1。
7.根据权利要求1所述山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于:所述步骤(5)诱导分化包括如下步骤:A、采用100μ 1的DMEM高糖培养液对4 μ g的pEGFP-1RES_Myf6质粒和8 μ 1的PEI转染试剂分别进行孵育5min，然后混合并孵育15min，得PE1-质粒复合物；B、取体外分离培养的山羊肌卫星细胞并培养至汇合率为75%，弃掉培养液，用DMEM高糖培养液清洗山羊肌卫星细胞两次，然后补加1.8ml的DMEM高糖培养液，再将PE1-质粒复合物逐滴滴加到山羊肌卫星细胞表面并作用4h，然后更换为细胞生长培养液A培养24h，再更换为细胞生长培养液B，在温度为37°C并装有5%C02的培养箱中诱导分化48~72h，即完成山羊肌卫星细胞的诱导分化。
8.根据权利要求7所述山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于:所述步骤B中细胞生长培养液A由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、10ml的胎牛血清、lg的青链霉素和lg的两性霉素B组成，pH值为7.2。
9.根据权利要求7所述山羊骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于:所述步骤B中细胞生长培养液B由98ml的DMEM高糖培养液、2ml的胎牛血清组成，pH值为7.2。
【文档编号】C12N5/077GK103667184SQ201310662855
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】段升华 申请人:中山奈德生物科技有限公司