体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光pcr试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种体外检测胎儿性别的方法，其步骤包括：（1）、母体血液样本离心，取血浆，提取血浆DNA；（2）、以提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应，加入引物SRY-P1及探针SPY-PNA1；（3）检测扩增产物。本发明还公开了一种体外检测胎儿性别的引物及探针，以及一种体外检测胎儿性别的荧光PCR试剂盒。本发明提供了一种在早孕期即可体外检测胎儿性别的方法，根据只存在于男性体内的遗传信息基因SRY，设计了引物SRY-P1及探针SPY-PNA1，对母体血液样本进行荧光定量PCR扩增。本方法用于体外检测胎儿性别，对于怀孕6周的母体的检测准确率能达到100%。根据该方法设计的试剂盒使用方法简单，结果可靠性高。
【专利说明】体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光PCR试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用母体血液样本体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光PCR试剂盒。
【背景技术】
[0002]与性别相关的遗传疾病，一些可能只出现在男性中，而还有一些可能只出现在女性中。因此对于可能有这类遗传疾病史的家庭，早期鉴定胎儿性别将有利于优生优育计划。过去，胎儿性别鉴定经常使用介入性早孕期诊断方法，比如绒毛活检。由于采用怀孕组织直接取材，介入性早孕期诊断的准确率很高。但是，因为诊断过程需要用针头刺人子宫内取样，这种手术容易引起母体及胎儿的损伤，严重的会导致流产。
[0003]超声波诊断也可以用于胎儿性别鉴定，但是它只能对妊娠中期的胎儿性别做出准确鉴定。在一些医院，超声波检查胎儿性别可以在妊娠13周左右进行，但多数医院会建议在妊娠15-16周时进行检查。而对于诊断与性别相关的遗传疾病，基因检测计划的制定需要在早孕期(6-12周)鉴定胎儿性别，因此，在这种情况下，超声波检测并不是一个很好的方法。
[0004]细胞游离DNA (ffDNA)是一种来自于胎儿的遗传信息材料，在妊娠期间，ffDNA可以在怀孕6周以上的母体血液中被检测到。有人针对只存在于男性体内的遗传信息基因SRY，设计SRY特有引物，采用PCR的方法来鉴定母体血液中是否存在SRY基因。但是由于母体血液中的ffDNA的含量极低，而母体背景DNA的含量非常高，采用普通的PCR扩增的方法，由于母体背景DNA的影响及DNA双链匹配的不完全严格性，导致试验结果的准确度偏低。
[0005]肽核酸(PNA)是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N(2_氨基乙基)_甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。PNA有3个特点:1、PNA与DNA的结合能力胜于DNA与DNA的结合能力；2、DNA/PNA双链比DNA/DNA双链的稳定性高；3、PNA只能与完全匹配的DNA或RNA结合。由于PNA不能作为PCR引物，因此，PNA-PCR主要用于点突变的基因检测，它能与未突变的基因完美结合，阻止引物与未突变的基因结合，与突变的基因则不能结合，而引物可与突变的基因结合，从而使突变基因扩增。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种用母体血液样本体外检测胎儿性别的方法。
[0007]为达到上述目的，本发明采用的技术方案为:一种体外检测胎儿性别的方法，其步骤包括:
(1)、母体血液样本离心，取血浆，提取血浆DNA；
(2)、以提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应，加入引物SRY-Pl及探针SPY-PNAl，其中引物 SRY-Pl 上游序列为:SRY_PF1 5’-CTGTAACTCTAAGTATCAGTGTG-3’ (SEQID NO:1 )，引物 SRY-Pl 下游序列:SRY-PRl 3 ’ -AGCTGCTTGCTGATCTCTGAG-5 ’ (SEQ ID NO:2)，荧光探针 SPY-PNAl 的序列为:DABSYL-Lys-AAGCGACCCATGAA-Glu-FAM (SEQ ID NO:3)；
(3)检测扩增产物。
[0008]进一步的，所述母体血液样本取自妊娠6周后的母体。
[0009]本发明还提供了一种体外检测胎儿性别的引物及探针，所述引物为上述的引物SRY-Pl，所述探针为上述的荧光探针SPY-PNAl。
[0010]本发明还提供了一种体外检测胎儿性别的荧光PCR试剂盒，包括上述的引物及探针。
[0011]本发明提供了一种在早孕期即可体外检测胎儿性别的方法，根据只存在于男性体内的遗传信息基因SRY，设计了引物SRY-Pl及探针SPY-PNAl，对母体血液样本进行荧光定量PCR扩增。本发明在探针SPY-PNAl的谷氨酸端标记FAM荧光基团，在赖氨酸端标记DABSYL淬灭基团，由于PNA只能与完全匹配的DNA结合，如果母体血液中存在SRY基因，则经扩增后探针SPY-PNAl能结合上去，并显示出荧光，如果母体血液中不存在SPY基因，即使引物在错配后扩增，探针SPY-PNAl也无法与之结合，从而被淬灭，荧光显示不出来，而即使微量的存在荧光，现有的检测仪器也能检测出来，因此，本方法用于体外检测胎儿性别，对于怀孕6周的母体的检测准确率能达到100%。根据该方法设计的试剂盒使用方法简单，结果可靠性高。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1:样本PCR产物电泳图。其中泳道1.DNA ladder 泳道2.空白对照
泳道3.阳性对照(男性胎儿胎盘DNA)` 泳道4.样本I (女性I怀孕6周的血浆DNA)
泳道5.样本2 (女性2怀孕6周的血浆DNA)
泳道6.样本3 (女性3怀孕6周的血浆DNA)
泳道7.样本4 (女性I怀孕12周的血浆DNA)
泳道8.样本5 (女性2怀孕12周的血浆DNA)
泳道9.样本6 (女性3怀孕6周的血浆DNA)
泳道10.阴性对照(未怀孕女性DNA)。
[0013]图2:样本荧光定量PCR检测结果图。
[0014]
【具体实施方式】
[0015]下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:试验手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0016]实施例一:
1、样本处理:样本1-3为从6孕周的孕妇静脉抽取的血液，样本4-6为从12孕周的孕妇静脉抽取的血液。将样本1-6离心去除血细胞,取血浆,提取血浆DNA。[0017]2、引物、探针设计与合成=WGeneBank中调出SPY基因的DNA序列，然后通过DNAStar软件进行比较，在相对保守的区域设计引物序列及相应的PNA序列并进行合成。在PNA探针的谷氨酸端标记荧光基团FAM (发射波长:522nm)，在赖氨酸端标记淬灭基团DABSYL 。
[0018]3、PCR反应体系:
模板2 μ I
PCR-MIX2.5 μ I
Taq 酶I μ I
上游引物2 μ I
下游引物2 μ I
探针1μ I ddH2014.5 μ I
总计25μ1
PCR反应条件:95°C保温2分钟；93°C 10秒和62°C 50秒交替循环40次；单点荧光检测在62°C。结果见图1，其中空白对照采用ddH20，阳性对照所用模板为男性胎儿胎盘DNA，样本1-3为女性1-3在6孕周的血液样本，样本4-6为女性1-3在12孕周的血液样本，阴性对照为未怀孕女性DNA。在图1中横线上的5个荧光检测结果分别对应阳性对照、样本
2、3、5、6，对应图2中的泳道3、5、6、8、9。即PCR扩增SRY基因成功。
[0019]在图中横线下的4个荧光检测结果分别对应空白对照、阴性对照和样本1、4，对应图2中的泳道2、4、7、10。即PCR扩增未检测到SRY基因信号。
[0020]4、电泳:将荧光PCR产物电泳后观察结果，电泳图见图2。其中泳道1.DNAladder ；
泳道2.空白对照；泳道3.阳性对照(男性胎儿胎盘DNA);泳道4.样本I (女性I怀孕6周的血浆DNA);泳道5.样本2 (女性2怀孕6周的血浆DNA);泳道6.样本3 (女性3怀孕6周的血浆DNA);泳道7.样本4 (女性I怀孕12周的血浆DNA);泳道8.样本5 (女性2怀孕12周的血浆DNA);泳道9.样本6 (女性3怀孕6周的血浆DNA)
泳道10.阴性对照(未怀孕女性DNA)。可以看出，泳道3、5、6、8、9显示PCR扩增SRY基因成功，泳道2、4、7、10显示PCR扩增未检测到SRY基因信号。
[0021]后期证实女性2和3所怀有的为男婴,女性I的母体所怀有的为女婴。
[0022]〈110〉
〈120〉体外检测胎儿性别的方法、试剂盒及荧光PCR试剂盒 〈130〉
〈160〉 3
<170> PatentIn version 3.5
〈210〉 I
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
<400>1ctgtaactct aagtatcagt gtg23
〈210〉 2〈211〉 21〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 2
agctgcttgc tgatctctga g21
〈210〉 3
〈211〉 14
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 3
aagcgaccca tgaa14`
【权利要求】
1.一种体外检测胎儿性别的方法，其步骤包括: (1)、母体血液样本离心，取血浆，提取血浆DNA； (2)、以提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应，加入引物SRY-Pl及探针SPY-PNAl，其中引物 SRY-Pl 上游序列为:SRY_PF1 5’-CTGTAACTCTAAGTATCAGTGTG-3’ (SEQID NO:1)，引物 SRY-Pl 下游序列:SRY-PRl 3 ’-AGCTGCTTGCTGATCTCTGAG-5 ’ (SEQ ID NO:2)，荧光探针 SPY-PNAl 的序列为:DABSYL-Lys-AAGCGACCCATGAA-Glu-FAM (SEQ ID NO:3)； (3)检测扩增产物。
2.根据权利要求1所述的体外检测胎儿性别的方法，其特征在于:所述母体血液样本取自妊娠6周后的母体。
3.—种体外检测胎儿性别的引物及探针，其特征在于:所述引物为权利要求1中所述的引物SRY-Pl，所述探针为权利要求1中所述的荧光探针SPY-PNAl。
4.一种体外检测胎儿性别的荧光PCR试剂盒，包括权利要求3所述的引物及探针。
【文档编号】C12Q1/68GK103642923SQ201310662440
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】叶盛 申请人:叶盛