一种富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料的制备及其临床应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，具体是一种富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料的制备及其临床应用。

背景技术：

由于外伤、感染、肿瘤切除或先天性缺陷原因等造成的体表组织器官凹陷畸形，除了影响容貌之外，还会不同程度的影响患者的心理健康及社会交际活动。自体脂肪移植填充是目前治疗体表软组织凹陷或轮廓不对称的主要方法之一。其主要缺点是移植后容易吸收，吸收率占20％～90％不等，大多需要接受反复数次注射才能达到较为满意的效果，因此如何减少脂肪移植后的吸收率，提高成活率已成为近年的研究热点。

脂肪细胞在移植早期缺乏有效血供，在移植物的血供充分建立之前，移植的脂肪组织的主要营养来源于周围组织液的渗透，而中央部分的脂肪组织往往因与周围组织的距离较大，缺血缺氧时间过长，更容易发生坏死、液化。巴西carpaned医师于1993年就提出“边缘地带”的概念并观察到约有40％组织存活于距离移植物边缘约1.5±0.5mm之以内的边缘地带，有学者研究发现移植物中央区纤维化较边缘区多，脂肪细胞体积较小，说明移植物的吸收大部分发生在中央区域，因此改善移植物中央区早期的营养状态，促进血供建立至关重要[carpanedaca,ribeiromt.studyofthehistologicalterationsandviabilityoftheadiposegraftinhumans.aestheticplastsurg,1993,17(1):43-47.doik,ogataf,etoh,katoh,kunos,kinoshitak,kanayamak,fengj,manabei,yoshimurak.differentialcontributionsofgraft-derivedandhost-derivedcellsintissueregeneration/remodelingafterfatgrafting.plastreconstrsurg,2015,135(6):1607-1617.]。

自2001年zuk等首次从脂肪组织中分离、提取出脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ascs)并命名以来，ascs因来源广泛、取材方便、组织损伤小、扩增迅速等优点已成为细胞治疗和组织工程应用中的理想工具。大量研究表明，ascs在体内损伤修复、抗衰老等方面均可发挥较为显著的作用；其生物学作用的实现一部分通过多向分化能力，ascs可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、神经等多种细胞，补充替代老化、缺损的组织细胞；另一部分通过旁分泌功能，ascs可分泌多种细胞因子、多肽类等活性成分，提高受损细胞的生命力和抗凋亡能力。ascs来源丰富，可分化为多种谱系，可分泌多种细胞因子，并具有免疫调节作用，其在组织再生领域中的突出表现使其具有广阔的临床应用前景。[zukpa,zhum,mizunoh,huangj,futrelljw,katzaj,benhaimp,lorenzhp,hedrickmh.multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapies.tissueeng,2001,7(2):211-28.uzbasf,mayid,parisiam,thompsonsk,kayaa,perkinsad,memilie.molecularphysiognomiesandapplicationsofadipose-derivedstemcells.stemcellrev,2015,11(2):298-308.]

自2005年以来，我们的研究团队以人类不同解剖部位的皮下脂肪为组织来源，建立了自己的一整套实验技术平台及方法，进一步优化ascs分离培养方案，并对其进行多潜能分化表型鉴定，通过在细胞体外培养或体内移植过程中添加人参皂苷rg1或自体prp/prf等成分，观察及评价细胞表型及其它生物学行为的变化情况，同时评价这些成分对脂肪干细胞生长增殖、多向分化、旁分泌功能及特定组织构建的影响，取得了可喜的研究成果，为脂肪干细胞应用于组织工程、再生医学研究及在临床上促进创伤修复、组织再生、器官重建及细胞治疗提供理论依据。

技术实现要素：

本发明解决的问题在于提供一种富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料的制备及其临床应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

1.一种富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料的制备，制备方法包括以下步骤：

1)脂肪颗粒团的获取与纯化

选取大腿上段内外侧或下腹部为供区，用手持20ml针筒预留空气法低负压抽取，根据患者情况，选定脂肪供区位置后，局部肿胀液浸润麻醉，采用自行设计的多孔专用吸脂针进行抽吸，抽吸时由深层向浅层抽吸，扇形反复抽吸；将抽吸出来的脂肪颗粒，采用生理盐水冲洗备用；采取低速离心方法获取并纯化脂肪颗粒团，离心转速600rpm/min，离心时间2min，操作过程全程遵循无菌密闭操作原则，尽量减少脂肪组织与空气的接触时间。如图1所示。

2)纳米脂肪基质细胞的获取

将一部分脂肪颗粒团经机械捣碎乳化法制备富含脂肪干细胞的纳米脂肪基质细胞，将步骤1)初步处理后的颗粒脂肪经孔径0.5mm的滤网过滤，随后将颗粒脂肪经2个20ml注射针筒连接纳米脂肪专用乳化器快速对打30次，机械乳化，用0.5mm孔径的滤网再次过滤，最后经转速为8000rpm/min，离心时间为5min高速离心去除油脂后得到的脂肪乳化液即为纳米脂肪如图1所示，这部分乳化后的纳米脂肪携带有较多的基质血管成分和脂肪干细胞，有利于增加基质血管成分与脂肪细胞的接触面，提高脂肪移植物的成活率，将机械乳化颗粒脂肪分离培养并传代后获得的间充质干细胞称为纳米脂肪来源干细胞。

3)纳米脂肪来源干细胞的生物学特性及多向分化鉴定

经步骤2)机械乳化后的纳米脂肪基质细胞含有较多的基质血管成分，培养24h后开始有少量成纤维细胞样形态的细胞散在贴壁，大部分未贴壁细胞为球形或圆形的杂细胞。24-48h后首次换液去除未贴壁细胞后，大部分贴壁细胞呈宽大扁平的成纤维细胞样细胞，随着培养时间的延长，这些贴壁细胞呈集落状生长，集落大小不一；集落中细胞形态为典型的梭形细胞。约7-10d可达80％～90％致密层单层。传代后细胞形态主要为梭形，如图2的a、b、c所示。传代后细胞生长速度较原代细胞明显增快，如果按1：3传代，2-3d即可长满。连续传代培养10代细胞未出现明显衰老现象。传代后细胞突起明显，呈梭形或多角形，生长较快，经检测细胞倍增时间平均约为40h，各代细胞形态与传统胶原酶消化法获取的脂肪干细胞相似。第3代细胞经成脂诱导14d，可见细胞内有透亮的脂滴形成，油红o染色可见脂滴被染成鲜红色如图2的d、e所示。成骨诱导21d后，可见典型的矿化钙结节形成，茜素红染色吴鲜红色如图2的f、g所示；成软骨诱导14d后，可见高度聚集样生长的细胞团，呈斑片状或结节状，周围细胞呈放射状；结节较大，肉眼可见；阿利辛蓝染色提示结节及周边聚集的细胞呈蓝色如图2的h、i所示。第3代纳米脂肪来源干细胞流式细胞分析显示cd29、cd44、cd49d、cd54、cd90和cd105呈阳性，而cd34、cd45和cd106呈阴性，如图5所示。

4)富含细胞因子纤维蛋白胶的获取

抽取同一个体的适量静脉血，置于的无菌负压采血管内，采用choukroun’s法离心转速为2700rpm/min、离心时间为12min一次高速离心提取富含细胞因子的凝胶状物质。即刻用20ml无菌注射器采集患者静脉血液20-40ml，并密封盖封。将无菌的离心套管放入离心机中，然后将装有患者静脉血液的20ml注射器放入套管中，以转速为2700rpm/min离心12min。静置3～5min后弃上清，去除底层红细胞碎片，收集中间纤维蛋白凝胶层，过滤去除血清，将富含细胞因子纤维蛋白胶收集备用，如图3所示。同时对富含细胞因子纤维蛋白胶在1～168h时间段内进行细胞因子释放浓度的检测，结果发现血管内皮生长因子血小板源性生长因子、转化生长因子-β1、表皮生长因子、白细胞介素-6、基质金属蛋白酶-1和胰岛素样生长因子-1的浓度呈上升趋势，如图4所示。这些细胞因子对促进组织修复和再生具有重要的作用。

5)临床应用情况

移植物由结构性脂肪颗粒、纳米脂肪基质细胞和富含细胞因子纤维蛋白胶按一定比例混合而成，在受区周围标记，选择较为隐蔽的部位作为进针点，局部麻醉，自远向近缓慢注入移植物，使其均匀分布。在注入前，先用锐针剌破皮肤，再换成钝针注射复合移植物，先回抽是否有回血，尤其是在眼周，避免注入至血管内，注射时，给予最小的压力，缓慢注入。注射时应注意间断、扇形、线状注入，采用多点分层注入，避免团块情况出现，而影响血运。注射量应较所需量多25％～30％左右：注入后局部按摩，使移植物分布均匀。术后轻度压迫.敷料固定2天。静脉使用抗生素3天，预防感染。

本发明项目使用新鲜分离富含基质血管成分的纳米脂肪、富含细胞因子纤维蛋白胶与自体颗粒脂肪形成复合移植物后，对62例面部凹陷、皮肤老化及乳房萎缩或先天性发育不良的患者进行局部注射移植治疗，经过12～24个月的随访，发现脂肪存活情况良好，大部分病例单次注射即能达到满意效果，仅有5例(8.06％)需行2次注射，而传统的自体脂肪移植绝大部分患者则需要反复多次注射治疗，且移植物发生囊肿、液化的概率较高。此外所有患者术后均未发现局部感染、脂肪液化、硬结、感觉异常等不良并发症，说明该方法安全性可靠，且效果显著，可作为临床上治疗各类软组织缺损及皮肤衰老的首选方案。同时我们还发现所有患者接受移植部位的肤质得到了不同程度的改善，如色斑淡化、细纹消失、毛孔缩小等，其主要作用机制是纳米脂肪中血管基质成分的旁分泌功能以及富含细胞因子纤维蛋白胶中的细胞因子发挥了组织再生及皮肤抗衰老作用。

综上所述，应用新鲜分离富含基质血管成分的纳米脂肪、富含细胞因子纤维蛋白胶按一定比例与自体结构性颗粒脂肪移植作为面部、胸部软组织凹陷或缺损患者的塑形治疗，术后患者满意度高，脂肪组织可以在受区长期存活，未见不良并发症，单次注射即可获得比较满意的效果，是安全性好、远期疗效显著的面部轮廓及胸部整形方法，该方法可显著提高脂肪移植成活率，达到塑形、丰胸、精雕面部轮廓并能改善面部肤质的作用，值得进一步深入研究和推广应用。

本发明的有益效果：

本发明基于基质血管成分促进创伤或创面修复并减少瘢痕增生、促进组织再生修复与器官重建的新技术，缩短患者的康复时间，取得良好的疗效，为临床上细胞辅助的自体脂肪组织移植修复软组织或器官缺损、烧伤创面、难愈性创面及乳腺癌术后乳房重建提供实验依据与理论支持。

附图说明

图1是本发明结构性颗粒脂肪和纳米脂肪的提取图。

图2是本发明第3代纳米脂肪来源干细胞形态特征及多向分化诱导结果图。

图中，a、b、c为传代后细胞形态主要为梭形，少数为三角形或多边形；d、e为第3代细胞经成脂诱导14d，可见细胞内有透亮的脂滴形成，油红o染色可见脂滴被染成鲜红色；f、g为成骨诱导21d后，可见典型的矿化钙结节形成，茜素红染色吴鲜红色；h、i为成软骨诱导14d后，可见高度聚集样生长的细胞团，呈斑片状或结节状，周围细胞呈放射状；结节较大，肉眼可见；阿利辛蓝染色提示结节及周边聚集的细胞呈蓝色。

图3是本发明富含细胞因子纤维蛋白胶的提取示意图。

图4是本发明不同时间点富含细胞因子纤维蛋白胶释放细胞因子酶联免疫吸附检测结果图。

图5是本发明第3代nfscs表面抗原流式细胞分析结果图。

具体实施方式

下面结合典型案例对本发明实施效果作详细的说明。

典型案例1

患者韦某某，女，30岁，因面部软组织凹陷及轮廓不协调就诊，要求手术改善。于2016年1月29日在局部麻醉下行“富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料”局部注射治疗，其中双侧颞部注射移植45ml，额部注射移植30ml，双侧面颊部注射移植20ml，下巴注射移植5ml。术后随访12个月见面部轮廓好，软组织凹陷处较饱满，移植物存活良好，面部肤质明显改善，疗效满意。

典型案例2

患者何某某，女，26岁，因双侧下睑部(睑颊沟)、法令纹(鼻唇沟)软组织凹陷不协调就诊，要求手术改善。于2016年3月12日在局部麻醉下行“富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料”局部注射治疗，其中双侧睑颊沟注射移植1.6ml，双侧鼻唇沟注射移植10ml。术后随访12个月见轮廓好，软组织凹陷处较饱满，移植物存活良好，局部皮肤光滑、毛孔变小，疗效满意。

典型案例3

患者苏某某，女，25岁。因先天性乳房发育不良及不对称来诊，要求手术改善。于2015年11月28日在全身麻醉下行双侧大腿吸脂术+双侧乳房“富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料“注射移植术，其中左侧乳房注射细胞复合物220ml，右侧乳房注射细胞复合物190ml。术后随访12个月见双侧乳房形态饱满，移植物存活良好，未见移植物液化、硬结、囊肿等并发症，疗效满意。