专利名称：用于释放胞毒剂和其组分的方法
多年来，已经开发了用于治疗肿瘤疾病的许多胞毒药物。所有这些有用的药物的主要缺点是对于患者所有细胞存在着无差别的毒性，因此限制了该药物的剂量，并从而限制了它的效力。胞毒剂以潜在的形式作用于肿瘤疾病的部位上。因此，在减少或可能抑制该药物的不希望的副作用方面，本发明提供了标记的优点。由于进一步减少了有害副作用的结果，通过增加剂量来服用胞毒剂，使肿瘤部位上的药物产生更高的浓度。
一方面是，本发明提供了用于治疗肿瘤疾病的方法，其方法包括A)对感染宿主施用治疗有效量的抗体-酶结合物;然后B)对感染宿主施用治疗有效量的底物-胞毒剂，其中底物是对于酶的底物;其中抗体-酶结合物和底物-胞毒剂在下面的定义中进行详述。
另一方面，本发明包括在下面定义中进行详述的抗体-酶结合物和底物-胞毒剂。
图1描述了在按器官重量分离的每个器官中，以注射剂量%表示的在裸体小鼠中抗-KSI/4-β-内酰胺酶结合物的生物分布。
图2描述了在每个器官中以注射剂量表示的图1的相同的测量。
图3说明了通过抗CEA-β-内酰胺酶结合物和实施例11的前体药物化合物的结合在裸体小鼠中抑制T380肿瘤的生长。治疗经过3周，在3个过程中服药。每个过程包括35μg结合物，72小时后，4日剂量为1mg前体药物/Kg体重。
图4描述除了用4日剂量为0.25mg前体药物/Kg体重的方法服用前体药物之外，还描述了如图3关于T380肿瘤的相同结合物前体药物的结合的相似的抑制作用。
图5是通过抗KSI/4抗体-β-内酰胺酶结合物或抗CEA-β-内酰胺结合物和实施例11的前体相结合来比较在裸体小鼠中抑制LS174T肿瘤的生长。
图6描述了在裸小鼠中对于LS174T肿瘤的抗TAG72-β-内酰胺酶结合物和实施例11的前体药物相结合的抑制作用。
图7是通过本发明的抗CEA-β-内酰胺酶结合物和实施例11的前体药物相结合的关于抑制T380肿瘤生长的结合物的剂量的作用的比较。
本发明的一方面是式抗体-酶 Ⅰ的酶抗体结合物其中酶与式底物-胞毒剂 Ⅱ的化合物(该化合物在下面描述)反应，以致使底物从胞毒剂中分离出来;并且抗体与靶组织进行络合。
本发明的抗体与一种或多种靶细胞的抗原相络合。靶细胞是肿瘤组织(或者是良性的或者是恶性)的一部分。这类靶细胞的实例包括鳞皮病、多鳞癌细胞、腺癌细胞、小细胞癌细胞、glyoma细胞、melonoma细胞、肾细胞癌细胞、转移细胞癌细胞、肉瘤细胞、支持肿瘤血管的细胞和淋巴样肿瘤的细胞例如白血病和淋巴瘤。
抗体可以选自包括IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的任何种类或小类的免疫球蛋白。起源的种类不是关键的，只要抗体与靶细胞络合。
在本技术领域中，单克隆抗体是用于本发明中最优选的。然而，多克隆抗体也不排除在外。新型抗体是嵌合抗体，其是在试验室通过重组体技术来制备的，所说的重组体技术允许表达修饰的DNA，该DNA编码了任何所需抗体的结合抗原的区，也编码了任何其他所需氨基酸顺序。因此，嵌合抗体(其中一部分由一种物种衍生而来，而另一部分由不同物种衍生而来)可以得到并可用于本发明。
另外，抗体的起源和性质不是关键的，只要它对准要治疗的靶细胞，并且本身对患者是没有毒性的。那些普通技术人员可以容易地制备具有选择物抗体的酶结合物，并且对它们进行评价。如何选择这类抗体将在下面详细讨论。
认为，正确地选择抗体的片段具有与抗体相同的作用。因此，在本发明的实施中，抗体的片段例如F(ab′)2、F(ab′)和单一区域的抗体(VH区或dAbs)和特别是F(ab′)片段(识别与要治疗的细胞结合的抗原)可以与完整的抗体一样有用。(dAbs由Ward E.等人描述在Nature，341，p.544，1989中;由Orlandi R.等人描述在Proc.Natl.Acad.Sci.，(USA)86，p.3833，1989中。)大量的抗体对于免疫学家来说都可应用于本发明。另外有用的抗体公开在每一种相关的杂志的发行物中。在本发明的实施中，不可能并且也完全不必要给出可应用的抗体的一览表。普通技术的免疫学家和化学家完全能够从例如American Type Culture Collection (ATCC)(Rockville，Maryland，U.S.A)，和Linscott′s Directory of Immunological and Biological Reagents(由Linscott′s Directory公布，40 Glen Drive，Mill Valley，California，U.S.A.，94941)的产品目录的来源中选择抗体。因此，本技术领域的技术人员选择在该靶细胞上实际上抗任何抗原的抗体是简单的事情。
另一种方法是，用于产生这类抗体的所必需的杂交瘤可通过ATCC或Northern Regional Research Laboratories(NRRL)(U.S.Department of Agriculture，Peroia，Illinois，U.S.A)和其它细胞系收集得到。
一些现在已知的抗体对于本发明是特别有意义的，一种优选的有特效的抗体是由ATCC杂交瘤HB9682产生的L/IC。另一种优选的是由ATCC杂交瘤HB9620产生的。上述的抗体(称为CEM231.6.7)与通过几种类型的肿瘤细胞表达的合适的癌胚抗原络合。近来，嵌合抗体CEM231.6.7已描述在美国专利申请号07/165，856和07/272，577(申请日分别为1988年3月3日和1988年11月17日)。该抗体也详述于Beidler C.B.等人的J.Immunology(141，pp.4053-4060，1988)中。与MAT65 T-细胞标记物反应的抗体是T-101抗体。该T-101抗体是由ATCC杂交瘤＃CRL8023产生的，并描述于美国专利号4，675，386中。
另一种有意义的抗体是KSI/4，其首先由Varki等人公开于Cancer Research(44，PP.681-686，1984)中。包括单克隆抗体KSI/4的不同区的编码顺序的一些质粒存在于沉积物上，并可由Northern Regional Research Laborotory得到。该质粒可通过那些普通的技术人员使用，以便用重组体方法产生嵌合抗体，该抗体结合到在腺癌细胞上具有高密度的细胞表面的抗原上。这类抗体的结构详述于美国专利申请号07/184，522(申请日为1988年4月21日)中。下述的质粒涉及KSI/4。
由E.coli K12 MM294/PGKC2310、NRRLB-18356分离出来的质粒PGKC2310为轻链的编码顺序，信号肽与轻链结合的和5′和3′未转译区的编码顺序。
由E.coli K12 MM294/PG2A52、NRRL B-18357中分离出来的质粒PG2A52为重链的编码顺序，信号肽与重链结合的和5′和3′未转译区的编码顺序。
由E.coli K12 DH5/CHKC2-6、NRRL B-18358分离出来的质粒CHKC2-6为轻链可变区的编码顺序，信号肽与轻链结合的编码顺序和人的IgG的轻链不变区的编码的顺序。
由E.coli K12 DH5/CHKC2-18、NRRL B-18359分离出来的质粒CHKC2-18为衍生物轻链可变区的编码顺序，信号肽与轻链结合的编码顺序和人的IgG的轻链不变区的编码的顺序。
由E.coli K12 MM294/CH2A5、NRRL B-18360分离出来的质粒CH2A5为重链可变区的编码顺序，信号肽与重链结合的编码顺序和人的IgG1的重链不变区的编码的顺序。
由E.coli K12 DH5/CH2A5IG2、NRRL B-18361分离出来的质粒CH2A5IG2为重链可变区的编码顺序，信号肽与重链结合的编码顺序和人的IgG2的重链不变区的编码的顺序。
由E.coli K12 DH5/CH2A5IG3、NRRL B-18362分离出来的质粒CH2A5IG3为重链可变区的编码顺序，信号肽与重链结合的编码顺序和人的IgG3的重链不变区的编码的顺序。
由E.coli K12 DH5/CH2AIG4、NRRL B-18363分离出来的质粒CH2AIG4为重链可变区的编码顺序，信号肽与重链结合的编码顺序和人的IgG4的重链不变区的编码的顺序。
由ATCC杂交瘤产生的抗体5E 9C11识别由许多肿瘤表达的铁传递蛋白受体。由National Cancer Institute(NCI)得到的称为CC49的抗体识别由乳腺癌和结肠癌表达的TAG-72抗原(Muraro R.等人，Cancer Research，48，PP.4588-4596，1988)。抗体ZCE025也适用于本发明。该抗体首先由Jean-Pierre Mach和他的小组(例如，Mach J.P.等人，Int.J.Cancer，33，PP.643-649，1984;和Patt Y.等人，Cancer Bull.，40，PP.218-221，1988)描述。与许多癌上存在的抗原反应的另外有用的抗体称为BRE3，并且在本发明的实施中是有用的(Peterson J.A.等人，Hybridoma，9，PP.221-235，1990)。到目前为止另外用于本发明的有用的抗体也识别KSI/4抗原，并被称为007B。该抗体由Eli Lillyand Company、Lilly Corporate Center、Indianapolis、Indiana 46285得到。
用于该结合物的酶是识别底物的酶，并且当它被结合到所说的胞毒剂上时，它也将识别那种底物。此外，一旦所说的酶被结合到该抗体上，该酶必需保持它的活性。
对于抗体来说，不可能并且也没有必要列出用于本发明所有酶的一览表。许多合适的实例可从市场上得到，例如从Sigma Chemical Company，st.Louis，Missouri;Boehringer Mannheim Company，Indianapolis，Indiana;Cal Biochem，San Diego，California等得到。各种分离和提纯酶的方法都可在如Methods In Enzymology等这类参考文献中找到，本技术领域的普通技术人员也认识到，保持完整酶的催化活性和特异性(类似于活性和特异性的任何催化剂如催化抗体)的酶的片段也适用于本发明。
可用于本发明的酶催化两种主要类型反应中的一种。第一种类型的反应是在其中底物-胞毒剂化合物被裂开成为它的两个组分部分的反应。对于底物的酶的活性必须是由于胞毒剂的存在而基本上未受损伤。用于这种类型反应的优选的酶是对胞毒剂的存在是不敏感的并与该胞毒剂结构无关。这类酶总是允许特定的结合物用于多种底物-胞毒剂的结合。这类(不敏感的)酶的实例包括β-半乳糖苷酶、各种碱性磷酸酯酶的同功酶、某些羧基肽酶(例如Pseudomonas sP.的酶)、D-氨肽酶(Asano Y.等人，J.Biol.Chem.，264，PP.14233-14239，1989;Asano Y.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，162，PP.470-474，1989;Asano Y.等人，Biochem.，31，PP.2316-2328，1992)、焦谷氨酸酯氨肽酶和各种β-内酰胺酶。这些酶可分别识别作为底物的半乳糖基、磷酸酯基、某些简单的氨基酸、1-焦谷氨酸酯、d-氨基酸酰胺和头孢菌素化合物，并且由这些底物被结合在其上的任何其他分子来制备这些底物。在酶的这些所需的特性中所固有的是，酶仅与一种特定的官能团即连接底物和胞毒剂的官能团反应的特性，而所述的胞毒剂是这样的以致使其可用未受酶影响的任何数目的不同官能团所取代。β-内酰胺是具有这种特性的最好的实例。作为底物的青霉素、头孢菌素、头孢菌素亚砜、1-含氧脱硫头孢菌素和1-氨甲酰脱硫头孢菌素是由一些未受酶损伤的官能团组成。所说的β-内酰胺酶仅与这些底物化合物的β-内酰胺环反应。由于这种反应的结果，底物上的3′-取代基常常从头孢菌素环的其余部分裂开。
由该酶催化的第二种类型的反应是组成代谢反应，换句话说是酶将该前体转化成胞毒剂的反应。因此，对于这种类型的酶而言，所说的前体首先将起到底物的作用，然后起胞毒剂的作用。底物-酶化合物这样结合的实例为单端孢菌素(trichothecenes)、一种非蛋白质强毒素或蝇蕈素。
在以底物-胞毒剂化合物的形式已给掩蔽的患者服用胞毒剂之后，与酶催化的反应类型无关，而酶的目的是相同的，即在体内产生胞毒剂(并且在抗体-酶结合物的位点上处于高浓度)。可用于本发明的酶包括各种β-内酰胺酶、与微生物的种类无关，所说的酶可从焦谷氨酸酯氨肽酶、β-半乳糖苷酶、D-氨肽酶、各种碱性磷酸酯酶的同功酶、各种羧基肽酶如Pseudomonas sp.的羧基肽酶G2等中分离出来。
最有用的酶是按特定方式可被抑制的那些酶，这种抑制是通过在体内通常未发现的和在体内发现的不抑制其他酶的物质而进行的。这类酶的特别有用的实例是β-内酰胺酶，其可通过各种β-内酰胺酶抗性青霉素和头孢菌素如氯苯唑青霉素被抑制。这类青霉素和头孢菌素通常具有的优点是它们已经用于人体而得到证明。此外，因为较低分子量的分子的原因，预料它们将很快透入器官，在此前体药物/抗体-结合物药物正在引起不希望的作用。
酶和抗体结合的方法是本技术领域中熟知的。参见，例如市场上可以买到(来自Pierce Chemical Company)的所列出的蛋白质-蛋白质偶合试剂。用于酶-抗体结合的各种官能团通常是不被确定的，而且它对于本发明的目的是不重要的。所有需要的是，该抗体保持它的未结合状态的免疫反应性的基本部分。同样，对于结合酶来说，所有需要的是，它保持来自它的未结合状态的活性的基本部分。最后，结合物和新形成的底物-胞毒剂必须在受感染的宿主中证明实用的药物动力学。可用于酶与抗体结合的试剂包括SMCC、硫代-SMCC、SPDP、2-亚氨基硫醇烷、MBS、硫代-MBS、SMPB、硫代-SMPB、SIAB、硫代-SIAB、GMBS、EMCS、N，N′-二(3-马来酰亚氨基丙酰基)-2-羟基-1，3-丙二胺、N-琥珀酰基溴代乙酸酯(Sigma Chemical Company)、BMME(Boehringer Mannheim)等。由于取决于在抗体和酶上的反应可适用的特定的官能团、所选择的抗体片段和在酶活性部位和抗体结合部位中或接近酶活性部位和抗体结合部位的基团的反应性，这些试剂可用于结合。也可以使用在两个氨基之间交联的试剂，例如DMA或DSS(Pierce Chemical Company)。某些酶和抗体在它们的活性部位或结合部可分别具有氨基、巯基或羟基。因此，这些活性官能团在它们与如上面列出的试剂的实例结合之前可首先通过保护基如柠康酐、DTNB和DNFB使之掩蔽起来[按照参考文献(Pierce Chemical Company Catolog and Schmuel and Shaltiel，Biochem.and Biophys Res.Comm.，29，PP.178-183，1967)的方法]。Pierce Chemical Company Catalog列出了描述上述试剂的许多应用的参考文献，任何剩余试剂的使用可在该学术文献中找到。
同样希望但不是必需的是，假定酶不存在于人身中，底物也不存在于人体中。本技术领域普通技术人员可容易地看到，如果酶或底物存在于人体中，那么，在除靶组织部位之外的区域中释放胞毒剂的机会就会增多。
尽管如上所述的抗体和酶的任何结合都可满足本发明，但优选的结合物是所给出的结合技术尽可能是同系的结合物。与完整的抗体不同的是，F(ab′)片段可通过接近羧基终端且离开抗原结合部位而存在的硫羟基经特定区衍生而来，并且该片段在本发明中是优选的。其他合适的方法是制备更同系的结合物。这类方法中的一种公开在欧洲专利申请号243929、359428和360433(Drs.Offord和Rose)和文献(Fisch I.，Kunzig G.，Rose K.，and Offord R.，Site-Specific Modification of a Fragment of a Chimeric Monoclonal Antibody Using Reverse Proteolysis，Bioconj，Chem.，3，PP.147-153，1992)中。另外的方法包括编码酶和抗体分子的官能部分的基因的无性繁殖和融合、将这些基因融合在一起和在适合的宿主细胞中表达融合的蛋白质。这类融合蛋白质已被制备出来。(欧洲专利申请号392745AZ)。此外，结合物在降解(degratory)器官如肝和脾不应该进行新陈代谢，这是一种能够防止足够的结合在靶组织上累积的相互作用。然而，另一方面，最好是，在该结合物已有机会对靶组织定位后，结合物很快从血液中释放出来。这些药物动力学特性的两个方面将减少在除靶组织之外的部位上产生胞毒剂的机会。通过具有低分子量的结合物有助于这些药物动力学特性的发挥，这是一种由抗体片段特别是F(ab′)片段供给的特性。沿着相同的思路，由于与抗体片段相同的理由，具有低分子量(如50，000或更低)的酶是优选的。
所说的抗体-酶结合物的优选实例包括A.如上所述的结合物，其中另外酶是β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶、焦谷氨酸酯氨肽酶或D-氨肽酶;
B.A的结合物，其中另外酶是β-内酰胺酶;
C.B的结合物，其中另外抗体与单独表达的抗原络合，或以超自然丰度存在于恶性肿瘤细胞的抗原络合;
D.C的结合物，其中另外抗体与癌胚抗原络合;
E.C的结合物，其中另外抗体与与KSI/4抗原络合;
F.C的结合物，其中另外抗体与TAG-72抗原络合;
G.C的结合物，其与MAT-65抗原络合;
H.D的结合物，其中另外抗体被称为ZCE025;
I.D的结合物，其中另外抗体被称为CEM231.6.7;
J.C的结合物，其中另外抗体被称为T101;
K.C的结合物，其中另外抗体被称为CC49;
L.C的结合物，其中另外抗体被称为007B;
M.C、D、E、F、G、H、I、J、K或L的结合物，其中另外抗体是F(ab′)片段，且酶是β-内酰胺酶(来自Enterobacter cloacae)。
本发明另外的方面是式Ⅱ化合物底物-胞毒剂 Ⅱ式中底物是对于酶或其活性片段的底物，其中所说的酶与底物-胞毒药物的反应引起该底物与胞毒剂的化学分离，并且，通过由在该底物上的合适的活性基团形成的醚基、硫醚基、酯基、酰氨基、氨基、酰肼基、碳酸酯基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、氮杂氨基甲酸酯基、硫酯基、硫代酰氨基或硫代碳酸酯基和在胞毒剂上的羟基、硫醚基、氨基、酰氨基、酰肼基、羧基或氨基甲酸酯基使底物和胞毒剂结合在一起。另一种方法是，底物可以是胞毒剂的前体。
术语“胞毒剂”指的是对治疗良性或恶性瘤是有用的化合物。通常，这类药物包括烷基化剂、抗增殖剂、结合微管蛋白剂、普通的细胞毒素等。这类优选的化合物是氮芥剂、抗叶酸、核苷类似物、长春花属生物碱、蒽环型药、丝裂霉素、博来霉素、胞毒核苷、蝶啶科药物、鬼臼毒素、磺酰脲(如1987年5月20日公开的欧洲专利申请号222，475中所述)和低分子量毒素如单端孢菌素和秋水仙素。那些特别有用的一类化合物包括，例如，阿霉素、道诺霉素、氨基喋呤、氨甲喋呤、红豆杉醇、甲喋呤、二氯氨甲喋呤、丝裂霉素C、波福霉素、5-氟脲嘧啶、6-巯基嘌呤、胞嘧啶、阿拉伯糖苷、鬼臼毒素、鬼臼乙叉甙、苯丙氨酸氮芥、长春花碱、长春新碱、脱乙酰基长春花碱酰肼、长春西定、长春碱酰胺、长春素、单端孢菌素、脱乙酰基秋水仙素等。当然，普通有经验的化学家对所述的优选的和一般的化合物可做出不重要的化学上的修改，以便使它们的反应更简便。
当然，可由优选的胞毒剂来制备优选的底物-胞毒剂化合物。式Ⅱ化合物的优选实例在下面列出。在下述的列举中，每种新的优选实例都带有所有的定义和其关于对上述实例的限制。同样认为，在本说明书中涉及的酶也指的是其活性片段。因此，本发明在这方面的优选实例包括A.式Ⅱ化合物，其中底物是对于β-内酰胺酶、L-焦谷氨酸酯氨肽酶、β-半乳糖苷酶或D-氨肽酶的底物;(例如，对于β-内酰胺酶的底物可以是青霉素、青霉烯、羧苄、青霉烯(Carbapenem)、头孢菌素、头孢菌素亚砜、1-氨甲酰脱硫头孢菌素(1-Carbadethi acephalosporin)或1-含氧脱硫头孢菌素;)B.实例A的化合物，其中底物是ⅰ)下式的头孢菌素
式中zz为0或1，R1为由C1至C30烷基衍生而来的酰基，R2为氢、有机或无机阳离子、羧基保护基，或无毒代谢不稳定的酯形成的基;
ⅱ)L-焦谷氨酸酯;
ⅲ)β-D-半乳糖;
ⅳ)D-氨基酸，特别是D-丙氨酸;
C.实例B的化合物，其中底物是下式的头孢菌素
D.实例C的化合物，式中R1是ⅰ)C1至C4烷基、C1至C6取代的烷基、C1至C4烷氧基、C1至C4烷硫基或下式的基团
或保护的氨基和/或其保护的羧基衍生物;
ⅱ)下式的基团
式中每个R5、R6和R7独自为氢、卤素、羟基、保护的羟基、硝基、氨基、保护的氨基、胺盐、氰基、三氟甲基、氨甲基、保护的氨甲基、N-(甲基或乙基磺酰基)氨基、C1至C6烷基或C1至C4烷氧基;R4为羟基、保护的羟基、甲酰氧基、氨基、保护的氨基、胺盐、羧基、羧酸盐、保护的羧基、苯基羧酸酯、(5-茚满基)羧酸酯、磺酸、磺酸盐、叠氮基、卤素或C1至C6烷基;R6为C1至C4烷氧基;z为氧或硫;n为0、1、2或3;和m为0或1;
ⅲ)下式的基团
式中R9为杂环;R10为羟基、保护的羟基、甲酰氧基、氨基、保护的氨基、胺盐、羧基、羧酸盐、保护的羧基、苯基羧酸酯、(5-茚满基)羧酸酯、磺酸、磺酸盐、叠氮基、卤素或C1至C6烷基;n为0、1、2或3;和z为氧或硫。
E.实例D的化合物，式中胞毒剂为下式
式中R12为氨基或羟基;
R13为氢或甲基;
R14为氢、氟、氯、溴、碘;
R15为羟基或构成羧酸盐的部分;
式中R17为氨基、C1-C3烷基氨基;二(C1-C3)烷基)氨基或C4-C6多亚甲基氨基;
式中R19为氢或甲基;
R20为甲基或噻吩基;
式中R21为H、CH3或CHO;当R23和R24单独选取时，R24为H，R22和R23之一为乙基，且另一个为H或OH;当R23和R24与他们所连接的碳在一起时，他们形成环氧乙烷环，而此时R22为乙基;R25为氢、(C1-C3烷基)-CO-、或氯取代的(C1-C3烷基)-CO;P为0或1;R26为一个键、-(C2-C4烷基)X，或要求P为1且该基团本身又连到羰氧基上的基团;X为-O-、-S-或-NH-;
式中R28为氢、甲基、溴、氟、氯或碘;
R29为-OR18或-NHR18;
R30为氢、溴、氯或碘;
其中A为-O-、-NCH3-、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2O-;
D为-CH2-或-O-;
R31为氢或卤素;
R32为卤素或三氟甲基;
5-氟尿嘧啶或去乙酰基秋水仙碱在上面优选的式子中，式Ⅲ化合物代表蒽环类化合物;式Ⅳ代表氨甲蝶呤类化合物;式Ⅴ代表丝裂霉素;式Ⅵ代表博莱霉素;式Ⅶ代表苯丙氨酸氮芥;式Ⅷ代表6-巯基嘌呤;式Ⅸ代表胞嘧啶阿拉伯糖苷;式Ⅹ代表鬼臼素;式Ⅺ代表长春花属药物;式Ⅻ代表二氟核苷及式ⅩⅢ和式ⅩⅣ代表磺酰基脲化合物。
F.实例E的化合物，其中R1为乙酰基、丙酰基、异丙酰基、新戊酰基、丁酰基、甲氧甲基乙酰基、苯乙酰基、苯氧基乙酰基、2-(氨甲基)苯乙酰基、2-苯基-2-羟基乙酰基、2-苯基-2-(磺酸钠基)乙酰基、2-苯基-2-羧基乙酰基、2-(4-羟基苯基)-2-羧基乙酰基、2-苯基-2-氨基乙酰基、2-(4-羟基苯基)-2-氨基乙酰基、2-(3-(N-(甲磺酰氨基))苯基)-2-氨基乙酰基、2-苯基-2-(5-(2，3-二氢化茚基)羧酸酯基)乙酰基、2-苯基-2-(苯基羧酸酯基)乙酰基、2-苯基-2-叠氮基乙酰基、2-苯氧基丙酰基、2，5-二甲氧基苯甲酰基、2-(甲酰氧基)-2-苯乙酰基、2-(2-乙氧基萘-1-基)乙酰基、2-(萘-1-基)-2-氨基乙酰基、2-(萘-2-基)-2-氨基乙酰基、2-(2，5-二氯苯硫基)乙酰基、2-(3，4-二氯苯硫基)乙酰基、2-(1-四唑基)乙酰基、2-(N-(3，5-二氯吡啶-4-氧基))乙酰基、2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酰基、2-(2-噻吩基)乙酰基、2-(4-吡啶硫基)乙酰基、2-(N-甲基-4-吡啶鎓硫基)乙酰基、2-(2-氨基-4-苯基噻唑-5-基)乙酰基、2-(3-羟基-4-羧基异噻唑-5-基硫基)乙酰基、3-苯基-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、3-(2-氯苯基)-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、3-(2，5-二氯苯基)-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、3-(2-氟-5-氯苯基)-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、2-(2-噻吩基)-2-氨基乙酰基、2-(2-噻吩基)-2-(羧酸钠盐)乙酰基、2-(N-(4-吡啶鎓))乙酰基、2-(2-苯并噻吩基)乙酰基、2-(3-苯并噻吩基)乙酰基、2-(2-苯并呋喃基)乙酰基及2-(3-苯并呋喃基)乙酰基;
G.实例F的化合物，其中胞毒剂是氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇、去乙酰基长春花碱酰肼基羧基部分、7-(羧基氨基)去乙酰基秋水仙碱部分、或阿霉素;
H.实例G的化合物，其中R1为2-(噻吩-2-基)乙酰基、ZZ为零;
I.实例H的化合物，其中胞毒剂为氨甲蝶呤;
J.实例I的化合物，其中氨甲蝶呤通过其羧酸酯基键连到头孢菌素底物上;
K.实例H的化合物，其胞毒药为5-氟尿嘧啶;
L.实例K的化合物，其中5-氟尿嘧啶通过其N-1氮原子键连到头孢菌素底物上;
M.实例H的化合物，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇;
N.实例M的化合物，其中去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇通过其氨基乙硫醇部分的硫醇基键连到头孢菌素部分;
O.实例H的化合物，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱酰肼基羧基部分;
P.实例O的化合物，其中去乙酰基长春花碱部分通过酰肼基羧基的氧原子键连到头孢菌素底物上;
Q.实例G的化合物，其中R1为2-(噻吩-2-基)乙酰基，ZZ为1;
R.实例Q的化合物，其中胞毒剂为7-(羧基氨基)去乙酰基秋水仙碱部分;
S.实例R的化合物，其中7-(羧基氨基)去乙酰基秋水仙碱部分通过7-(羧基氨基)基团的氧原子键连到头孢菌素底物上;
T.实例Q的化合物，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇;
U.实例T的化合物，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇;
V.实例Q的化合物，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱酰肼基羧基部分;
Ⅳ.实例V的化合物，其中去乙酰基长春花碱酰肼羧基部分通过酰肼基羧基的氧原子键连到头孢菌素部分上;
X.实例Q的化合物，其中胞毒剂为阿霉素;
Y.实例X的化合物，其中阿霉素部分通过氨基糖化物的氮原子键连到头孢菌素亚砜基的3-(羰基氧基亚甲基)的羰基碳上;
Z.实例G的化合物，其中R1为苯氧基乙酰基，ZZ为1;
AA.实例Z的化合物，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱酰肼基羧基部分;
BB.实例AA的化合物，其中去乙酰基长春花碱酰肼基羧基部分通过氨基羧基的氧原子键连到头孢菌素底物上。
CC.经BB的实例Ⅰ化合物，其中R2为氢、钠阳离子，或钾阳离子。
当然，式Ⅱ化合物也可以作为溶剂化物和水合物存在。因此，这些化合物可以与如水合的水、或与一个或数个或任意份数的母液溶剂的分子结晶。溶剂化物和水合物包括在本发明范围之内。
类似地，式Ⅱ化合物可以作为药物可接受的盐存在。这些化合物既包括酸性官能基如羧基和磺酸基的盐，也包括碱性官能基如氨基的盐。这类盐包括下面所述的有机和无机阳离子加上碱性基团与如下的酸通过酸碱反应形成的盐，所述酸有盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、富马酸、棕榈酸、胆酸、Pamoic、半乳糖二酸、D-谷氨酸、d-樟脑酸、戊二酸、苯二甲酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸，等等。
在上述优选实施方案中所用的术语R1代表的“由C1至C30羧酸衍生的酰基”是指已被键连到青霉素的C-6氨基上，头孢菌素、1-亚砜头孢菌素、1-氧杂去硫杂头孢菌素或1-氨基甲酰基头孢菌素的C-7氨基上，及单环β-内酰胺(如氨噻单菌胺系列)的C-3氨基上的酰基。“由C1至C30羧酸衍生的酰基”可以被杂原子任意隔开。这类酰基的实例可参见文献如由Edwin W.Flynn编辑的“Cephalosporins and Penicillins，Chemistry and Biology”，Academic Press，New York 1972和由Robert B.Morin与Marvin Gorman编辑的“Chemistry and Biology of β-lactam Antibiotics”Vols.1、2和3，Academic Press，New York 1982。
在R1上的酰基的实例还可以参见下列专利文献Yoshioka M.等人，美国专利4，478，997(1984年10月23日颁布);Belleau B.R.等人，美国专利4，172，199(1979年10月23日颁布);Kamiya T.等人，美国专利4，472，300(1984年9月18日颁布)(特别是25栏至36栏)，它们均被引入本文作为参考文献。“由C1至C30羧酸衍生的酰基”的其他实例可以参见Koster等人的美国专利4，478，749(1984年10月23日颁布)。
术语“有机或无机阳离子”指羧酸盐的羧酸根阴离子的抗衡离子。抗衡离子选自碱金属和碱土金属，如锂、钠、钾、钡和钙;铵;及有机阳离子如二苄基铵、苄基铵、2-羟基乙基铵、双(2-羟基乙基)铵、苯乙基苄基胺、二苄基亚乙基二铵，等等。上面术语包含的其他阳离子包括质子化形式的普鲁卡因、奎宁和N-甲基葡糖胺，质子化形式的碱性氨基酸，如甘氨酸、鸟氨酸、组氨酸、苯基甘氨酸、赖氨酸和精氨酸。此外，该术语优选由羧酸和氨基形成的瞬时化合物的任何两性离子形式。
在说明书中所用的术语“羧基保护基”是指通常用于保护羧酸基而使反应在化合物的其他官能基上进行的羧酸基的酯衍生物之一。这些羧酸保护基的实例包括2-硝基苄基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、2，4-二甲氧基苄基、2，4，6-三甲氧基苄基、2，4，6-三甲基苄基、五甲基苄基、3，4-亚甲基二氧基苄基、二苯甲基、4，4′-二甲氧基二苯甲基、2，2′，4，4′-四甲氧基二苯甲基、叔丁基、叔戊基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基，4，4′-二甲氧基三苯甲基、4，4′，4″-三甲氧基三苯甲基，2-苯基丙-2-基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、苯甲酰甲基、2，2，2-三氯乙基、β(三甲基甲硅烷基)乙基、β-((二正丁基)甲基甲硅烷基)乙基、对甲苯磺酰基乙基、4-硝基苄基磺酰基乙基、烯丙基、肉桂基、1-(三甲基甲硅烷基甲基)丙-1-烯-3-基等基团。所用的羧基保护基的种类并非关键，只要衍生的羧酸对于在头孢菌素分子的其他位置上的后续反应的条件是稳定的，并能在适当的时候被除去而不破坏分子的其余部分。优选的羧酸保护基是烯丙基。用于头孢菌素、青霉素及肽领域的类似的羰基保护基也可用于保护瞬时头孢菌素底物的羧基取代基。这些基团的其他实例参见Haslam E“Protective Groups in Organic Chemistry”，McOmie H.G.W.，Ed.，Plenum Press，New York.N.Y.1973，第5章，和Greene T.W.“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley & Sons，New York，N.Y.1981，第5章。相关术语是“保护的羧基”，它是指被上面羧基保护基之一取代的羧基。
术语“无毒的代谢不稳定的成酯基”是指那些生物活性酯形式。它们诱发血浓度增加并延长相应的未酯化形式化合物的功效。这类酯基包括低级烷氧基甲基，例如甲氧基甲基、乙氧基甲基、异丙氧基甲基等;α-(C1至C4)烷氧基乙基，例如甲氧基乙基、乙氧基乙基、丙氧基乙基、异丙氧基乙基等;2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基甲基，如5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基甲基、5-苯基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基甲基等;C1至C3烷硫基甲基，如甲硫基甲基、乙硫基甲基、异丙硫基甲基等;酰氧基甲基，如新戊酰氧基甲基、α-乙酰氧基甲基等;乙氧羰基-1-甲基;α-酰氧基-α-取代甲基，如α-乙酰氧基乙基;2-苯并[C]呋喃酮基或5，6-二甲基-2-苯并[C]呋喃酮基;1-(C1至C4烷氧羰基氧基)乙-1-基如1-(乙氧羰基氧基)乙-1-基;和1-(C1-C4烷基氨基羰基氧基)乙-1-基，如1-(甲氨基羰基氧基)乙-1-基。
与上面实例D一起使用的几个术语应予以定义。因此，术语“C1-C6烷基”代表基团如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、叔戊基、己基等等。
术语“C1-C6取代的烷基”代表被一个或两个下列取代基取代的上述C1-C6烷基。所述取代基有卤素、羟基、保护的羟基、氨基、保护的氨基、C1-C7酰氧基、硝基、羧基、保护的羧基、氨基甲酰基、氨基甲酰氧基、氰基、甲磺酰基氨基或C1-C4烷氧基。取代的烷基可以用相同或不同的取代基取代一次或两次。
本文所用的术语“C1-C4烷氧基”代表基团如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基等基团。
上面定义中所用的术语“保护的氨基”是指被一个常用的氨基保护基取代的氨基，如叔丁氧羰基(t-BOC)、苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、三甲基甲硅烷基等氨基保护基。这类氨基保护基的性质并非关键，只要保护的氨基官能团在下述反应条件下是稳定的。
术语“保护的羟基”是指在合成头孢菌素底物化合物的后续步骤的反应条件下是稳定的，但之后易于裂解的任何基团。这类基团包括甲酰氧基、氯乙酰氧基、二苯甲基氧基、三苯甲基氧基、三甲基甲硅烷基，等等。
在前面的定义中，羟基、氨基及羧基保护基没有被完全限定。这类基团的作用是在制备所需产物的过程中保护反应性官能基团，然后在不破坏分子其余部分的前提下将其除去。许多这类保护基是本领域已知的，其他基团的使用同样适用于本发明的方法和化合物，如下列文献中所述基团被认为是适宜的McOmie J.F.W.，“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press，1973和Greene T.W.，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley & Sons，New York，N.Y.1981。因此，对于本说明书中提及的“保护基团”声明其没有新颖性或创造性。
术语“杂环”当与术语“由C1至C30羧酸衍生的酰基”一起使用时是指Durckheimer W.等人的美国专利4，278，793中的环。具体实例为未取代的或取代的环，如四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、吡啶基、4-吡啶酮基、吡啶、苯并噻吩基、苯并呋喃基或吲哚基。当然，这些实例可以用Durckheimer等人的4，278，793号专利中所述的取代基取代。
本发明的第三方面是治疗肿瘤疾病的治疗方法，该方法包括
1)给感染的宿主服用治疗有效量的式Ⅰ的抗体-酶结合物化合物;然后2)给感染的宿主服用治疗有效量的上述式Ⅱ的底物-胞毒剂。
应当理解，术语“治疗有效的”当其涉及底物-胞毒剂时将是足以引起某些靶肿瘤细胞死亡的量，它还可以指为使肿瘤疾病减轻而使用该药，或者通常以足以预防的量使用该药。
通常，术语“治疗有效的”是指对于眼前的具体目的相对于胞毒剂本身给出至少相同量的底物-胞毒剂。在本发明中可以给出较大量的底物-胞毒剂，因为胞毒剂的毒性起初被连接的底物掩蔽，但随后在其释放点通过与抗体酶结合物反应而被解蔽，这样便减轻了对病人的副作用，这种副作用通常与胞毒剂本身的量有关。
抗体-酶结合物的治疗有效的剂量是向感染的宿主释放1至500优选1至50mg抗体(或其断片)的量。
下面列出本发明方法的优选实施方案。关于本发明的化合物方面，下面所列的实施方案包含了对它涉及的实施方案的限制和定义。本发明方法的优选实施方案的实例包括A.一种方法，其中底物是对β-内酰胺酶、焦谷氨酸氨基肽酶、β-半乳糖苷酶或D-氨基肽酶的底物，及抗体-酶结合物化合物，其中酶是β-内酰胺酶、焦谷氨酸氨基肽酶、β-半乳糖苷酶或D-氨基肽酶;
B.A方法，其中酶是β-内酰胺酶;
C.B方法，其中抗体与单独地或以超自然丰度存在于恶性肿瘤细胞上的抗原络合;
D.实例C的方法，其中底物是下式的头孢菌素
其中ZZ为0或1;R1为由C1至C30烷基衍生的酰基，R2是氢、有机或无机阳离子、羧基保护基、或无毒的代谢不稳定的成酯基;如对于本发明底物-胞毒剂方面的优选实例B所定义的那些术语;
E.实例D的方法，其中抗体与癌胚抗原络合;
F.实例D的方法，其中抗体与KS1/4抗原络合;
G.实例D的方法，其中抗体与TAG-72抗原络合;
H.实例D的方法，其中抗体与MAT65抗原络合;
I.实例E的方法，其中R1与式Ⅱ化合物的优选实例D中的R1相同;
J.实例I的方法，其中胞毒剂是式Ⅱ化合物的优选实例E中所列的通式化合物;
K.实例J的方法，其中R1与式Ⅱ化合物的优选实例F中的R1相同;
L.实例K的方法，其中胞毒剂是氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇、去乙酰基长春花碱氨基羧基部分、7-(羧基氨基)去乙酰基秋水仙碱部分;或阿霉素;
M.实例L的方法，其中头孢菌素底物的R2为2-(噻吩-2-基)乙酰基，ZZ为0;
N.实例M的方法，其中抗体被称为CEM231.6.7;
O.实例N的方法，其中胞毒剂为氨甲蝶呤;
P.实例O的方法，其中氨甲喋呤通过羧基键连到头孢菌素底物上;
Q.实例N的方法，其中胞毒剂为5-氟尿嘧啶;
R.实例Q的方法，其中5-氟尿嘧啶通过其N-1氮原子键连到头孢菌素底物上;
S.实例N的方法，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇;
T.实例S的方法，其中去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇通过氨基乙硫醇的硫醇基键连到头孢菌素部分上;
U.实例N的治疗方法，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱氨基羧基部分。
V.实例U的治疗方法，其中去乙酰基长春花碱酰肼基羧基部分通过酰肼基羧基的氧原子键连到头孢菌素底物上。
W.实例L的治疗方法，其中R1为2-(噻吩-2-基)乙酰基，ZZ为1。
AA.实例X的治疗方法，其中胞毒剂为7-(羧基氨基)去乙酰基秋水仙碱部分。
BB.实例AA的治疗方法，其中胞毒剂为7-(羧基氨基)去乙酰基秋水仙碱部分。
CC.实例X的治疗方法，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇。
DD.实例CC的治疗方法，其中去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇通过硫醇基键连到头孢菌素底物上。
EE.实例X的治疗方法，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱酰肼基羧基部分。
FF.实例EE的治疗方法，其中去乙酰基长春花碱酰肼基羧基部分通过酰肼基羧基的氧原子键连到头孢菌素底物上。
GG.实例W的治疗方法，其中胞毒剂为阿霉素。
HH.实施例GG的治疗方法，其中阿霉素通过氨基糖化物的氮原子键连到头孢菌素底物上。
II.实例L的治疗方法，其中R1为(苯氧基)乙酰基，ZZ为1。
JJ.实例II的治疗方法，其中胞毒剂为去乙酰基长春花碱酰肼基羧基部分。
KK.实例JJ的治疗方法，其中去乙酰基长春花碱酰肼基羧基部分通过酰肼基羧基的氧原子键连到头孢菌素底物上。
LL.实例N至KK的方法，其中抗体为F(ab′)断片。
本发明的底物-胞毒剂化合物可以通过各种已知的方法合成。因此，在Sn 1或Sn 2条件下，底物的亲核基团可用于取代胞毒剂的亲电中心处的离去基团，或反之亦然。可能会干扰所需官能基团的反应的底物及胞毒剂上的羧基、氨基、硫醇基或羟基可以在反应之前用保护基掩蔽起来，然后在反应之后去保护。在其他处适宜的保护基的使用被描述在上面提到的McOmie和Greene的著作中。对本发明胞毒剂化合物所要求的是，当受酶的作用同底物化学分离之后，胞毒剂应是有效的抗肿瘤剂，以及底物与胞毒剂的衍生作用不会极大地降低底物与酶的反应性。优选的是底物-胞毒剂化合物掩蔽胞毒剂的毒性，或是细胞毒性不大于未取代的胞毒剂细胞毒性的70%。
对本发明方法来说，最好是酶具有适当的催化速率。由于酶将遇到浓度不充足的底物(以底物-胞毒剂化合物形式)，所以特别重要的是酶-底物结合物具有高的Kcat/Km比。因此，最好选择具有至少1×106M-1S-1Kcat/Km比的酶。当酶结合到抗体上时在酶中优选此相同的比例。类似地，优选抗体对靶肿瘤细胞上的抗原具有高的亲合性，优选约1×106(升/摩尔)或更高。此外最好是结合的抗体保持其未结合的活性的80%，因此当结合时优选具有60%免疫反应性。
将酶结合到抗体上是通过蛋白质化学领域的标准方法来完成的。也可以通过上述Offord和Rose方法来制备结合物，或通过基因融合产生融合蛋白(欧洲专利申请392745，
公开日为1990年10月17日;Neuberger M.S.等人，Nature，312，P.604，1984;Seehaus T.等人，Gene，114，P.1，1992)。可以使用不同双官能试剂和同双官能试剂。因此，可以用MBS、Sulfo-MBS、SMCC、Sulfo-SMCC、SIAB、SPDP、Sulfo-SMPB、DIDS、DFDNB、BMH(它们可从市场上买到)等来制备本发明的结合物。产生的结合的纯化可以用适当的已知的色谱方法如凝胶渗透或离子交换法来完成。这样，本发明中酶与抗体结合的方法便没有任何新颖性。优选的是调节结合反应(及纯化)的化学计量和其他条件，以便产生1∶1抗体∶酶结合物，不过在结合物中具有不成比例地较大量的任一成分的结合物均包括在本发明中。
在选择了抗体和酶后，本领域技术人员必须决定是使用完整的抗体还是使用其断片。制备断片的方法，例如用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶被详述于M.Brennan等人，Science，229，PP.81-83，1985和M.Glennie等人，J.Immunology，139，PP.2367-2375，1987中，对此本文将不再讨论，但要提到的是F(ab′)是本发明抗体的优选形式。
用上述标准分离出酶之后，将其结合到如上所述的适当的抗体上，纯化结合物，用凝胶电泳分析结合物。此外，高压液相色谱(HPLC)也可用于分析结合物。
再测定结合物的酶活性，这次使用键连到分子上的底物，而分子赋予底物(或该分子本身)断裂时可测的分光光度变化，从而测定Kcat和K。这一测定将表明在经过结合步骤后酶是否保持了它的活性。下一待测参数是结合物的体外免疫反应性。该测量通常是首先将结合物进行放射性标记(例如用125I)，用靶抗原涂敷固体表面(例如，小塑料珠或微滴定板穴)。这一测定将检测结合物的抗体部分在结合步骤中是否已被不可接受地改变了。当用底物-胞毒剂测定结合物的Kcat和KM时便完成了第一步，即观察本发明方法的组分在靶抗原的存在下是否起了作用。(通过酶释放游离的胞毒剂可以由色谱图显示出来)。然后研究结合物以确定它在体内是否会集中于肿瘤上。这一研究的完成通常是将放射性标记的结合物注射给带有肿瘤的小鼠，所述肿瘤表达了靶抗原，然后将小鼠处死并检测存在于肿瘤和各种器官中的放射性的量。该研究将表明结合物是集中于肿瘤，或是不可接受地靶射无病器官，此外或是由于其作为外来蛋白的状态而被代谢。
当测定出结合物是集中于肿瘤时，必然表明底物-胞毒剂将被集中的结合物断裂。因此，或用结合物或只用酶(对于对照样)将表达细胞的靶抗原悬浮并培养。将这样处理的细胞再悬浮于另一量的缓冲液中，然后用含有两倍化合物的底物培养，以使裂解之前和之后在可见光谱的不同波长处发生成对吸收。然后测定这些悬浮液的上清液以确定含结合物的悬浮液是否表现出时间和浓度对加入的结合物的量的依赖关系。这样，如果对照样表现出这种依赖性，那么除结合物之外的某些条件将会引起裂解。假定在前面的试验中本发明的组分显示出集中的结合物确定是引起底物-胞毒剂裂解的试剂，则应当在试验动物如小鼠中测定结合物的血清动力学，以便确定在将结合物给药后是否及何时可给受感染的宿主服用底物-胞毒剂。最好是结合物显示出短的血清半衰期，以便在将结合物给药后可以在适当的时间内(如72小时)将底物-胞毒剂分子给药。当已发现结合的血清半衰期为可接受的，便可测定集中于试验动物如小鼠体内的结合物的酶活性。将结合物给带有靶肿瘤的小鼠服用，经过足够的时间使结合物集中后，将小鼠处死并切除其肿瘤。将肿瘤切碎并用产色素的底物培养。测定这些悬浮液的上清液的酶活性的标记。
如果本发明方法的组分已成功地克服了所有这些障碍，便可测定该组分的体外细胞毒性。
然后将靶细胞用结合物悬浮并培养。之后将处理的细胞用底物-胞毒剂再悬浮并培养。通过吸收随后加到培养介质中的放射性标记的营养物调节细胞生长。评价本发明方法的最后步骤是评价在裸的小鼠肿瘤模型研究中组分的效力。
本发明的另一方面是式Ⅰ的抗体-酶结合物和式Ⅱ的底物-胞毒剂化合物的药物组合物。特别是这些药物组合物可用于治疗本发明的肿瘤疾病，并且包含适当的载体和治疗有效量的式Ⅰ结合物或式Ⅱ化合物。
对于口服给药的组合物(例如片剂和胶囊剂)，术语“适当的载体”是指常用的赋形剂，如粘合剂，例如糖浆剂、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(Povidone)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉;填充剂或载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、磷酸-氢钙、氯化钠和藻酸;崩解剂如croscarmellose sodium、微晶纤维素、玉米淀粉、羟基乙酸淀粉钠、藻酸及可变润湿剂如十二烷基硫酸钠;和润滑剂，如硬脂酸镁及其他金属硬脂酸盐、硬脂酸、硅氧烷流体、滑石粉、蜡油及胶体硅。还可以使用调味剂如薄荷、冬青油、樱桃调味剂等，最好是加入着色剂以使剂型外表更加美观好看，或有助于确认该产品。片剂还可以用本领域已知的方法包衣。
本发明的药物组合物还可以是口服液体制剂，它们或是a)含水或油状悬浮液、溶液、乳液或糖浆剂;或是b)在使用前可用水或另一适当介质重新构成的干燥粉末。当同这种口服液体制剂一起使用时，术语“适当的载体”是指常规的添加剂，如悬浮剂，例如山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用油例如杏仁油、分馏的椰子油、油酯，丙二醇或乙醇;防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，或山梨酸。
药物组合物也可以用于静脉内的应用(Ⅳ)。特别是可以将水溶形结合物或底物-胞毒剂溶于一种常用的静脉内流体中，并通过输注给药。当同用于用途Ⅳ的组合物一起使用时，术语“适当的载体”是指流体如生理盐水、林格溶液或5%葡萄糖溶液。
对于肌内用制剂，可以用“适当的载体”配制结合物或底物-胞毒剂化合物(例如，盐酸盐或钠盐)的适当的盐形式的无菌制剂。这种无菌制剂的实例是或溶于药物稀释剂(例如注射用水，生理盐水，5%葡萄糖)中或悬浮于水基或药物可接受的油基(例如长链脂肪酸酯如油酸乙酯)中的适当的盐形式。
局部的组合物可以用“适当的载体”如疏水或亲水基来配制。这类基质包括软膏、乳油或洗液。
结合物和底物-胞毒剂化合物的曾用药物组合物可以被配制到耕作动物的饲料或饮水中。此外，可以用“适当的载体”如长或快释放基质将结合物或底物-胞毒剂化合物配制成乳房内制剂。
也可以将式Ⅰ的抗体-酶结合物和式Ⅱ的底物-胞毒剂化合物以单位剂形配制在无菌小瓶、包含带隔膜的出口的无菌塑料囊或无菌密封的安瓿中。结合物或化合物(或相应的药物可接受的盐)可以是干燥粉末或是结晶或冻干形式。每单位剂量的结合物或底物-胞毒剂化合物的量可以是约5毫克至约10克。
下列实验和方法用于进一步说明本发明。除非另外指出，下面所用的缩写具有相关领域中通常涉及它们的意义。n.m.r.谱是通过General Electric G.E.-300仪器作出的。红外光谱通过Perkin-Elmer281仪器得到。紫外光谱通过Cary 118仪器得到(除了实施例7和方法6至13，其中U.V.谱通过Hewlett-Packard 8451A仪器得到)。快速原子轰击质谱通过VG ZAB-3仪器得到。
方法17-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-乙酰氧基亚甲基-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯将7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(乙酰氧基亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸钠(11.0g)溶于1∶1DMF和水的混合物。加入烯丙基溴(3.6g)，将反应混合物在室温氮气氛下搅拌48小时。用乙酸乙酯然后用0.1N盐酸稀释反应混合物。分离有机层并经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，得到橙色油状物。将此油状物在装有100-200目活性硅胶载体的3吋柱上用乙酸乙酯洗脱进行快速色谱纯化。经放置由某些含产物馏份形成白色晶体。过滤收集这些晶体，然后用1∶1氯仿∶乙醚重结晶并干燥，得到5.5g标题产物。NMR(300MHz，CDCl3)δ7.25(d，1，J＝7);7.0(m，2);6.27(br.d，1，J＝9)，6.0-5.8(m，1);5.83(dd，1，J＝5.9);5.4-5.2(m，2);5.06(1/2 ABq，1，J＝14);4.96(d，1，J＝5);4.81(1/2 ABq，1，J＝14);4.74(br.d，2，J＝6);3.85(s，2);3.55(1/2 ABq，1，J＝18);3.33(1/2 ABq，1，J＝18);2.06(s，3).
方法27β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(碘甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯将7β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-乙酰氧基甲基-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯(5.01g，11.5mmol)溶于二氯甲烷(55ml)中，加入TMSI(3.27ml)，所得溶液在室温搅拌70分钟。将溶液用乙酸乙酯稀释，然后依次用冰冷的10%硫代硫酸钠、饱和碳酸氢钠水溶液及盐水洗涤。溶液经硫酸钠干燥，真空浓缩，得到4.6g(产率79%)标题产物，为带有桔黄色的泡沫状物NMR
(300MHz，CDCl3)δ7.25(d，1，J＝7);7.0(m，2);6.42(d，1，J＝9);6.0-5.85(m，1);5.78(dd，1，J＝5，9);5.4-5.2(m，2);4.95(d，1，J＝5);4.74(d，2，J＝6);4.38(ABq，2，J＝10);3.85(s，2);3.72(1/2 ABq，1，J＝18);3.44(1/2 ABq，1，J＝18).
实施例17β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((氨甲喋呤-γ-酯)亚甲基)-3-头孢烯-4-烯丙基酯将7β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(碘甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯(4.6g，9.1mmol)、氨甲蝶呤-γ-酯(4.6g，9.1mmol，Sigma)、DMF(50ml)和碳酸氢钠(1.54g，18.25mmol)混合。将溶液在室温搅拌18小时，然后滴加到乙酸(4ml)水(400ml)溶液中。收集产生的沉淀并真空干燥，得到约7g粉末。将粉末通过硅胶柱用15%甲醇∶2%乙酸的氯仿溶液洗脱进行快速色谱纯化，得到约2.1g桔黄色固体。将固体通过硅胶快速色谱纯化，用梯度为10%甲醇∶1%乙酸的氯仿溶液至2%乙酸的氯仿溶液洗脱，然后用15%甲醇和2%乙酸的氯仿溶液洗脱，得到1.06g标题产物(Rf＝0.5，用2%HOAc、15%MeOH的氯仿溶液)IR(KBr)1782，1730，1607，1562，1513cm-1.FABMS计算值 C37H38N10O9S2Na＝853.2162.
实测值＝853.2106.UV(EtOH) λmax＝370(ε＝3290);297(ε＝12000);260(ε＝13300).NMR(300MHz，DMSO-d6)δ 9.42(bd，1，J＝8);9.13(d，1，J＝9);8.52(s，1)，7.45-6.7(m，5);6.6(bs，2);5.88(m，1，烯丙基CH);5.39(dd，1，J＝5，8);5.35-4.55(m，7)与4.7(s，2)叠加;4.16(m，1);3.70(s，2);3.50(ABq，2，J＝10);3.2(s，3);2.1(m，2);1.9(m，2).
实施例27β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((氨甲蝶呤-γ-酯)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸将乙酸钯(Ⅱ)(3mg，0.013mmol)和三苯基膦(14mg，0.053mmol)在乙酸乙酯(0.5ml)中混合。将7β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((氨甲蝶呤酯)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯(130mg，0.15mmol)悬浮于1∶1∶1乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸混合物中，之后加入三乙基甲硅烷(0.1ml)。将所得反应混合物搅拌16小时然后真空浓缩。浓缩物用水(15ml)稀释，通过加入NaHCO3将溶液pH调节到7。所得溶液与乙酸乙酯分层并将混合物搅拌1小时。过滤、相分离，水相用另外的乙酸乙酯萃取，然后冷冻干燥。
冷冻干燥的固体在C18反相柱上经过中压液相色谱纯化。将该柱先用15%乙腈水溶液平衡。然后将冻干物装在柱上，先用30%乙腈∶1%乙酸水溶液(600ml)洗脱;然后用40%乙腈∶1%乙酸水溶液洗脱。将含在4.8分钟洗脱的峰的馏份合并(Watars C18μbondpdk分析柱，以30%乙腈、1%HOAc、水洗脱，2ml/分)，冷冻干燥，得到标题产物NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.0(d，1，J＝9);8.52(s，1);7.7(d，2，J＝10);7.64(br.s，2);7.30(m，1);6.88(m，2);6.75(d，2，J＝10);6.55(br.s，2);5.42(dd，1，J＝4.5，9);4.94(d，1，J＝11.6，1/2 ABq);4.89(d，1，J＝4.5);4.80(d，1，J＝11.5，1/2 ABq);4.72(s，2);4.06(m，1);3.60(s，2);3.15(s，3);2.1-1.7(m，4).IR(KBr)1763，1757，1606，1559cm-1.FABMS实测值＝791.2037
实施例37β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((N-1-(5-氟尿嘧啶)基)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯将7β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(乙酰氧基亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯(1.0g)溶于二氯甲烷(5ml)中，然后向溶液中加入三甲基甲硅烷基碘(0.65ml，5mmol)。将棕黑色溶液在室温氮气氛下搅拌90分钟。反应混合物用乙酸乙酯稀释，然后依次用冷的1N硫代硫酸钠、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。分层并用硫酸钠干燥有机层，将其真空浓缩。
将5-氟尿嘧啶(0.30g，2.3mmol)溶于无水DMF中，然后将三乙胺(0.40ml，2.3mmol)、上述3-(碘代亚甲基)头孢烯化合物溶于DMF中，并加到5-氟尿嘧啶溶液中。将得到的溶液在室温搅拌2小时然后真空浓缩。浓缩物用冷的1N HCl及乙酸乙酯稀释。分出乙酸乙酯层，用硫酸镁干燥并真空浓缩，得到0.70g棕色固体。将其通过硅胶快速色谱纯化，用5%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱。
NMR(300MHz，CDCl3)，10.10(br.s，1)，7.81(d，1，J＝5);7.20(m，1);7.05(d，1，J＝7);6.92(m，2)，6.0-5.8(m，2);5.40-5.25(m，2);4.95(d，1，J＝5);4.85(d，1，J＝9);4.75(d，2，J＝5);4.41(d，1，J＝9);3.80(s，2);3.45(d，1，J＝12);3.30(d，1，J＝12).IR(氯仿)1792，1720，1704，1671，1507cm-1;UV(EtOH); λmax272(ε＝14，100)，238(ε＝12，900).FABMSM+1＝507.
实施例47-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((N-1-(5-氟尿嘧啶)基)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸将四[三苯基膦]钯[O](8mg，0.006mmol)和三苯基膦(3mg，0.01mmol)在1∶1二氯甲烷和乙酸乙酯混合物(2ml)中混合。将7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((N-1-(5-氟尿嘧啶)基)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯(0.112g，0.221mmol)也溶于1∶1二氯甲烷和乙酸乙酯混合物中，在室温下将所得棕色溶液加到含催化剂的溶液中。向此溶液中加入2-乙基己酸钠(0.040g，0.243mmol)。将所得溶液搅拌1.5小时，分离沉淀是通过先向反应混合物中加入丙酮，然后将混合物转移到离心管中。离心后将上清液滗掉，米色沉淀用乙醚洗涤，在真空保干器中干燥。干燥过程中米色固体变成棕色。将棕色固体溶于水，用乙醚洗涤并冷冻干燥，得到85mg灰白色固体。该固体经过反相HPLC(Waters Associates C 18柱)用15%乙腈/1%乙酸/水洗脱。合并含产物的馏份并冷冻干燥，得到15mg标题产物NMR(DMSO-d6，300MHz)δ9.08(d，1，J＝8.3);8.24(bd，1，J＝5.8);7.30(m，1);6.88(m，2);5.59(dd，1，J＝4.9和3.4);4.97(d，1，J＝4.9);4.72(d，1，J＝14.6);4.23(d，1，J＝14.6);3.68(s，2);3.50(d，1，J＝14.6);(被DMSO中的水模糊的在3.3δ处的其他双峰).IR(CHCl3)1782，1695，1666cm-1.UV(ethanol) λmax＝271nm(ε＝10，800)，237(ε＝10，200).FABMS实测值＝467.0489.
方法3N-叔丁氧羰基-2-氨基乙硫醇在氮气氛下将2-氨基乙硫醇盐酸盐(9.9g，0.08mol)悬浮于乙腈(约25ml)中，加入二(异丙基)胺(14.9ml)，在加入过程中将混合物保持在0℃。在0℃保持10分钟后，加入碳酸二叔丁酯(20.0ml)，所得混合物在0℃搅拌15分钟，然后在室温再搅拌45分钟。将反应混合物真空浓缩，加入40∶60乙酸乙酯∶己烷混合物。这样生成的白色固体通过过滤分离。滤液通过7时硅胶柱用40∶60乙酸乙酯∶己烷混合物洗脱进行快速色谱纯化。合并含产物的馏份，真空浓缩，得到15g标题产物，为无色油状物。NMR(300MHz，CDCl3)4.92(bs，1，NH);3.28(q，2，J＝6.3);2.62(q，2，J＝6.9);1.42(s，9);1.33(t，1，J＝8.5)。
方法47-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((N-(叔丁氧羰基氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸将7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(乙酰氧基亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸钠(2.0g，5.05mmol)在蒸馏水中搅拌，然后加入碘化钾(8g)和N-叔丁氧羰基-2-氨基乙硫醇(0.87g)。将混合物缓慢加热到65℃，在此温度保持2小时，然后在70℃再保持2小时。将反应混合物冷却，在搅拌下倾入冰水和乙酸乙酯的混合物中。向此混合物中加入1N盐酸将pH调到2。收集乙酸乙酯层，用硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，得到2g标题产物，为白色固体。
NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ9.10(d，NH，J＝9);7.30(m，1);6.88(m，2);5.59(m，1);5.05(d，1，J＝5);3.71(s，2);3.60(m，4);3.26(bs，2);3.02(m，2);2.45(m，2，与DMSO信号重叠).
方法57-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((1-叔丁氧羰基氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯将7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((1-(叔丁氧羰基氨基)-2-乙基硫酰)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸盐(0.50g，0.975mmol)、烯丙基溴(0.25ml，2.92mmol)和碳酸氢钠(0.4g)在5ml DMF中混合，在室温氮气氛下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯和0.1N盐酸稀释。分出有机层，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，得到0.5g黄色油状物。将此油状物通过6吋硅胶柱用1∶1乙酸乙酯∶己烷洗脱进行快速色谱纯化，合并含产物的馏份，真空浓缩，得到200mg标题产物。
NMR(CDCl3，300MHz)δ7.20(m，1);6.92(m，2);5.90(m，1);5.75(dd，1，J＝5，9);5.30(m，2);4.98(d，1，J＝5);4.68(d，2);3.80(s，2);3.55(q，2，J＝12);3.4-3.1(m，4);2.6(t，2，J＝5);1.40(s，9).
IR(KBr)1771，1756，1714，1680，1670，1531cm-1.FDMSM+1＝554.
实施例57-β-((2-噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((1去乙酰基长春花碱)氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯将7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((1-(叔丁氧羰基氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯(0.46g，0.823mmol)溶于二氯甲烷(5ml)中，并在氮气氛下冷却到0℃。加入三氟乙酸(纯样，2ml)，所得混合物搅拌1小时。将反应混合物真空浓缩，用甲苯稀释并真空浓缩两次，然后用CHCl3稀释并真空浓缩两次，得到去保护的氨基化合物。
将去保护的氨基化合物溶于二氯甲烷(3ml)并将溶液冷却到0℃。将N-甲基吗啉(0.3ml)加到混合物中，然后缓慢加入去乙酰基长春花碱叠氮化物(按美国专利4，203，898实施例5，20栏所述方法制备)的二氯甲烷溶液(5ml)。所得混合物在0℃搅拌30分钟，将反应混合物浓缩到其原体积的1/2，然后在室温搅拌过夜。反应混合物用水稀释，分层，有机层用硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。浓缩物通过硅胶快速色谱纯化，用4%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱。合并含产物的馏份并浓缩，得到100mg标题产物。
NMR(CDCl3)δ(mixture of △-2 and △-3 isomers)9.68(s，1);9.58(s，1);8.60(d，1，J＝9);8.05(s，1);7.55(d，1，J＝9);7.25-7.10(m，6);7.0(m，2);6.90(s，1);6.60(s，1);6.10(s，1);6.0-5.6(m，5)，5.60(s，1);5.40-5.3(m，2);4.8-4.6(m，3);3.86(s，2);3.80(s，3);3.75(s，2);3.62(s，3);2.80(s，3);0.90(两个重叠的三重峰，6);
其余的质子为4.0-1.0多重峰的混合体。UV(乙醇) λmax265nm(吸光度＝0.6609)，214(吸光度＝1.8358)。FABMSM+1＝1190.4720。
实施例67-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((1-(去乙酰基长春花碱)氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸.
在氮气氛下，将四[三苯基膦]钯[O](5.8mg)和三苯基膦(1.8mg)溶于1∶1乙酸乙酯∶己烷中。向此溶液中加入7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((1-(去乙酰基长春花碱)氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯(0.20g，0.168mmol)，然后加入三乙基甲硅烷(40.3μl，d＝0.728)。反应混合物在室温下搅拌。1小时后，加入冰醋酸(2滴)，将混合物再搅拌1小时。向反应混合物中加入乙醚使产物沉淀，将反应混合物离心以收集产生的米色沉淀(85mg)。该沉淀通过反相HPLC用Waters C-18柱色谱纯化，用30%乙腈、0.2%甲酸水溶液以10ml/min洗脱，在254nm检测。合并含产物的馏份并浓缩，得到30mg白色固体标题产物。
NMR(DMSO-d6，300MHz)δ9.30(s，1);9.0(d，1，J＝9);8.45(m，1);8.17(br.s，1);7.9-7.6(m，3);7.31(m，2);7.20(d，1，J＝9);7.0-6.8(m，4);6.39(s，1);6.14(s，1);5.7-5.5(m，2);5.40(dd，1，J＝5，9);4.92(d，1，J＝5);3.90(s，1);3.70(s，2);3.67(s，3);3.49(s，3);2.67(s，3);0.74(t，3，J＝7);0.68(t，3，J＝7);其余的质子为4.9-1.1的几个多重峰IR(KBr)1768，1764，1648，1630，1616cm-1;UV(乙醇) λmax＝267nm(ε＝22，900)，215(ε＝53，800);FABMS1150.44435.
实施例7抗体(F(ab′))酶结合物的合成制备Sulfo-SMCC(Pierce Chemical Company)的等渗磷酸盐缓冲的盐水溶液，其pH 7.2(PBS)，浓度约35mM。在用0.3M Na2CO3水解之前和之后，通过使用摩尔消光系数8000在260nm测量等分试样的吸光度来测定该溶液的真空浓度。
按照Cartwright和Waley方法(Biochem.J.，221，PP 505-512，1984)纯化得自Enterobacter cloacae(由Sigma Chemical Company得到)的P99菌株的β-内酰胺酶(“β-L”)，然后通过50mM硼酸钠、100mM氯化钠，pH 8.0(BBS)透析并储存。在加入Nonidet P-40(Sigma Chemical Company)至0.01%之后，用CentiprepTM浓缩仪(Amicon Corporation，Danvers，Massachusetts)将含20mg蛋白的溶液体积浓缩到约10mg/ml，通过280nm的吸光度测量其精确的浓度(消光度1mg/ml＝1.4，Cartwright和Waley，Biochem.J.，26，PP.5329-5337(1984))。
将含2.0摩尔当量的Sulfo-SMCC溶液(～35μl)加到β-L溶液中，用0.3M Na2CO3将pH调到8.0。未搅拌的溶液在室温放置1小时。然后使反应混合物通过50ml P6DG(Bio-Rad Laboratories，Richmond，California)柱，用pH6.2的50mM柠檬酸铵、1mM DTPA、100mM NaCl洗脱。
将包含尖峰(在280nm检测)的蛋白质收集在一个馏份内，通过测量该溶液等分试样在280nm的吸光度来测定其浓度。蛋白质溶液的马来酰亚胺含量是通过等分试样与两倍过量的半胱氨酸反应(10分钟，室温)来测定的，用DTNB检测残余的半胱氨酸释放的硫代硝基苯甲酸在412nm的摩尔消光系数＝13，600。在所述反应条件下，得到马来酰亚胺/β-L的平均摩尔比为～0.9。衍生的蛋白质在2小时之内使用。
根据本领域已知的并由上述Breman等人和Glemmie等人描述的方法，通过胃蛋白酶消化然后用半胱氨酸还原制备抗癌胚抗原抗体CEM231的F(ab′)断片。通过测量蛋白质溶液的等分试样在280nm的吸光度(1mg/ml溶液的消光度＝1.4)来测定游离硫醇/F(ab′)的比例，并用DTNB测定硫醇浓度。一般的硫醇/F(ab′)平均比在2.0至2.5范围内。
使摩尔当量的衍生马来酰亚胺的β-L和CEM231F(ab′)各以1-5mg/ml的浓度在50mM柠檬酸铵、1mM DTPA、100mM NaCl(pH6.2)中在室温下不搅拌反应1小时。反应结束时加入过量N-乙基马来酰亚胺使反应停止。
然后将反应混合物直接加到500ml Sephadex G-150 Superfine柱中，用BBS缓冲液洗脱。用PAGE确定产物馏份，从而得到分子量～90，000的纯物质。然后将混合的产物馏份浓缩到～1.5mg/mL，无菌过滤，贮存在无菌隔膜覆盖的小瓶中。
方法6β-内酰胺酶的酶活性的测定下面部分A表明，酶活性的定量测定是用头孢菌素Ⅰ(Sizma Chemical Company)或PADAC(Cal-Biochem)作底物，在装有搅拌的恒温容器托架的Hewlett-Packard 8451A分光光度计中，分别在264或570nm检测下进行的。在一般的试验中，以在有意义的波长下足以给出0.5-1.0吸光度的试验浓度将底物加到在适当缓冲液(PBS，HEPES等)中在适宜的PH(一般为7.2)平衡在37℃的5nM P-9.9E.cloacae β-内酰胺酶(“β-L”)的搅拌的参比溶液中。(β-L酶(也叫“青霉素酶”)可以从市场上买到(例如Sigma Chemical Company)，并可由文献方法得到。)。然后以5秒或更长时间为间隔用分光光度计测定吸光度的变化。
部分B说明了β-L-CEM231结合物对实施例11的化合物的酶活性的测定)。
部分A对β-L酶和结合物的KM和Vmax的测定头孢菌素Ⅰ贮液(13mM)的制备是将5.5mg头孢菌素Ⅰ溶于1.0ml 10mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH7.2(PBS)中。通过A280测定P-99 E.cloacae β-内酰胺酶(“β-L”)的贮液是1.3μM β-L溶液，将7.7μL该溶液加到含搅拌的、平衡温度的PBS的小杯中，以使最终体积达到2.0ml。将分光光度计校准。然后加入底物贮液使试验浓度达到5至130μM。对于首次底物混合使分光光度计等待5秒钟，然后在264nm每10秒钟记录吸光度2分钟。
将结果由初始值转化为吸光度变化，并用RS/3程序(BBN Software Products Company，Cambridge，Massachusetts)作图。对图的检查表明，底物浓度大于50μM则初始速率相同，初始速率可以由25秒钟之前的倍数估算。(在后续测定中每5秒钟采集一次吸光度读数。)将反应的20秒钟之后的△-OD值转换为△-[底物]/秒，并在双倒数图1/V对1/[S]上与底物浓度相关联(其中V＝△[底物]/秒)，从中用其相关的误差极限测定KM和Vmax。按照关系式Kcat＝Vmax/[E]计算Kcat(由在5秒钟时间点处264nm吸光度，用头孢菌素Ⅰ的摩尔消光系数8，540计算底物浓度。)对另外两组β-L-CEM231结合物进行类似的实验。对β-L和两组结合物KM值分别是4.8+/-0.1，4.4+/0.3及5.2+/-0.4μM;Kcat分别是54+/-0.7，35+/-1.4及49+/-2.8秒-1。
部分B将在搅动过的容器中的1.5ml PBS缓冲液(pH7.4)在37℃与不同浓度的实施例11的化合物一起培养。在每一情况中通过加入浓度为0.11nM的β-内酰胺酶-CEM231结合物使反应开始，并使其保温90秒钟。向0.5ml由34%乙腈和200mM KH2PO4缓冲液(用H3PO4调节pH3)组成的溶液中加入0.5ml反应混合物，使样品骤冷。
头孢菌素前药浓度的降低是通过在0.46×15cm C-18反相柱(在266nm检测)上对两份重复的骤冷样品的HPLC注射液取平均来测定的。流动速率为每分钟1ml，用上述34%乙腈缓冲液进行等浓度洗脱。
采集的数据分钟 μM 前药 μM/min 1/C 1/V12345 6.960 0.482 0.144 2.0376 8.000 0.563 1.125 1.7767 8.700 0.592 1.115 1.6898 10.000 0.691 0.100 1.4489 10.440 0.751 0.096 1.33110 12.000 0.858 0.083 1.16611 12.180 0.888 0.082 1.12712 13.920 0.879 0.072 1.13813 14.000 0.898 0.071 1.11314 15.660 1.020 0.064 0.98015 16.000 1.069 0.062 0.93516 17.400 1.120 0.057 0.89217 18.000 1.238 0.056 0.80818 20.000 1.152 0.050 0.86819 25.000 1.481 0.040 0.67520 26.100 1.756 0.038 0.56921 30.000 1.687 0.033 0.59322 34.800 2.358 0.029 0.42423 40.000 2.191 0.025 0.45624 43.500 2.824 0.023 0.35425 50.000 2.950 0.020 0.339km＝155±42μMkcat＝1721±467sec-1kcat/km＝11.1±42sec-1μM-1对实施例11的化合物方法7结合β-内酰胺酶的CEM231的免疫反应性的实验碘化作用在室温下在Biorad Enzymobeads(BioRad Laboratories)和25μl 1%β-D-葡萄糖的存在下，在0.2M磷酸钠(pH7.1)中，用200μCi125Ⅰ处理1μg/μL的10μg结合物20分钟。混合物用含有0.1%叠氮化钠和0.35mg/mL焦亚硫酸钠的50μl PBS溶液(pH7.2)骤冷。以含有0.1%叠氮化钠、0.1%明胶和1%碘化钠的100μl PBS溶液形式加入载体。
在用PBS、0.1%叠氮化钠、0.1%明胶溶液平衡的5mL Sephadex G-25柱上纯化混合物，用含0.1%叠氮化钠的PBS(pH7.5)以0.5ml馏份将其洗脱到含有100μl 0.1%明胶溶液的管中。用ISODATA 20/20 Series Gamma Counter (RIA Data Systems，Rclling Meadows，Illinois)对馏份进行放射性计数，放射性的第一峰是标记的结合物。
免疫反应性用癌胚抗原(CEA)或用不相干蛋白(用于非特异性结合对照样)制备聚苯乙烯珠，是以浓度为每珠150ng的10%马血清将聚苯乙烯珠浸入所需蛋白溶液中。将碘化的结合物稀释到约200cpm/μl 10%马血清。将每三个抗原阳性和抗原阴性的珠放在单独的γ射线计数管中，洗涤，用200μl标记的结合物处理。将珠在37℃保温过夜。测量每一管中的总计数;将上清液转移到含有相同类型的第二个珠的管中。最后，将所有的珠洗涤，测定每一珠上计数的馏份。按下式计算免疫反应性A++B+(1-A+)，按下式计算非特异性结合A-+B-(1-A-)，其中A+和B+是分别在第一和第二循环连在抗原阳性珠上的馏份，A-和B-是分别在第一和第二循环连在抗原阴性珠上的馏份。
测得的β-L-CEM231结合物的免疫反应性约为80%，这是与未改性的CEM231的F(ab′)断片所得值相比得到的。非特异性结合也没有由于与β-内酰胺酶的结合而增加。
方法8通过用β-内酰胺酶处理由头孢菌素的3′-亚甲基释放取代基的实验由头孢菌素3′位释放取代基(胞毒剂)可以通过对反应混合物的色谱图(特别是HPLC)分析来说明，或者通过对被释放的官能基团的分光光度分析来说明。(如果检测方法不是瞬时的，通过加入有效浓度的抑制如邻氯青霉素(Sigma Chemical Company)(对邻氯青霉素其有效浓度为5μM)可使酶停止作用。
例如，本发明方法的模型体系采用由7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((2-氨基乙基-1-硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸脱去氨基乙硫醇。进行通常的酶分析(按264nm吸光度)，但在50mM Tris，100mM NaCl缓冲液中在pH8.0下进行。在后续试验中定量测定释放的硫醇，这是通过将250mM DTNB(二硫基硝基苯甲酸)包含在反应混合物中，并观测412nm的吸光度变化。用264nm吸光度的摩尔消光系数8，540和412nm吸光度的摩尔消光系数13，600，可以比较两个反应的速率(在这些条件下硫醇与DTNB的反应是瞬时的)。结果的图线表明，由于β-内酰胺酶催化头孢菌素的裂解使硫醇释放出来，但释放速率比催化速率慢。
为了说明由7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((N-1-(5-氟尿嘧啶)基)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸(Ceph-5-FU)脱去5-氟尿嘧啶，制备头孢菌素贮液(1mg头孢菌素在2ml 20%N，N-二甲基乙酰胺及pH7.0HEPES缓冲液中，最终浓度500μg/ml)。制备P-99E.cloacae β-内酰胺酶的贮液。向头孢菌素底物的贮液(90μl)中加入β-内酰胺酶溶液贮液(10μl)。通过HPLC(在Waters AssociatesC18 μbondapak柱上)检测反应，用25%乙腈/1%乙酸水溶液洗脱(在254nm检测吸光度)。5-氟尿嘧啶的保留时间为1.9分钟，头孢菌素-(5-氟尿嘧啶)化合物的保留时间为5.3分钟。混合约30秒钟后，将5μl反应混合物的等分试样注射到HPLC。HPLC示踪显示头孢菌素已被消耗，并出现了保留时间为4.3分钟的新化合物，以及少量保留时间为1.9分钟的5-氟尿嘧啶。将两种贮液混合21分钟后，在4.3分钟洗脱的化合物减少，并观测到大量在1.9分钟洗脱的化合物。将贮液混合36分钟后，通过峰面积的积分表明在4.3分钟洗脱的化合物的量被进一步减少，而在1.9分钟洗脱的化合物的量相应地被增大。
因此，酶引起头孢菌素-(5-氟尿嘧啶)底物-胞毒剂转化为胞毒剂。
方法9碘化β-L-CEM231结合物的肿瘤定位象对免疫测定所述的那样，用125Ⅰ标记结合物。取十二只裸体小鼠，在小鼠中对LS174T肿瘤细胞实行皮下注射，并使肿瘤细胞生长至约0.4g大小，再向这些小鼠的尾部静脉注射在100μl BBS中的50μg标记结合物。在4和24小时分别将6只小鼠杀死、解剖，并测定各个器官中放射性物质的含量。结果以注射剂量/gm组织的百分数(%)表示。
结果血液 骨骼 心脏 肾 肝 肺 肌肉 皮肤 脾 肿瘤 GI4小时15.8 2.4 4.3 7.4 3.7 8.1 1.3 3.8 4.2 13.9 3.124小时1.5 0.2 0.4 0.7 0.6 1.0 0.1 0.8 0.4 7.5 0.7这些结果表明结合物确定优先积聚在肿瘤中，而在关键器官中没有不适当的累积。结果还表明可将结合物从血清中迅速除去，而这一点从底物-胞毒剂向专属于某一目的物的胞毒剂转变的观点来说是很有意义的。这些结果与从大约同样分子量的鼠杂交抗体观察到的结果类似，并且没有显示出带菌蛋白质的非正常代谢疗法。
方法10与抗原表达细胞结合的结合物的酶测定为了表明β-内酰胺酶活性可以通过制备的β-L-CEM231结合物结合到肿瘤细胞上，在Autopow介质(GIBCO，Grand Island，纽约)中制备了CEA表达LS174T细胞和CEA阴性MOLT4细胞的单细胞悬浮液。两种悬浮液的密度均为2×107细胞/ml;LS174T成活率为23%，MOLT4成活率为80%。悬浮液放在冰中备用。
用10或50pmol结合物或未结合的β-内酰胺酶培养细胞(1ml)1或10分钟。然后离心细胞，弃去上清液，再使其悬浮在缓冲液中，再次离心，然后使细胞悬浮在含PADAC(Cal-Biochem)的1.0ml缓冲液中，缓冲液中PADAC(分光光度法测定)约为30μM已知的浓度。用底物培养10分钟后，离心细胞，测定上清液中PADAC浓度。结果以培养后剩余的原始吸收率(在PADAC峰的吸收波长570nm处)的百分数(%)表示。
结果结合物 含量 结合时间 培养后剩余的%OD 570pmol/ml minLS174T 细胞B-LCEM231 10 10 46B-LCEM231 50 10 23B-L 10 10 95B-L 50 10 87B-LCEM231 10 1 62B-LCEM231 50 1 36MOLT4 细胞B-LCEM231 10 10 94B-LCEM231 50 10 93这些结果表明β-内酰胺酶活性可以特殊方式结合在抗原阳性细胞上，在没有结合物时细胞不具有这样的活性，结合并没有妨碍酶的催化活性，以及结合随时间和浓度的变化而变化。
方法11β-L-CEM231结合物的血清动力学的PADAC测定将在50mM硼酸钠、100mM NaCl(BBS)中的β-L CEM231结合物(50μg)注入每只(共18只)不带肿瘤的裸体小鼠的尾部静脉。在注射后1、24、48、72、96和120小时每次为三只小鼠放血，收集它们的血清并冷冻。采用标准测试条件测定血清样品的β-L活性。将适当数量的血清用PBS稀释至2.0ml，并且为了检测活性测定时间也要进行必要的变化。使用PADAC(溶解2.4mg/ml制得的20ml EtOH溶液)作为底物，从而避免来自血清蛋白的干扰。
通过观察确定吸收率-时间曲线的线性部分，采用线性回归(RS/3，BBN软件产品公司)使用这些点相吻合。将这些直线的斜率与相同条件下从已知浓度的结合物得到的斜率相比较，并对稀释进行校正，从而计算出血清中的结合物浓度。
结果时间 斜率 测定的血清μl μg β-LCEM231/mL 血清hr x1041 27.0 10 2024 13.3 100 1.048 2.2 50 0.3372 4.3 200 0.1696 5.3 600 0.06120 5.2 600 0.06这些结果表明在这些小鼠的正常血清中不存在β-内酰胺酶活性，并且血清中的结合物含量下降很快，因此底物-胞毒剂治疗可在注射(向裸体小鼠中)结合物后相当短的时间(48小时)后开始。当人类中存在足够快的血清清除速率时，也会得到类似的实验结果。将通过酶方法确定的结合物含量与通过放射检测法确定的碘化结合物的含量相对比(在注射后4和24小时测定)，发现酶在血清中并不能被灭活或抑制(参见方法9)。
方法12在体内结合在抗原表达肿瘤组织上的β-内酰胺酶活性将LS174T或MOLT4细胞植入裸体小鼠，使这些细胞长成0.5～1.0gm的肿瘤，然后将在100μl BBS中稀释的50μg β-L-CEM231结合物注入这些小鼠的尾部静脉。注射二十四小时后，切除肿瘤，并将其切成～100mg的块状物。
将肿瘤块切碎，然后用1ml PBS溶液培养10分钟，培养之前已向该1ml PBS溶液中加入了10μl通过将1mg PADAC溶于400μl 100%EtOH制得的备用溶液。PADAC在测试溶液中的精确浓度用分光光度计法(ε570nm＝48，000)确定。然后离心样品(10分钟，1000xg)，上层清液用分光光度计检测。由于上层清液还是很混浊，不可能定量测定，但在LS174T肿瘤样品中清楚地观察到从紫红到橘黄的颜色变化。以摄影法将结果记录下来。在取自两只不同的裸体小鼠的LS174T肿瘤切片中得到了同样的正结果，而从取自两只不同的裸体小鼠的MOLT4肿瘤切片得到了负结果。
方法13体外细胞毒性测定将靶细胞(抗原阳性或抗原阴性)以200，000细胞 ml的浓度悬浮在75%缺亮氨酸EBSS-MEM(GIBCO)+10%渗析的胎牛血清(FBS)+庆大霉素(GIBCO)中。该细胞悬浮液的等分试样0.2ml在96穴盘中接种，并在37℃、5%CO2下培养过夜。向上清液中加入抗体-酶结合物，加至最终浓度为25μg/ml(未结合的酶、未结合的抗体不予考虑)。培养1小时后取出上清液，并用介质漂洗这些细胞一次。然后用含有底物-胞毒剂的相同介质代替原来的介质，底物-胞毒剂在介质中的浓度介于0.001和10μg/ml之间。在37℃、5%CO2条件下用底物-胞毒剂化合物培养细胞3-48小时。向每只培养穴中加入4μCi3H-亮氨酸的介质。用标记的亮氨酸对细胞培养24小时，然后采集。通过液体闪烁计数法测定被吸收的标记亮氨酸。(所有的样品者重复测定三次。)结果以被引入的亮氨酸下降到对比值的50%(ID50)时的底物-胞毒剂浓度表示。
作为上述一般方法的一个实例，测定了7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((((1-(去乙酰基长春花碱)氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸(“化合物”)对带CEA的LS174T(ATCC)肿瘤细胞的细胞毒性，该肿瘤细胞可以用β-L-CEM231结合物(“结合物”)处理，或不用该结合物处理。于是，在37℃、5%CO2条件下，将适当的培养穴暴露于浓度为25μg/ml的β-L-CEM231结合物达1小时。然后漂洗细胞，并将其悬浮在含有上述化合物的介质中。在24小时这一时刻，洗涤这些适当的培养穴，并加入0.2ml新鲜介质以最终完成48小时的培养。采用上述的标准方法进行其余的实验。
该实验的结果如下所示
化合物处理时间用下列物质处理细胞1: 6小时 48小时1)化合物和结合物: 0.265 0.0012)只有化合物: 2.154 <0.0013)只有胞毒剂2: 0.260 <0.0011这些数值是ID50(μg/ml)2去乙酰基长春花碱氨基乙硫醇这些数据表明，化合物对肿瘤细胞的毒性远远低于胞毒剂(化合物从此衍生而来)对肿瘤细胞的毒性，但当细胞先用结合物处理时，化合物的毒性显著地增加了。
方法147-β-(2-(苯氧基)乙酰氨基)-3-((对硝基苯基碳酸酯基)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸叔丁基酯7-β-(2-(苯氧基乙酰氨基)-3-(羟基亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸叔丁基酯(0.50g，1.15mmol)溶于干燥四氢呋喃(5ml)，得到的溶液在氮气氛下冷却至0℃。向该冷却溶液中加入(对硝基苯基)氯甲酸酯(0.35g，1.72mmol)，然后加入二甲氨基吡啶(DMAP，2mg)，最后慢慢加入2，6-二甲基吡啶(0.20ml)。得到的混合物产生了大量沉淀;使该混合物在冰浴中放置过夜。再加入一些THF，并用刮勺破碎沉淀。过滤该混合物，然后在硅胶上进行快速色谱纯化，以二氯甲烷和乙酸乙酯的1∶1混合物洗脱得到0.40g标题产物NMR(CDCl3，DMSO-d6300MHZ);δ8.01(d，2，J＝8.9);7.75(d，1，J＝10.2);7.25-7.00(m，3);6.80-6.62(m，4);5.86(dd，1，J＝4.9，10.2);5.28(d，1，J＝13.3);4.67(d，1，J＝13.3);4.56(d，1，J＝4.6);4.33(s，2);3.65(d，1，J＝18.6);3.32(d，1，J＝18.5);1.30(s，9);IR(CHCl3)3020，1807，1771，1725，1696cm-1;UV(EtOH)， λmax392(ε＝1100)，268(ε＝13，500);FABMS(M+H)602，546，363.
实施例87-β-(2-(苯氧基)乙酰氨基)-3-((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸叔丁基酯将去乙酰基长春花碱酰肼硫酸盐(900mg)溶于碳酸氢钠水溶液，然后再用二氯甲烷萃取该溶液就制得了上述硫酸盐的游离碱。有机相经硫酸钠干燥、过滤以及减压浓缩得到白色固体。将该游离碱溶于干燥吡啶(6ml)，并加到7-β-(2-(苯氧基)乙酰氨基)-3-(O-(对硝基苯基)碳酸酯基)亚甲基-3-头孢烯-4-羧酸叔丁基酯(0.40g，0.666mmol)中。加料后的烧瓶用另一部分(2ml)吡啶洗涤，洗涤溶液加到反应混合物中。将少量N，N-二异丙基乙胺(2滴)加入反应混合物，得到的混合物在氮气和室温下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，然后减压浓缩。浓缩物在硅胶上进行快速色谱纯化，以90/10二氯甲烷/甲醇洗脱得到0.54g标题产物
NMR(CDCl3，300mHz)δ10.0(s，1);8.70(s，1);8.02(s，1);7.93(d，1，J＝12);7.50(d，1，J＝12)，7.38-6.90(m，10);6.10(s)与6.12(m，1)重叠;5.80(d，1，J＝12);5.65(d，1，J＝12);4.38(s，2);4.02(d，1，J＝12);3.75(s，3);3.58(s，3);2.8(brs，3);1.52(s，9);0.90(brs，6);其余的是4.0-1.1ppm范围的多重峰;
IR(CHCl3)1802，1721，1696，1515cm-1;UV(EtOH)， λmax＝267(ε＝23，800)，214(ε＝53，000);FABMS计算值.(M+H)＝1231.53853.实测值＝1231.54230.
实施例97-β-(2-(苯氧基)乙酰氨基)-3-((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸三氟乙酸盐将7-β-(2-(苯氧基)乙酰氨基)-3-((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸叔丁基酯(123mg，0.1mmol)溶于二氯甲烷(3ml)，该溶液冷却至0℃，加入三乙基硅烷(1ml)，再加入三氟乙酸(1ml)。得到的溶液搅拌30分钟，再向其加入同样体积的三乙基硅烷和三氟乙酸撤去冰浴，反应混合物在室温下搅拌3小时。混合物在减压下浓缩，用冷的乙腈(3倍体积)稀释，再在减压下浓缩。加入四氯化碳，混合物再次减压浓缩得到120mg标题产物NMR(DMSO-d6，300MHz)δ9.76(br.s，1);9.46(br.s，1);9.41(br.s，1);8.14(d，1，J＝9.3);7.47(d，1，J＝7.9Hz);7.35-7.21(m，4);7.18-6.80(m，6);6.70(s，1);6.30(s，1);6.00(dd，1，J＝4.8，9.5);5.75(s，2);5.15(d，1，J＝12);4.92(d，1，J＝4.8);4.6(s，与水的宽峰重叠);
3.72(s，3)，3.53(s，3);2.79(br.s，3);0.82(t，3，J＝7);0.70(t，3，J＝7);其余的是4.0-1.1ppm范围的多重峰;IR(KBr)1788，1720，1685，1677cm-1;UV(EtOH)， λmax＝311(ε＝3800)，268(ε＝18，500)，215(ε＝45，100);FABMS计算值(M+H)＝1175.47593.实测值＝1175.47600.
方法157-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(羟甲基)-2-头孢烯-4-羧酸二苯甲基酯按Kukolja S.，J.Med.Chem.，P.1114，1970所述得到的7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(羟甲基)-2-头孢烯-4-羧酸(5.0g，14.1mmol)溶于丙酮和乙腈的1/1混合物中。向该溶液滴加二苯基重氮甲烷(2.7g，13.9mmol)的乙腈溶液。得到的反应混合物在室温下搅拌1小时，然后减压浓缩。将乙腈加到浓缩物中，通过过滤收集得到的米色固体状标题产物(4.4g)NMR(CDCl3，300MHz)，7.40-7.23(m，11);7.02-6.95(m，2);6.88(s，1);6.45(d，1，J＝7.6);6.25(s，1);5.61(dd，1，J＝5，8);5.20(d，1，J＝5);5.15(s，1);4.10(q，2，J＝8);3.82(s，2);IR(CHCl3)1778cm-1;1743，1683;EA计算值C＝62.29，H＝4.64，N＝5.38.实测值C＝62.07，H＝4.73，N＝5.51.
方法167-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(羟基亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸二苯甲基酯将7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(羟基亚甲基)-2-头孢烯-4-羧酸二苯甲基酯(2.0g，3.85mmol)溶于二氯甲烷/异丙醇的4/1混合物(125ml)中，得到的溶液冷却至-10℃。将溶于异丙醇(25ml)中的间氯过苯甲酸(1.21g)在30分钟时间内滴加到上述冷却溶液中。得到的反应混合物在真空下蒸发至干，加入苯，再使混合物在真空下蒸发至干。向固体中加入乙酸乙酯，过滤收集到褐色固体，干燥得到1.5g标题产物NMR(300MHz，CDCl3+DMSO-d6)δ 7.4-7.0(m，11);6.80(m，2);6.70(s，1);5.82(dd，1，J＝4.6，9.4);4.42(d，1，J＝4.7);4.37(d，1，J＝15.0);4.18(d，1，J＝15.0);3.84(d，1，J＝19.2);3.67(s，2)，3.22(d，1，与水重叠;(未鉴定出OH和NH);UV(EtOH)， λmax＝258nm(ε＝6540);IR(KBr)1654cm-1，1721，1755，1773，1785;EA理论值C＝60.43，H＝4.51，N＝5.22.实测值C 60.57，H 4.37，N 5.01;FABMSM+H＝537.
方法177-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(O-(对硝基苯基)碳酸酯基)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸二苯甲基酯7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(羟甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸二苯甲基酯(1.0g，1.87mmol)部分溶解在干燥THF(20ml)中，在氮气下将该混合物冷却至0℃。向该冷却溶液先加入(对硝基苯基)氯甲酸酯(0.49g，2.43mmol)，再加入二甲氨基吡啶(5mg)，最后加入2，6-二甲基吡啶(0.28ml)。得到的溶液在0℃下搅拌30分钟，再在室温搅拌1小时。过滤混合物，滤出的固体用乙酸乙酯洗涤，滤液减压浓缩。得到的固体在硅胶上进行快速色谱纯化，以二氯甲烷/乙酸乙酯的60/40混合物洗脱得到0.32g无色的标题产物NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.49(d，1，J＝8.3Hz);8.27(d，2，J＝9.2);7.5-7.2(m，13);6.92(m，3);5.94(dd，1，J＝4.9，8.2);5.25(d，1，J＝13.0);4.93(d，1，J＝4.4);4.85(d，1，J＝13.0);4.04(d，1，J＝18.7);3.88(d，1，J＝15.3);3.78(d，1，J＝15.3);3.66(d，1，J＝18.7);UV(EtOH)265nm(ε＝3570);IR(KBr)1720cm-1，1765，1658;EA理论值C＝58.20，H＝3.88，N＝5.99.实测值C＝58.48，H＝4.02，N＝5.90.
实施例107-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸二苯甲基酯按上述实施例8所述制备去乙酰基长春花碱酰肼硫酸盐(0.50g)的游离碱。将该游离碱溶于干燥吡啶(10ml)，并加到7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(O-(对硝基苯基)碳酸酯基)亚甲基)-3-头孢烯-1-亚砜-4-羧酸二苯甲基酯(0.32g，0.456mmol)中。加入N，N-二异丙基乙胺(2滴)后，在氮气氛中和室温搅拌该混合物。得到的反应混合物在氮气和室温下搅拌过夜，然后用乙酸乙酯稀释，并减压浓缩。这样得到的固体在硅胶上进行快速色谱纯化，以二氯甲烷/甲醇的90/10混合物洗脱得到0.34g灰白色固体状标题产物NMR(CDCl3，300MHz)δ9.91(s，1);8.66(br.s，1);8.01(s，1);7.53-6.86(m，23);6.55(s，1);6.08(s，1);6.05(dd，1，J＝4.7，9.8);5.8-5.6(m，2);5.3-5.2(m，1);4.85(br.s，1);4.47(d，1，J＝4.4);3.83(s，2);3.74(s，3);3.57(s，3);0.87(t，6，J＝7.2);其余的是4.1-1.1ppm范围的掩盖的多重峰;UV(EtOH)， λmax＝268nm(ε＝25200);IR(CHCl3)1690cm-1，1730，1803;FABMS计算值(M+H)C71H79N8O14S2＝1331.51569.实测值＝1331.51224.
实施例117-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸三氟乙酸盐7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸二苯基甲基酯(105mg，0.00789mmol)溶于二氯甲烷(3ml)，该溶液在氮气下冷却至0℃，然后向溶液加入三乙基硅烷(0.5ml)，再加入三氟乙酸(0.5ml)。15分钟后，溶液用乙腈稀释并减压浓缩，再次用乙腈稀释并减压浓缩。得到的固体先溶于氯仿，再溶于乙醚，每次溶解后都进行减压浓缩。得到的固体在真空中和室温下干燥得到100mg标题产物NMR(300MHz，DMSOd6)δ9.76(s，1);9.46(s，1);9.40(s，1);8.43(d，1，J＝8.1);7.47(d，1，J＝8.0)，7.4-6.9(m，16);6.68(s，1);6.28(s，1);5.80(dd，1，J＝5.8);
与5.75(s，1)重叠;;5.16(d，1，J＝12.7);4.85(m，1);4.64(d，1，J＝13.2);3.88(s，2);3.78(s，2);3.71(s，3);3.53(s，3);2.78(br.s，3);0.80(t，3，J＝7);0.70(t，3，J＝7);其余的是4.3-1.0ppm范围的多重峰 UV(EtOH)， λmax＝266nm(ε＝19，300)，214(ε＝49，800);FABMS计算值(M+H)C58H69N8O14S2＝1165.43744.
实测值＝1165.43290.
实施例127-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸二苯基甲基酯将7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸二苯甲基酯(0.24g，0.180mmol)和氯化亚锡(0.10g，0.451mmol)溶于二甲基甲酰胺(DMF，3ml)中，该溶液用冰浴冷却，并用注射器向其慢慢加入乙酰氯(0.32ml)。得到的反应混合物在冰浴冷却下搅拌2分钟，再在室温下搅拌20分钟。将反应混合物倾入冷水(20ml)中，用冷的碳酸氢钠水溶液将水相的pH值调节至8。得到的混合物用乙酸乙酯萃取，有机相用硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸发至干。得到的固体在硅胶上进行快速色谱纯化，以二氯甲烷/甲醇的90/10混合物洗脱得到47mg标题产物NMR(300MHz，CDCl3)δ10.30(s，1);9.90(s，1);9.20(s，1);8.70(s，1);8.02(d，2，J＝8Hz);7.6-6.8(m，25);6.58(br.s，1);6.05(s，1);5.83(dd，1，J＝5.8);5.8-5.7(m，2);5.12(d，1，J＝13);4.92(d，1，J＝5);4.10(d，1，J＝8);3.78(s，2);3.72(s，3);3.55(s，3);2.77(s，3);0.88(t，6，J＝7);
其余的是4.0-1.1ppm范围的掩盖的多重峰.FABMS计算值C71H79N8O13S2＝1315.52077.实测值＝1315.51781.
实施例137-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸、三氟乙酸盐7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲基酯(46mg，0.0035mmol)溶于二氯甲烷(2ml)，得到的溶液在氮气下冷却至0℃，向该溶液加入三乙基硅烷(0.5ml)，然后再加入三氟乙酸(0.5ml)。得到的反应混合物在氮气下和0℃搅拌30分钟，向其加入冷的乙腈，并使溶液在真空下蒸发至干。重复该加入乙腈、蒸发至干步骤，然后使固体溶于乙醚，并在真空下蒸发至干，剩下灰白色固体(干燥后重42mg)，即标题产物NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.78(s，1);9.46(s，1);9.35(s，1);9.10(d，1，J＝8);7.47(d，1，J＝8);7.4-6.8(m，16);6.68(s，1);6.29(s，1);5.75(s，1);5.65(dd，1，J＝5.8);5.2-4.9(m，2);3.85(s，2)，3.72(s，3);3.50(s，3);2.75(br.s，3);0.80(t，3，J＝7);0.65(t，3，J＝7);其余的是4.2-1.0ppm范围的多重峰;FABMS计算值C58H69N8O13S2＝1149.44252。
实测值1149.44007。
方法187-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸烯丙基酯7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((1-叔丁氧基羰基氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯(1.0g，1.81mmol)溶于二氯甲烷(20ml)，该溶液在氮气下冷却至-78℃。将间氯过苯甲酸(0.37g)溶于二氯甲烷(20ml)所得的溶液滴加到冷冻的头孢菌素溶液中。该反应混合物在氮气下搅拌15分钟，然后用冰/盐水浴使其升温至-10℃。15分钟后，使反应混合物在真空下蒸发至干。得到的固体在硅胶上进行快速色谱纯化，以含2%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱得到0.60g标题产物NMR(DMSO-d6，300MHz)δ8.40(d，1，J＝8.3Hz);7.32(m，1);6.90(m，2);6.80(t，1，J＝4.8);6.0-5.8(m，1);5.78(dd，1，J＝4.8，8.3);5.34(d，1，J＝17.2);5.21(d，1，J＝10.5);4.91(d，1，J＝4.4);4.71(d，1，J＝5.4);4.0-3.4(m，6);3.0(m，2);2.5(m，2)，1.32(s，9);13C(DMSO-d6，270MHz)28.19;30.68;32.70;35.67;46.42;58.05;66.06;66.54;77.69;118.76;122.93;123.10;125.04;126.44;126.66;131.78;136.78;155.50;160.65;164.12;170.00;UV(EtOH);271(ε＝8，330)，234(ε＝11，000);IR(CHCl3)1801，1728，1700，1696cm-1;FABMSM+1＝570;EA计算值C 50.60，H 5.48，N 7.38.实测值C 50.83，H 5.55，N 7.32.
实施例147-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((1-去乙酰基长春花碱)氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸烯丙基酯重复实施例5的步骤，但用方法18的原料头孢菌素-1-β-亚砜(0.34g，0.598mmol)代替实施例5的头孢菌素硫醚。而且，还使用下列数量的其他试剂去乙酰基长春花碱酰肼(0.46g，0.60mmol);
N-甲基吗啉(0.20ml，1.8mmol);
亚硝酸钠(0.083g，1.2mmol)。
对于该实施例，反应物在室温和氮气下搅拌过夜，而不是象实施例5中那样在0℃搅拌30分钟。产物在硅胶上进行快速色谱纯化，以95/5-90/10的二氯甲烷/甲醇溶剂梯度洗脱得到0.30g黄色固体状的标题产物NMR(CDCl3，300MHz)δ9.48(s，1);8.01(s，1);7.5-6.9(m，12);6.52(s，1);6.02(s，1);5.95(dd，1，J＝4.2，9.5Hz);与5.92(m，1，)重叠;
5.70(s，2);5.35(d，1，J＝17.1);5.25(d，1，J＝7.5);4.73(br.s，2);4.62(d，1，J＝4.2);3.71(s，2);3.67(s，3);3.66(s，3);3.55(s，3);2.73(s，3);0.88(t，3，J＝7);与0.85(t，3，J＝7)重叠;其余的是4.1-1.1ppm范围的各种多重峰;
UV(EtOH)， λmax＝268(ε＝22，600)，214(ε＝57，000);IR(CHCl3)1799，1730，1669，1615cm-1;
FABMS计算值C62H76N7O12S3＝1206.47139.
实测值＝1206.47138.
实施例157-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((1-去乙酰基长春花碱)氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((1-(去乙酰基长春花碱)氨基)-2-乙基硫醚)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸烯丙基酯(0.30g，0.249mmol)溶于二氯甲烷(3ml)，该溶液加到四[三苯基膦]钯(O)(11.4mg，0.0099mmol)和三苯基膦(2.6mg，0.0099mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液中。得到的反应混合物在室温和氮气下搅拌10分钟，然后加入三乙基硅烷(4滴)和冰醋酸(2滴)。接着反应混合物在室温和氮气下搅拌过夜。向反应混合物加入另一份同样数量的钯、膦、硅烷和乙酸试剂，并再搅拌3小时。加入乙醚，采用离心法收集得到的固体。在真空和室温下干燥收集到的灰白色固体得到183mg标题产物。该产物的一部分(100mg)用HPLC(C18，50×350柱，1000psi，50ml/min，以15%乙腈/1%甲酸/84%水洗脱10分钟，在18分钟时间内溶剂以线性梯度方式变为30%乙腈/69%水/1%甲酸，然后以后者洗脱至纯化完毕)纯化。
NMR(DMSO-d6，300MHz)δ9.40(s，1);8.32(d，1，J＝8Hz);8.0-7.6(m，4);7.4-7.2(m，4);7.0-6.8(m，4);6.39(s，1);6.15(s，1);5.75-5.50(m，3);4.81(d，1，J＝4);3.75(s，2);3.65(s，3);3.50(s，3);2.62(s，3);0.75(t，3，J＝7);0.65(t，3，J＝7);
其余的是4.0-1.1ppm范围的多重峰;UV(EtOH)， λmax＝266(ε＝25，600)，215ws(ε＝59，200);IR(CHCl3)1792，1623，1616，1602cm-1;FABMS计算值C59H72N7O12S3＝1166.44009.实测值＝1166.43436.
方法197-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((O-(对硝基苯基)碳酸酯基)亚甲基)-2-头孢烯-4-羧酸二苯基甲基酯7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(羟甲基)-2-头孢烯-4-羧酸二苯甲基酯(3.0g，5.77mmol)溶于干燥四氢呋喃(THF，5ml)，该溶液在氮气下冷却至0℃，然后加入(对硝基苯基)氯甲酸酯(1.74g，8.65mmol)和二甲氨基吡啶(2mg)。向该反应混合物滴加2，6-二甲基吡啶(1.0ml，8.65mmol)，然后反应物在氮气下搅拌过夜，使其慢慢升温至23℃。借助重力过滤反应混合物，并在真空下浓缩滤液。浓缩物在硅胶上进行快速色谱纯化，以95/5二氯甲烷/乙酸乙酯洗脱得到2.9g白色泡沫状的标题产物NMR(CDCl3，300MHz)δ8.28(d，2，J＝9.1);7.42-7.28(m，13);7.05-7.00(m，2);6.92(s，1);6.55(s，1);6.35(d，1，J＝8.7);
5.65(dd，1，J＝4.0，8.7Hz);5.24(d，1，J＝4.0);5.21(S，1);
4.82(d，1，J＝12.4);4.72(d，1，J＝12.5);3.88(s，2);IR(CHCl3)1777，1749，1686，1528cm-1;UV(EtOH)， λmax＝244(ε＝16，800);FABMS计算值(M+H)＝686.12669.
实测值＝686.12451.
实施例167-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((去乙酰基秋水仙素-7-氨基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲基酯按照Raffauf，J.Amer.Chem.Soc.P.5292，1953中描述的方法制备去乙酰基秋水仙素(70mg，0.196mmol)。在氮气和室温下将如上制得的去乙酰基秋水仙素溶于干燥吡啶，并将该溶液加到7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((O-(对硝基苯基)碳酸酯基)亚甲基)-2-头孢烯-4-羧酸二苯甲基酯(130mg，0.196mmol)中，接着再加入N，N二异丙基乙胺(1滴)。反应混合物在氮气和室温下搅拌过夜。用乙酸乙酯稀释反应混合物，然后真空浓缩。重复稀释/浓缩步骤。浓缩物在硅胶上进行快速色谱纯化，以含10%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱得到0.17g黄色油状的标题产物NMR(CDCl3，300MHz)，δ2∶δ3的1∶1混合;
8.78(br.s，1);8.10(d，1，J＝6);7.6-7.1(m，13);7.0-6.8(m，4);6.52(s，1);6.38(s，1);5.8(dd，1，J＝4.8);5.7(dd，1，J＝6);5.55(dd，1，J＝4，8);5.30(d，1，J＝6);5.16(d，1，J＝4);5.10(s，1);4.95(d，1，J＝12);4.90(d，1，J＝4);4.65(d，1，J＝12);4.4-4.2(m，1);3.92(s，3);3.90(s，3);3.88(s，3);3.60(s，3);3.42(d，1，J＝12);3.23(d，1，J＝12);2.58-2.45(m，1);2.40-2.18(m，2);UV(EtOH)341(ε＝81，600)，219(ε＝214，000)，202(ε＝311，000);FABMS(M+H)904.
实施例177-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基秋水仙素-7-氨基)羰氧基)亚甲基-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸二苯甲基酯7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基秋水仙素-7-氨基)羰氧基)亚甲基-2，3-头孢烯-4羧酸二苯甲基酯(0.17g，0.188mmol)溶于二氯甲烷，并使该溶液在氮气下冷却至0℃。间氯过苯甲酸(0.038g，0.188mmol)溶于二氯甲烷(2ml)，将该溶液慢慢加到头孢菌素溶液中。反应混合物在0℃和氮气下搅拌1小时，然后在真空下蒸发至干。得到的固体在硅胶上进行快速色谱纯化，以90/10二氯甲烷/甲醇混合物洗脱得到70mg标题产物NMR(CDCl3，300MHz)δ8.08(d，1，J＝6.2Hz);7.48-7.10(m，13);
7.0-6.8(m，4);6.51(s，1)，6.0(m，1);5.15(d，1，J＝13);4.62(d，1，J＝13);4.45(d，1，J＝4);4.32(m，1);3.95(s，2);3.92(s，3);3.90(s，3);3.82(s，3);3.60(s，3);与3.6(d，1，J＝13)重叠;;3.15(d，1，J＝13);2.50-2.18(m，3);1.78(m，1);UV(EtOH)， λmax＝346(ε＝14，500);FABMS计算值(M+H)＝920.25228.实测值＝920.25448.
实施例187-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基秋水仙素-7-氨基)羰氧基)亚甲基-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基秋水仙素-7-氨基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸二苯甲基酯(70mg)溶于二氯甲烷(3ml)，并在氮气下冷却至0℃。向该冷却溶液加入三乙基硅烷(1ml)，然后再加入三氟乙酸(1ml)。得到的反应混合物在0℃和氮气下搅拌30分钟。反应混合物用冷的乙腈稀释，并在真空下蒸发至干。向剩余物中加入冷的乙腈，得到的溶液再次减压蒸发至干。剩余物溶于乙醚，所得溶液减压蒸发至干得到黄色固体。干燥后，按照以前的方法进行纯化得到70mg标题产物NMR(DMSO-d6，300MHz);8.37(d，1，J＝8.4);8.13(d，1，7.9);8.06(d，1，J＝9.1);7.38-6.80(m，6);6.70(s，1);5.74(dd，1，J＝4，8);5.07(d，1，J＝13.2);4.82(d，1，J＝4);4.42(d，1，J＝13.2);4.05(m，1);3.88(s，2);3.82(s，3);3.77(s，3);3.73(s，3);3.46(s，3);有两个掩盖的质子2.58-2.40(m，1);2.20-1.90(m，2);1.83-1.70(m，1);IR(KBr)1788，1721，1693，1592cm-1;UV(EtOH)， λmax＝345(ε＝14，200)，240(ε＝33，000);FABMS计算值(M+H)＝754.17403.实测值＝754.17598.
方法20制备7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(羟甲基)-2-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(羟甲基)-2-头孢烯-4-羧酸(17.5g，49.5mmol)溶于250ml DMF和150ml二噁烷，向该溶液加入碳酸氢钠(4.5g，53.6mmol)，接着再加入烯丙基溴(5.9ml，68.3mmol)。将得到的混合物加热回流1小时。反应混合物冷却至室温，并在乙酸乙酯(500ml)和盐水(500ml)中分配。有机相用盐水和水洗涤6至7次(400ml)，然后干燥(硫酸钠)，减压浓缩得到10.2g深棕色油状的标题产物。粗产率52%。该粗产物无须进一步纯化即可用于下一步中。但也可按如下方法得到分析用的分析样品将0.84g粗产物油溶于5ml 1∶1乙酸乙酯/二氯甲烷中，加入己烷(50ml)直至有黄色固体形成。过滤后，滤液经放置得到白色固体状的标题化合物(0.04g)。
IR(CHCl3)1779，1750，1684，1510cm-;EAC17H18N2O5S2计算值C＝51.76，H＝4.50，N＝7.10.实测值C＝51.50，H＝4.56，N＝6.93.UV(EtOH)εmax＝234(ε＝14，384)，201(ε＝15.766);NMR(300MHz，CDCl3)δ7.27(m，1);7.00(m，2);6.38(d，1，J＝9);6.28(s，1);5.9(m，1);5.65(d of d，1，J＝4.9);5.3(m，3);5.08(s，1);4.66(d，2，J＝6);4.20(q，2，J＝13);3.85(s，2).
方法21制备7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((对硝基苯基碳酸酯基)亚甲基-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯和相应的2-头孢烯异构体7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(羟甲基)-2-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯(10.2g，25.8mmol)溶于50ml THF，使该溶液在冰水浴中冷却。加入二甲基吡啶(4.8ml，41.3mmol)，接着再加入对硝基苯基氯甲酸酯(8.50g，41.3mmol)和二甲氨基吡啶(0.10g，0.8mmol)。使反应混合物温热至室温，并搅拌0.5小时。过滤反应物收集灰白色沉淀，并减压浓缩滤液。得到的剩余物通过快速色谱纯化，以5%乙酸乙酯/95%二氯甲烷洗脱得到暗黄色胶状的标题化合物(5.66g，产率39%)。该物质主要是β-2异构体。它无须进一步纯化即可用于下一步中。通过快速色谱(5%乙酸乙酯/CH2Cl2)纯化可得到分析样品，0.28g黄色胶状物可给出0.08g无色透明油状的β-2异构体。IR(CHCl3)1779，1730，1685，1529，1510cm-1EAC24H21N3O9S2计算值C＝51.51，H＝3.78，N＝7.51，S＝11.46.实测值C＝51.72，H＝3.88，N＝7.27，S＝11.22.UV(EtOH)εmax＝239(ε＝17，365)，201(ε＝24，226);NMR(300MHz，CDCl3)εmax＝8.28(d，2，J＝9);7.38(d，2，J＝9);7.25(m，1);7.01(m，2);6.56(s，1);6.32(m，1，J＝8);5.91(m，1);5.68(d of d，1，J＝4.9);5.33(m，3);5.09(s，1);4.92(d，1，J＝12);4.77(d，1，J＝12);4.68(d，2，J＝7);3.86(s，2).
实施例19制备7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((对硝基苯基碳酸酯基)亚甲基-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸烯丙基酯7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((对硝基苯基碳酸酯基)亚甲基-3-头孢烯-4-羧酸烯丙基酯(5.66g，10.1mmol)和相应的β-2异构体的混合物溶于225ml CH2Cl2，得到的溶液在冰水浴中冷却。向该溶液加入间氯过苯甲酸(3.23g，55%，10.3mmol溶于另外的50ml CH2Cl2中)溶液，过苯甲酸溶液的加入以滴加方式在15分钟内完成。合并的溶液在室温再放置10分钟。减压浓缩反应混合物得到棕色油状物，与甲醇一起研制得到4.24g(产率74%)标题化合物，浅褐色固体。
IR(CHCl3)1808，1772，1733，1689，1530cm-1MS(FAB)M+＝576.EAC24H21N3O10S2计算值C＝50.08，H＝3.68，N＝7.30.实测值C＝50.02，H＝3.63，N＝7.04.UV(EtOH)λmax＝400(ε＝688)，332(ε＝2，394)，325(ε＝2，353)，270(ε＝17，094)，239(ε＝14，438)，201(ε＝28，842).NMR(300MHz，DMSO-d6)λ＝8.48(d，1，J＝8);8.29(d，2，J＝9);7.52(d，2，J＝9);7.33(m，1);6.92(m，2);5.9(m，2);5.2-5.41(m，3);4.91(d，1，J＝4);4.87(d，1，J＝13);4.74(d，2，J＝5);4.04(d，1，J＝18);3.82(AB q，2，J＝15);3.66(d，1，J＝18).
实施例20制备7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-O-[3′-N-脲基]阿霉素]亚甲基-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸烯丙基酯阿霉素-HCl(0.87g，1.5mmol)在(5.0ml，Aldrich Sure-Seal)DMF中做成浆液，向该浆液加入二异丙基乙胺(0.3ml，用丸状KOH干燥，0.25mmol)，然后向所得的混合物加入7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-((对硝基苯基碳酸酯基)亚甲基-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸烯丙基酯(0.87g，1.51mmol)。使反应避光，并搅拌2.5小时。向反应物加入乙醚，沉淀出1.29g红色固体。该物质无须纯化即可用于实施例21中。分析样品可以这样得到将一部分红色固化(130mg)通过Chromatotron，在1微米塔板上用6%甲醇/94%CH2Cl2洗脱得到29mg所需产物，红色固体。再在C-18反相色谱柱(Waters C18-bondpack)上分级，以35%/35%/30%MeOH/乙腈/水+0.5%乙酸铵洗脱，所需产物的保留时间为＠3.6分钟(流速＝2ml/min)。当以上述HPLC条件纯化时，得到了纯度为90%的标题产物。
IR(CHCl3)1806，1724，1700，1610，1582，1509cm-1;EA计算值C＝55.15，H＝4.63，N＝4.29.实测值C＝55.07，H＝4.51，N＝4.52.UV(EtOH)εmax＝532(ε＝4，274)，496(ε＝7，857)，480(ε＝7，839);349(ε＝1，467)，251(ε＝21，091)，234(ε＝30，361);NMR(300MHz，DMSO d6)δ13.9(s，1);13.2(s，1);8.35，(d，1，J＝8);7.84，(m＝2);7.56，(m，1);7.31，(d，1，J＝4);6.90，(m，3);5.9-5.75，(m，1)与5.76，dd，1，J＝5.9)重叠;;5.32，(m，1);5.16，(m，2);5.02，(d，1，J＝13);4.8，(m，2);4.65，(m，2);4.53，(bs，2);4.44，(d，1，J＝13);4.10，(d，1，J＝5);3.92，(s，3);3.88-3.70，(m，4);3.62，(m，1);3.5-3.1，(m，2)与3.28，s，2)重叠;;2.83，(AB q，2，J＝18);2.2-2.0，(m，2);1.76，(m，1);1.40，(m，1);1.08(d，3，J＝6).
实施例21制备7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-O-[3′-N-脲基]阿霉素]亚甲基-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸方法A乙酸钯(3.5mg，0.016mmol)和三苯基膦(22mg，0.084mmol)溶于乙酸乙酯(0.1ml)，该混合物用声波处理约2分钟。7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-O-[3′-N-脲基]阿霉素]亚甲基-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸烯丙基酯(0.11g，0.11mmol)另外溶解在由5.5ml EtOAc、2.5ml MeOH、3ml CH2Cl2和80μl乙酸组成的混合溶剂中，用吸液管将该溶液加到钯溶液中，接着再加入三乙基硅烷(0.02ml，0.13mmol)。使反应混合物避光，并在室温下搅拌4小时。使反应混合物浓缩至红色油状物(0.25g)。将一部分该粗产物油(54mg)溶于DMSO(1.5ml)，注入22×250mm RSIL Phenyl制备HPLC柱(Alltech Associates)，以35%CH3CN/0.05%TFA在水中的混合物洗脱(流速8ml/min，检测器＠480nm)12分钟，再以45%CH3CN/0.05% TFA在水中的混合物洗脱18分钟，在运行30分钟后再以60%CH3CN/0.05%TFA在水中的混合物洗脱。冷冻干燥含产物的色谱流出物得到26mg红色固体状的标题产物。
IR1780cm-1.MS(ESI)962.1(MNa+).MSHRMS(FAB)计算值C42H41N3O18S2Li(MLi+)＝946.1987.实测值＝946.1955.NMR(DMSO-d6)δ14.0，(s，1);13.2，(s，1);8.33，(d，1，J＝8);7.91，(d，2，J＝4);7.64，(t，1，J＝5);7.35，(m，1);6.91，(m，3);5.71，(dd，1，J＝5，8);5.43，(s，1);5.19，(m，1);5.05，(m，1);4.92，(m，1);4.82，(m，2);4.70，(d，1，J＝5);4.55，(d，2，J＝6)与4.46，(m，1)重叠;4.12，(d，1，J＝9);3.97，(s.3);
3.80，(ABq，2，J＝15;HOD干扰3.4-3.0的光谱);
2.96，(m，2);2.12，(m，2);1.82，(m，1);1.43，(m，1);
1.09，(d，3，J＝6).
方法B将乙酸钯(0.04g，0.18mmol)和三苯基膦(0.2g，0.76mmol)混合，在1ml乙酸乙酯中做成浆液。该混合物用声波处理1分钟，生成了白色沉淀。向该沉淀加入乙酸乙酯(50ml)、甲醇(25ml)和乙酸(0.75ml)。加入按照与实施例20相同的方法制备的烯丙基7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-O-[3′-N-脲基]阿霉素]亚甲基-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸酯(1.36g，1.39mmol)，同时加入125ml 10%MeOH/90%CH2Cl2以提高溶解性。再加入三乙基硅烷(0.35ml，2.20mmol)。4小时后，反应仅完成了一部分。加入与前述同样数量的乙酸钯、三苯基膦和三乙基硅烷，并使反应物搅拌过夜。减压浓缩反应混合物得到1.4g红色固体状的标题化合物。使用反相HPLC小批量地纯化该物质，将两个25×100mm柱子(Waters μbondapak C-18柱)顺序连接在一起，以30%乙腈/70%水+0.1%TFA洗脱，流速为8ml/min，在480nm处检测输出物。25分钟后，将流动相换为40%乙腈/60%水+0.1%TFA。在这些条件下，大约55分钟时洗脱出了标题化合物。冷冻干燥分析纯度＞95%的色谱流出物即可得到标题化合物。76mg粗产物可给出24mg纯度为95%的标题化合物。
方法22大鼠血液学实验记录下列方法的目的在于比较底物-胞毒剂的毒性和单独胞毒剂的毒性。
1.第0天给25只雄性Fischer 344大鼠(＠100g)预先放血(眼血)，并按如下所示进行静脉注射A组5只大鼠+对比载体0.5ml，10mM HEPES，150mg NaCl，含10%乙醇的PH7.1缓冲液。
B组5只大鼠+1mg/Kg 4-去乙酰基长春花碱-3-酰肼(去乙酰基长春花碱酰肼)。将1mg去乙酰基长春花碱酰肼溶于0.5ml无水乙醇，再加入4.5ml HEPES-NaCl缓冲液。给每只大鼠注射0.5ml。
C组5只大鼠+1mg/Kg LY262758(7-β-2-(苯氧基乙酰氨基)-3-(((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧 酸、三氟乙酸盐)(长春花属含量，58%长春花属)。按上述方法溶解2mg，并注射0.5ml。
D组5只大鼠+1mg/Kg LY266494，(7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-4-羧酸、盐酸盐(55.8%长春花属)。溶解2mg，注射0.5ml。
E组5只大鼠+1mg/Kg实施例17化合物7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸、三氟乙酸盐。溶解2mg，注射0.5ml。
所有的大鼠都通过穿耳标记识别，并在注射后第3和第7天放血，用于测定白血细胞(WBC)。下面给出了原始数据。与所有其他组相比，用去乙酰基长春花碱酰肼处理的大鼠在第三天WBC减少最多。在第7天各组的WBC值不能够被区分开(并且低于预先放血前的数值，这可能是由于使用不同的仪器测定WBC的缘故)。
大鼠血液学实验数据数值×1000＝WBC′s实验组 第0天 第3天 第7天对比组 #1 大鼠 13.2 14.2 6.0#2 大鼠 12.4 16.4 9.3#3 大鼠 13.1 13.7 6.8#4 大鼠 10.4 10.3 10.1#5 大鼠 10.1 13.1均值 11.8 13.5 8.1+/-SD 1.5 2.2 2.0DAVLB-Hyd #1 大鼠 17.4 ** 5.0#2 大鼠 10.9 4.4 2.8#3 大鼠 10.2 9.0 19.8#4 大鼠 12.7 5.4 **#5 大鼠 17.6 10.6 **均值 13.8 7.4 9.2+/-SD 3.5 2.9 9.2LY262758 #1 大鼠 13.3 13.3 14.0#2 大鼠 14.3 14.6 13.0
#3 大鼠 9.4 15.0 12.5#4 大鼠 10.2 16.3 9.0#5 大鼠 19.7 14.7 7.7均值 13.4 14.8 11.2+/-SD 4.1 1.1 2.7LY266494 #1 大鼠 15.6 19.2 8.3#2 大鼠 16.5 16.2 6.8#3 大鼠 14.3 14.3 11.4#4 大鼠 ** 13.3 13.2#5 大鼠 16.0 12.1 20.1均值 15.6 15.0 12.0+/-SD 0.9 2.8 5.2LY266070 #1 大鼠 14.1 15.9 7.0#2 大鼠 15.0 12.8 14.5#3 大鼠 9.9 15.1 9.6#4 大鼠 9.9 14.5 0.6#5 大鼠 16.2 11.3 7.1均值 13.0 13.9 9.6+/-SD 2.9 1.9 3.0
＊＊样品结成血块-不能测定WBC数目。
方法23使用裸体小鼠模型在体内评价前药/抗体-酶结合物体系下列方法用来确定最初观察到对前药具有毒性时的剂量。而且，还确定了不能观察到抗肿瘤活性时的前药最大剂量。
1.第0天将1×107LS174T肿瘤细胞(ATCC)经皮下植入30只裸体小鼠(CHARLES RIVER，25G);
2.按下述制备备用的前药治疗溶液将7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(((去乙酰基长春花碱酰肼基)羰氧基)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸、三氟乙酸盐溶于水，加入氯化钠溶液(9%)，得到等渗(0.9%)盐水溶液，该溶液含有2mg/ml浓度的前药。使用前对得到的溶液进行过滤消毒，并且前药配制后尽快注射。
A组每只小鼠注射0.25ml盐水B组将1.7ml备用溶液放入小瓶中，每只小鼠注射0.25ml。
C组0.625ml备用溶液+0.775ml盐水;
注射0.2mlD组0.31ml备用溶液+1.09ml盐水;
注射0.2mlE组0.15ml备用溶液+1.25ml盐水;
注射0.2mlF组0.075ml备用溶液+1.325ml盐水;
注射0.2ml
3.在第3、4、5、6天对裸体小鼠按下述进行静脉注射A组5只小鼠注射0.25ml盐水B组5只小鼠注射20mg/Kg ceph-长春花属前药C组5只小鼠注射10mg/Kg前药D组5只小鼠注射5mg/Kg前药E组5只小鼠注射2.5mg/Kg前药F组5只小鼠注射1.25mg/Kg前药4.在植入肿瘤细胞后第14、21、28天测量肿瘤。
5.结果如下剂量 抑制活性(%) 死亡数/总共 肿瘤重量mg/Kg 均值mg S.D.
A组 对比 - 0/5 787B组 20.0 - 5/5C组 10.0 94 1/5 50+/- 64D组 5.0 33 0/5 529+/- 778E组 2.5 30 2/5 552+/- 233F组 1.25 47 0/5 414+/- 387B组剂量具有毒性。不具毒性的C组剂量表明单独的前药在该剂量具有抗肿瘤活性。从这些结果可以推测出，最佳有效剂量一般在1至8mg/Kg范围。
方法24示踪和生物分布研究抗-KS 1/4(即007B)-β-内酰胺酶结合物的生物分布通过用111铟标记结合物测定。结合物先与异硫氰基苄基DTPA反应，再根据已确立的方法(Meares C.等人，Anal.Biochem.，142，PP.68-78，1984)进行标记。将标记结合物(20μg和10μCi每只鼠)注入带LS174T肿瘤的裸体小鼠的尾部静脉。小鼠分成6只一组，在注射结合物后第4、24、48、72和120小时各杀死一组。杀鼠、样品收集、计数和数据处理的方法以前曾有叙述(Halpern S.E.等人，Can.Res.，43，PP.5347-5355，1983)。通过在失去知觉的裸体雌性小鼠(Charles River Breeding Laboratories，Wilmington，Massachusetts)的胁腹部皮下接种1×107个细胞植入肿瘤。在9天内，用此法植入的LS174T肿瘤生长至平均大小为0.2gm。这些研究结果反映在图1和图2中。结果表明，结合物集中在肿瘤上，并且它能迅速地(即在72小时内)从血清中除去。
方法25ADC治疗后T380克隆肿瘤在裸体小鼠中的生长在第0天，通过在失去知觉的雌性裸体小鼠的胁腹部皮下接种0.1ml肿瘤浆液将T380肿瘤植入小鼠体内。在14天内，肿瘤被确定为已生长至约0.3gm大小，肿瘤的大小是通过两脚规测量和通过公式V＝0.5×L×W2计算确定的，其中L和W分别是肿瘤最长的边和与该边相垂直的边的长度。所有的注射都是注入尾部静脉。在图3、4描述的研究中，作为毒性的一种表示，还测量了小鼠的体重。
每组待治疗的8只小鼠都在第14、21和28天注射抗-CEA(即CEM231)-β-内酰胺酶(35μg)结合物、无关的抗体(即CHA255)-β-内酰胺酶(35μg)结合物或盐水。在这些注射后，自注射结合物后72小时开始，还要进行实施例11的前药化合物的四次注射。每日一次，注射量为1mg/Kg(图3)或0.25mg/Kg(图4)。在该实验的对比组中，前药注射以盐水或与前药剂量等摩尔量的去乙酰基长春花碱酰肼代替，后者的注射剂量为0.6mg/Kg(图3)或0.15mg/Kg(图4)。
图3和4中的数据点表示本方法的下列结果实心符号表示实验(肿瘤专属的结合物/前药)组;空心称号表示对照组。图中其他称号解释如下空心园盐水/盐水;空心三角形盐水/前药;空心正方形盐水/药物;空心菱形无关的抗体-β-内酰胺酶结合物/前药;空心箭头注射结合物或盐水;实心箭头注射前药、药物或盐水的4天中的第一天。对于实验组，肿瘤消退，小鼠显示出长时间的无病状态。对照组仅显示出肿瘤生长之被抑制，没有显示出肿瘤消退，而且显示出长期的肿瘤稳定性。
方法26ADC治疗后LS174T克隆肿瘤在裸体小鼠中的生长按方法24植入LS174T肿瘤，并按方法25测量其生长情况。在第9、16和23天，用各为35μg抗-KS 1/4(007B)-β-内酰胺酶结合物、抗-CEA(CEM231)-β 内酰胺酶结合物、无关的抗体(CHA255)-β-内酰胺酶结合物或盐水给小鼠(盐水对照组10只;治疗组5只)注射。在上述注射后96小时，还要进行一次前药(实施例11化合物)(4mg/Kg)、药物(去乙酰基长春花碱酰肼)(2.3mg/Kg)或盐水注射。测量了肿瘤的体积并描绘在图5中。至于图3中所示的T380肿瘤，仅在肿瘤专属性治疗组观察到肿瘤消退，而在其他任何一个对照组都没有观察到肿瘤消退。
图5中的数据点表示该方法的下列结果实心园抗-KS1/4-β-内酰胺酶结合物/前药;实心正方形抗-CEA-β-内酰胺酶结合物/前药;空心园盐水/盐水;空心三角形盐水/前药;空心正方形盐水/药物;空心菱形无关的抗体-β-内酰胺酶结合物/前药;空心箭头注射结合物或盐水;实心箭头注射前药、药物或盐水。还用抗KS1/4-β-内酰胺结合物/药物、抗-CEA-β-内酰胺酶结合物/药物和无关的抗体-β-内酰胺酶结合物/药物进行对比实验，以检验结合物和药物之间的非专属协同作用是否带来了增强效果。从盐水/药物没有观察到差别(数据没有显示在图中)。
测量了小鼠的体重。接受该剂量游离药物治疗的小鼠体重损失很大，并且在其他实验中该药物剂量和治疗安排导致了小鼠死亡。在接受抗-CEA-β-内酰胺酶结合物/前药治疗的小鼠组中仅测量到较少量的体重损失，而在接受抗-KS1/4-β-内酰胺酶结合物治疗的小鼠组中没有测量到体重损失(数据没有显示在图中)。
方法27ADC治疗后LS174T肿瘤的生长这里的方法与方法26相同，只是本方法中在治疗开始之前要使肿瘤长得更大一些，而且使用的结合物是抗-TAG-72(CC49)-β-内酰胺酶。即使对于较大的肿瘤和作为靶抗原的TAG-72，只是肿瘤专属性治疗导致了肿瘤消退，而其他任何对照治疗都没有导致肿瘤消退。
图6中的数据点表示该方法的下列结果实心园抗-TAG-72-β-内酰胺酶结合物/前药;空心园盐水/盐水;空心三角形盐水/前药;空心正方形盐水/药物;空心菱形无关的抗体(CHA255)-β-内酰胺酶结合物/前药;空心箭头注射结合物或盐水;实心箭头注射前药、药物或盐水。
方法28结合物剂量对抑制肿瘤生长的影响下面的方法一般来说就是方法25的方法，但具有以下例外。小鼠在第14、21和28天接受35μg(实心正方形)、14μg(实心园)或3.5μg(实心三角形)抗-CEA(CEM231)-β-内酰胺酶结合物的治疗，72小时后，再用前药以1mg/Kg/天的剂量治疗4天。第四个实验组仅在第14天接受35μg抗CEA-β-内酰胺酶结合物(实心菱形)的治疗，接着象其他小鼠的治疗安排那样用前药治疗。图5中的数据点表示该方法的下列结果空心园盐水/盐水;空心正方形盐水/前药;空心箭头注射结合物或盐水;实心箭头注射前药、药物或盐水的4天中的第一天。结果表明最佳药效或许是取决于结合物剂量的治疗效果的延续，而不是该治疗效果的大小。结果还表明在每个疗程中的结合物都对响应的延续做出了贡献。
方法29制备二苯基甲基 7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(O-(对硝基苯基)碳酸酯基)亚甲基)-2-头孢烯-4-羧酸酯向7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-羟甲基-2-头孢烯-4-羧酸二苯基甲基酯(3.0g，5.77mmol)的干燥THF(5ml)溶液(0℃)加入二甲氨基吡啶(2mg)，然后再加入对硝基苯基氯甲酸酯(1.74g，8.65mmol)。滴加干燥2，6-二甲基吡啶(1.0ml，8.65mmol)，得到的溶液放置过夜使其温热至室温。过滤除去一些不溶物，减压浓缩滤液。剩余物经快速色谱纯化(含5%EtOAc的CH2Cl2为洗脱剂)得到2.9g(产率74%)白色泡沫状的标题化合物。
NMR(CDCl3)δ8.28(d，2，J＝9.1);7.42-7.28(m，13);7.05-7.0(m，2);6.92(s，1);6.55(s，1);6.35(d，1，J＝8.7);5.65(dd，1，J＝4，8.7);5.24(d，1，J＝4);5.21(s，1);4.82(d，1，J＝12);4.72(d，1，J＝12);3.88(s，2).13C NMR(CDCl3)δ169.99，165.90，164.17，155.26，152.04，145.46，138.76，138.69，134.59，128.84，128.77，128.60，128.47，127.90，127.55，127.14，126.79，126.07，125.30，124.64，121.72，117.93，79.49，69.90，60.45，53.2，50.14，37.07.IR(CHCl3)1777，1749，1686，1528cm-1.UV(EtOH)λmax＝244(ε＝16，800).FABMS计算值C34H27N3O9S2C＝59.55;H＝3.97;N＝6.13.实测值C＝59.34;H＝4.05;N＝5.93.
方法30制备7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(O-(对硝基苯基)碳酸酯基)亚甲基)-3-头孢烯-1-β-亚砜-4-羧酸二苯基甲基酯向二苯基甲基 7-β-(2-(噻吩-2-基)乙酰氨基)-3-(O-(对硝基苯基)碳酸酯基)亚甲基)-2-头孢烯-1-4-羧酸酯(2.5g，3.65mmol)的CH2Cl2(40ml)溶液(0℃)加入55%间氯过苯甲酸(1.1g，3.65mmol，等当量)的CH2Cl2(10ml)溶液。在0℃下保持1小时后，TLC(含20%EtOAc的CH2Cl2)表明原料已消耗完毕。减压除去溶剂，剩余物经快速色谱(含20%EtOAc的CH2Cl2)纯化得到2.2g(产率86%)白色固体状的标题化合物。
NMR(DMSO-d6)δ8.49(d，1，J＝8);8.27(d，2，J＝9);7.5-7.2(m，13);6.92(m，3);5.94(dd，1，J＝4.5，8);5.25(d，1，J＝13);4.93(d，1，J＝4.5);4.85(d，1，J＝13);4.04(d，1，J＝18.7);3.88(d，1，J＝15.3);3.78(d，1，J＝15.3);3.66(d，1，J＝18.7).IR(KBr)1765，1720，1658cm-1.UV(EtOH)εmax＝265(ε＝3570).计算值C34H27N3O10S2C＝58.20;H＝3.88 N＝5.99.实测值C＝58.48;H＝4.08;N＝5.90.
权利要求
1.下式的化合物
式中zz为0或1，R1为由C1至C30烷基衍生而来的酰基，R2为氢、有机或无机阳离子、羧基保护基，或无毒代谢不稳定的酯形成的基；和式中胞毒剂为下式的化合物
2.权利要求1的化合物，其中R1是ⅰ)C1至C4烷基、C1至C6取代的烷基、C1至C4烷氧基、C1至C4烷硫基或下式的基团
或保护的氨基和/或其保护的羧基衍生物ⅱ)下式的基团
式中每个R5、R6和R7独自为氢、卤素、羟基、保护的羟基、硝基、氨基、保护的氨基、胺盐、氰基、三氟甲基、氨甲基、保护的氨甲基、N-(甲基或乙基磺酰基)氨基、C1至C6烷基或C1至C4烷氧基;R4为羟基、保护的羟基、甲酰氧基、氨基、保护的氨基、胺盐、羧基、羧酸盐、保护的羧基、苯基羧酸酯、(5-茚满基)羧酸酯、磺酸、磺酸盐、叠氮基、卤素或C1至C6烷基;R6为C1至C4烷氧基;z为氧或硫;n为0、1、2或3;和m为0或1;ⅲ)下式的基团
式中R9为杂环;R10为羟基、保护的羟基、甲酰氧基、氨基、保护的氨基、胺盐、羧基、羧酸盐、保护的羧基、苯基羧酸酯、(5-茚满基)羧酸酯、磺酸、磺酸盐、叠氮基、卤素或C1至C6烷基;n为0、1、2或3;和z为氧或硫。
3.权利要求2的化合物，其中R1为乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丙酰基、新戊酰基、甲氧基甲基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、2-(氨甲基)苯基乙酰基、2-苯基-2-羟基乙酰基、2-苯基-2-(磺酸钠)乙酰基、2-苯基-2-羧基乙酰基、2-(4-羟基苯基)-2-羧基乙酰基、2-苯基-2-氨基乙酰基、2-(4-羟基苯基)-2-氨基乙缩醛、2-｛3-[N-(甲磺酰氨基)]苯基｝-2-氨基乙酰基、2-苯基-2-(5-茚满基羧酸酯)乙酰基、2-苯基-2-(苯基羧酸酯)乙酰基、2-苯基-2-叠氮基乙酰基、2-苯氧基丙酰基、2，5-二甲氧基苯甲酰基、2-(甲酰氧基)-2-苯基乙酰基、2-(2-乙氧基萘-1-基)乙酰基、2-(萘-1-基)-2-氨基乙酰基、2-(萘-2-基)-2-氨基乙酰基、2-(2，5-二氯苯基硫代)乙酰基、2-(3，4-二氯苯基硫代)乙酰基、2-(1-四唑基)乙酰基、2-[N-(3，5-二氯吡啶-4-氧基)]乙酰基、2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酰基、2-(2-噻吩基)乙酰基、2-(4-吡啶基硫代)乙酰基、2-(N-甲基-4-吡啶鎓硫代)乙酰基、2-(2-氨基-4-苯基噻唑-5-基)乙酰基、2-(3-羟基-4-羧基异噻唑-5-基硫代)乙酰基、3-苯基-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、3-(2-氯苯基)-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、3-(2，5-二氯苯基)-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、3-(2-氟-5-氯苯基)-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、2-(2-噻吩基)-2-氨基乙酰基、2-(2-噻吩基)-2-(羧酸钠)乙酰基、2-[N-(4-吡啶鎓)]乙酰基、2-(2-苯并噻吩基)乙酰基、2-(3-苯并噻吩基)乙酰基、2-(2-苯并呋喃基)乙酰基和2-(3-苯并呋喃基)乙酰基。
4.权利要求3的化合物，其中R1是2-(噻吩-2-基)乙酰基，且ZZ为0。
5.权利要求4的化合物，其中阿霉素部分通过连到头孢菌素的3′-氨基甲酸酯基的羰基上的氨基糖化物的氮而结合到头孢菌素上。
6.权利要求3的化合物，其中R1为2-(噻吩-2-基)乙酰基，且ZZ为1。
7.权利要求6的化合物，其中阿霉素通过连到头孢菌素的3′-碳酸酯基的羰基上的氨基糖化物的氮而结合到头孢菌素上。
8.权利要求3的化合物，其中R1为苯氧基乙酰基，且ZZ为1。
9.权利要求8的化合物，其中阿霉素通过连到头孢菌素的3′-碳酸酯基的羰基上的氨基糖化物的氮而结合到头孢菌素上。
10.用于治疗肿瘤疾病的方法，该方法包括A)施用下式的治疗有效量的抗体-酶结合物，抗体-(β-内酰胺酶)式中酶与权利要求1的化合物反应，并引起胞毒剂与头孢菌素的分离，抗体与由靶细胞组织表达的抗原络合;B)对感染宿主施用治疗有效量的权利要求1的底物-胞毒剂，其中底物是对于酶的底物。
11.权利要求10的治疗方法，其中抗体与癌胚抗原络合。
12.权利要求11的治疗方法，其中抗体与KS1/4抗原络合。
13.权利要求12的治疗方法，其中抗体与TAG-72抗原络合。
14.权利要求13的治疗方法，其中抗体与MAT-65抗原络合。
15.权利要求14的治疗方法，其中R1为ⅰ)C1至C4烷基、C1至C6取代的烷基、C1至C4烷氧基、C1至C4烷硫基，或下式的基团
或保护的氨基和/或其保护的羧基衍生物;ⅱ)下式基团
式中每个R5、R6和R7独自为氢、卤素、羟基、保护的羟基、硝基、氨基、保护的氨基、胺盐、氰基、三氟甲基、氨甲基、保护的氨甲基、N-(甲基或乙基磺酰基)氨基、C1至C6烷基或C1至C4烷氧基;R4为羟基、保护的羟基、甲酰氧基、氨基、保护的氨基、胺盐、羧基、羧酸盐、保护的羧基、苯基羧酸酯、(5-茚满基)羧酸酯、磺酸、磺酸盐、叠氮基、卤素或C1至C6烷基;R6为C1至C4烷氧基;z为氧或硫;n为0、1、2或3;和m为0或1;ⅲ)下式的基团
式中R9为杂环;R10为羟基、保护的羟基、甲酰氧基、氨基、保护的氨基、胺盐、羧基、羧酸盐、保护的羧基、苯基羧酸酯、(5-茚满基)羧酸酯、磺酸、磺酸盐、叠氮基、卤素或C1至C6烷基;n为0、1、2或3;和z为氧或硫。
16.权利要求15的治疗方法，其中R1为乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丙酰基、新戊酰基、甲氧基甲基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、2-(氨甲基)苯基乙酰基、2-苯基-2-羟基乙酰基、2-苯基-2-(磺酸钠)乙酰基、2-苯基-2-羧基乙酰基、2-(4-羟基苯基)-2-羧基乙酰基、2-苯基-2-氨基乙酰基、2-(4-羟基苯基)-2-氨基乙缩醛、2-｛3-[N-(甲磺酰氨基)]苯基｝-2-氨基乙酰基、2-苯基-2-(5-茚满基羧酸酯)乙酰基、2-苯基-2-(苯基羧酸酯)乙酰基、2-苯基-2-叠氮基乙酰基、2-苯氧基丙酰基、2，5-二甲氧基苯甲酰基、2-(甲酰氧基)-2-苯基乙酰基、2-(2-乙氧基萘-1-基)乙酰基、2-(萘-1-基)-2-氨基乙酰基、2-(萘-2-基)-2-氨基乙酰基、2-(2，5-二氯苯基硫代)乙酰基、2-(3，4-二氯苯基硫代)乙酰基、2-(1-四唑基)乙酰基、2-[N-(3，5-二氯吡啶-4-氧基)]乙酰基、2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酰基、2-(2-噻吩基)乙酰基、2-(4-吡啶基硫代)乙酰基、2-(N-甲基-4-吡啶鎓硫代)乙酰基、2-(2-氨基-4-苯基噻唑-5-基)乙酰基、2-(3-羟基-4-羧基异噻唑-5-基硫代)乙酰基、3-苯基-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、3-(2-氯苯基)-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、3-(2，5-二氯苯基)-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、3-(2-氟-5-氯苯基)-5-甲基异噁唑基-3-甲酰基、2-(2-噻吩基)-2-氨基乙酰基、2-(2-噻吩基)-2-(羧酸钠)乙酰基、2-[N-(4-吡啶鎓)]乙酰基、2-(2-苯并噻吩基)乙酰基、2-(3-苯并噻吩基)乙酰基、2-(2-苯并呋喃基)乙酰基和2-(3-苯并呋喃基)乙酰基。
17.权利要求16的治疗方法，其中头孢菌素底物中的R1为2-(噻吩-2-基)乙酰基，且ZZ为0。
18.权利要求17的治疗方法，其中抗体为CEM231.6.7。
19.权利要求18的治疗方法，其中胞毒剂阿霉素通过连到头孢菌素的3′-碳酸酯基的羰基上的氨基糖化物的氮而结合到头孢菌素上。
20.权利要求16的治疗方法，其中R1为2-(噻吩-2-基)乙酰基，且ZZ为1。
21.权利要求20的治疗方法，其中抗体被称为CEM231.6.7。
22.权利要求21的治疗方法，其中抗体被称为CC 49。
23.权利要求22的治疗方法，其中抗体被称为ZCE025。
24.权利要求23的治疗方法，其中阿霉素通过连到头孢菌素的3′-碳酸酯基的羰基上的氨基糖化物的氮而结合到头孢菌素上。
全文摘要
本发明涉及治疗肿瘤疾病的方法，该方法包括a)对感染宿主施用治疗有效量的抗体-酶结合物；然后b)对感染宿主施用治疗有效量的底物-胞毒剂，其中底物是对于酶的底物。本发明也公开了抗体-酶结合物和底物-胞毒剂化合物。
文档编号A61K47/48GK1087642SQ9310987
公开日1994年6月8日 申请日期1993年7月6日 优先权日1992年7月6日
发明者V·J·陈, L·N·容海姆, D·L·迈耶, T·A·谢泼德 申请人:海布里特克有限公司