巨细胞病毒(cmv)的基因变体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及CMV基因变体，所述基因变体缺失CMV的IE区域的内含子2(CMV?IEΔi2)。本发明也涉及这种基因变体以及从其转录的RNA剪接变体和从所述RNA剪接变体表达的蛋白的多种应用，例如用于诊断CMV相关癌症疾病，和鉴定个体患癌的风险或随着人样品转移CMV?IEΔi2病毒的风险，并且就免疫治疗和疫苗接种而言通过靶向独特CMV?IE蛋白进行预防和治疗。
【专利说明】巨细胞病毒(CMV)的基因变体
【技术领域】
[0001]本发明涉及新的巨细胞病毒(CMV)基因变体，例如显示在癌症疾病患者中出现的基因变体。因此，本发明涉及癌症诊断方法的领域，更特定涉及出现巨细胞病毒(CMV)感染的癌症形式。本发明特别关注诊断成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肉瘤、肾癌、皮肤癌和胰腺癌，并且也适用于其他癌症形式。
发明背景
[0002]巨细胞病毒(CMV)是感染世界上大部分人口的常见病毒；60-100%的成年群体经历过这种感染，并且是所述病毒的载体。在初次感染后，CMV形成潜伏状态并有持久性，并且大部分感染是亚临床的。在健康载体中，优先发现所述病毒是骨髓谱系细胞中的潜伏病毒，并且病毒的重新活化依赖于细胞分化为成熟巨噬细胞或树突细胞，所述分化通常由炎症造成。直到20世纪70年代，仅认为严重的先天性感染病例代表所述病毒引起的人类疾病。随着社会中免疫抑制个体(例如AIDS患者和移植患者)的增加，CMV的重新活化成为在这些患者中造成高发病率和死亡率的主要临床问题。因此,在过去的几十年中，CMV的重要`性和感兴趣程度增加，因为CMV疾病在这组患者中常见，并且可能危及生命。所述病毒通过炎症重新活化，并且越来越多的证据表明了所述病毒频繁地出现在炎症疾病患者的组织样品中。近来，越来越多的证据也提示了不同来源的癌症中存在活性CMV感染。我们定义了癌症中新的CMV基因变体，并且显示了新的患癌机理。
[0003]CMV感染和癌症
[0004]近期报导揭示了在某些恶性肿瘤中频繁出现CMV的基因组和蛋白，所述恶性肿瘤例如结肠癌、恶性胶质瘤(1-7)、髓母细胞瘤(8)、EBV阴性霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、前列腺癌和乳腺癌(综述参见(9，10))。我们证明了在99%恶性成胶质细胞瘤、>90%髓母细胞瘤(MB)和神经母细胞瘤(NB)、恶性黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、卵巢癌和宫颈癌中存在活性CMV感染(1，8)。重要地是，所述病毒感染在从相同患者获得的非癌症组织样品中和健康对照个体中保持潜伏(1，3)。
[0005]CMV 和癌症调节(oncomodulation):
[0006]在20世纪70年代，Fred Rapp小组已经报导了在前列腺癌中频繁出现CMV，并且从动物模型致癌肿瘤中分离出病毒株(11，12)。在数个稍后的研究中，CMV不能转化正常人体细胞，所以并不认为这种病毒是致癌的。相反，提出了术语癌症调节来描述CMV对由数种特定影响宿主细胞功能的病毒蛋白所介导肿瘤发生的间接影响(综述参见(13，14))。进化中，CMV发展出了影响很多不同细胞和免疫功能的复杂机理(15，16)。所述病毒在感染细胞中生成约170种蛋白，其中大约仅有50种对病毒生成是必需的(17)。因此，绝大部分病毒蛋白用于控制帮助病毒与其宿主共同生存的重要宿主功能。这些蛋白可以通过控制宿主功能对癌症发展起作用，并且通过调节免疫反应，受病毒感染的肿瘤细胞会受到保护避免被免疫系统发现(15)。可能涉及癌症发病的CMV机理称为癌症调节(oncomodulatory)机理(10， 13)。[0007]癌症调节定义为在肿瘤细胞提供的合适遗传环境中提高癌症发生过程的能力，所述癌症发生过程表征为破坏细胞内信号通路、转录因子和肿瘤抑制蛋白。CMV能阻滞细胞分化、干扰癌基因表达、诱导特异染色体断裂、抑制DNA修复机制、控制重要的表观遗传功能、控制细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导血管新生和细胞迁移，这些都提供了癌症调节机理(10，13)。较新的数据也提示了这种病毒可以是致癌的；一项研究显示了事实上，CMV蛋白US28的表达通过诱导的C0X-2表达和VEGF生成造成自身造成鼠模型中的肿瘤发育(18，19)。祀向转基因小鼠肠上皮的US28的表达造成了肠增生、腺瘤(adenoma)和腺癌(adenocarcinoma) (20)。与Smits小组合作,我们近期显示了 US28也引起STAT3磷酸化，生成IL-6并产生增殖表型。例如,成胶质细胞瘤中STAT3的磷酸化与成胶质细胞瘤患者的存活相关(6)。我们近期也发现了 CMV蛋白IE72通过与启动子中SP-1结合位点的相互作用来诱导高端粒酶活性(7)。诱导端粒酶活性是致癌病毒的常见现象。有趣地是，我们发现了 GBM肿瘤中仅仅CMV感染的细胞显示了增加的hTERT表达(7)。我们近期发现了 CMV感染水平与成胶质细胞瘤患者存活延长相关联，进一步证明CMV感染在癌症中的重要作用
`(I)。再者，成胶质细胞瘤中CMV感染的水平是患者存活的较强预后因子。诊断中肿瘤低级CMV感染(定义为少于25%病毒阳性细胞)的患者存活时间比高级感染患者长2.5倍(21)。体外，更昔洛韦治疗抑制肿瘤生长达80-95%，并且动物模型显示了使用靶向病毒复制的药物使肿瘤生长抑制40-75% (8，22)。
[0008]CMV逃避免疫系统的检测CMV发展出设计成避免被免疫系统识别的复杂机理。例如，CMV抑制I类和II类HLA分子的表达和抗原呈递，其控制T细胞活化、抑制NK细胞活化、保护细胞免受从活化T和NK细胞释放的细胞溶解肽影响(16，23)。CMV也自身生成，并且控制细胞生成趋化因子、细胞因子和生长因子(15)。这些是使免疫系统不能识别感染细胞的策略示例，并且可以解释为什么CMV感染肿瘤不受免疫系统或针对其开发的免疫治疗的控制。因此免疫系统不能识别感染的肿瘤细胞(综述参见(16，23)，同时所述病毒依赖于炎症(24)。我们小组第一次鉴定了骨髓谱系细胞是潜伏病毒的主要循环载体(24)，并且T细胞的免疫活化和后续生成TNF- a和IFN- y (造成巨噬细胞分化)是潜伏CMV重新活化的关键因素(24，25)。病毒感染也诱导C0X-2(18，26-28)，并且我们近期发现了所述病毒也诱导5-L0表达(29)以诱导炎症和增强病毒复制，所述表达在肿瘤生物学中有高相关性。
[0009]CMV基因产物赋予化疗抗性
[0010]细胞凋亡，或程序性细胞死亡是NK细胞和细胞凋亡T细胞介导的杀伤机制的最后步骤。肿瘤细胞对药物诱导死亡的灵敏度减弱是抗癌症治疗失败的主要原因。至少五种不同的CMV蛋白(即IE1、IE2、UL36和UL37、UL38)抑制细胞凋亡，并且可以增强CMV感染肿瘤细胞的存活。这些蛋白也可以防止所需的化疗作用。神经母细胞瘤细胞中UL36的表达赋予化疗抗性(30)，支持了这种假说。
[0011]癌症中CMV致密体的关键作用
[0012]越来越多的数据显示了不同来源的癌症中频繁检测出CMV蛋白。>90的成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌、胰腺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、卵巢癌、宫颈癌显示了肿瘤细胞中的高CMV蛋白表达，但是肿瘤周围的非肿瘤组织中都是病毒阴性。我们也检测了患者活检，并且发现它们就CMV蛋白表达而言都为高阳性。CMV蛋白在肿瘤中广泛表达，并且CMV RNA转录物容易检测，但与此形成鲜明对比的是，相同组织样品中难于检测CMV DNA。这是一个迷惑了本领域诸多研究员的有争议的议题，并且这是否是人为假象(artefact)也引起了关注。
[0013]因此，本领域长期需要揭示CMV感染策略和其如何影响如癌症的开始或进展，并对其进行广泛研究。这归因于以下事实:这种揭示可以发现能更早治疗所需患者的潜在诊断方法以及可能的新治疗处理。
【发明内容】
[0014]本发明人现在通过定义新的巨细胞病毒(CMV)基因变体解决了本文提出的问题，所述基因变体显示缺失快速早期基因(IE) CMV基因组的内含子2 (SEQ ID NO: 17)，所述基因变体命名为CMV IEAi2。本发明也涉及方法和应用，所述方法和应用包含发现的名为CMVIEA i2的新CMV基因变体，表示通过缺失主要快速早期基因中内含子2 (SEQ ID NO: 17)的野生型CMV和/或新病毒株的变体，以及从所述基因变体转录的剪接变体和基因变体翻译的蛋白。所述方法应用于诊断例如癌症倾向和已经发展的癌症疾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1:通过免疫组织化`学检测人巨细胞病毒(CMV)蛋白。在获自GBM(多形性成胶`质细胞瘤)患者(A)、神经母细胞瘤NB(B)、髓母细胞瘤MB(C)和结肠癌组织(G)以及乳腺癌组织(H)的脑肿瘤组织中检测到CMV立即早期抗原(CMV-1EA)。针对平滑肌细胞a肌动蛋白的抗体(D，E，F)和针对角蛋白20(1)和细胞角蛋白(J)的抗体用作对照。非特异条=50 u m0
[0016]图2:乳腺癌样品中人巨细胞病毒立即早期(CMVIE)和晚期(LA)蛋白的免疫组化染色。CK表示肿瘤细胞的细胞角蛋白染色作为阳性或染色对照，阴性(Neg)对照表示同种型对照抗体。照片显示了 CMV的限制性表达，即肿瘤细胞中的CMV蛋白。
[0017]图3:淋巴结中乳腺癌肿瘤淋巴结大量转移的人巨细胞病毒立即早期(CMVIE)和晚期(LA)蛋白的免疫组化染色。CK表示肿瘤细胞的细胞角蛋白染色作为阳性(即染色对照)，阴性对照表示同种型对照抗体。照片显示了 CMV蛋白在肿瘤细胞和肿瘤转移中的限制性表达。
[0018]图4:就人巨细胞病毒立即早期抗原(CMV IEA)和pp65而言细胞系(髓母细胞瘤D283)的流式细胞术染色。在不同来源的肿瘤细胞系中经常检测到不同蛋白表达水平的CMV蛋白表达(n=40;CMV阳性细胞在0.5-69%之间变化，并且在相同细胞系的不同取样时间也不同)。
[0019]图5:野生型中人巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)基因和CMV IE基因区域PCR所用不同引物定位的示意图。在CMV IEA i2中，内含子2缺失，这通过使用主要立即早期(MIE)外引物和MIE内引物对的巢式PCR或者使用仅允许缺失变体生成阳性信号的跨越外显子2和3的探针的Taqman PCR确证。
[0020]图6:巢式PCR在癌症患者中扩增218bp的PCR DNA片段；大小与实验室巨细胞病毒株(CMV)感染细胞的RNA样品的cDNA相似(C3)，而相同培养的DNA制品扩增332bp的PCR片段(C2)。从健康供体(HD)和有感染性单核细胞增多症(MN)的病毒血症(viremic)患者中扩增野生型DNA片段。HD:健康供体，CC:结肠癌，NTC:无模板对照，NB:神经母细胞瘤，BrC ;乳腺癌，OvC:卵巢癌，Cl:未感染的成纤维细胞，C2 =CMV感染的成纤维细胞的DNA，C3 =CMV感染的成纤维细胞的cDNA。
[0021]图7:显示载有CMV IE A i2变体的癌症患者(A)或健康供体野生型变体(B)中内含子2缺失的色谱图。图显示了载有CMV IE A i2变体的癌症患者中内含子2缺失位点(A)(序列:GTG GCC TTG GTC ACG GGT GTC TCG GCC GTG GCA CCT TGG AGG AAG GGC CCT)或健康供体野生型变体中内含子2缺失位点(B)(序列:ACG TCG TGG CCT TGG ACA CGG GTGTCT CGG CCT AAA CAC ATT AGA AAT AG)。 [0022]图8:A和B)测序PCR产物的比对显示了在不同来源癌症中发现的人巨细胞病毒(CMV) IE A 12株的内含子2缺失。指示了外显子2和外显子3，以及用于巢式PCR的引物定位。在例如乳腺癌、结肠癌、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤和成胶质细胞瘤中发现了 CMVIE A i2，但是病毒血症患者或健康对照载野生型CMV株。
[0023]图9:常用于实验室研究的三种不同病毒株的巢式PCR ;VR1814、TB40、AD169扩增332bp的野生型片段。样品从病毒储液或感染细胞中制备。NTC:阴性对照，C2:感染细胞的cDNA扩增218bp片段。
[0024]图10:巢式PCR从动脉粥样硬化患者和感染性单核细胞增多症患者(MN)的血清样品中扩增318bp的野生型DNA片段。C2 =CMV野生型感染细胞的cDNA样品也显示了野生型DNA条带(所述样品没有经DNA酶处理)，这在相同细胞的DNA制品中可以观察到(C3)。
[0025]图11:健康血液供体中的DNA扩增。C2:DNA野生型(wt) CMV的阳性对照。在12_13%的检测对照中发现一个有CMV IE A 12株的个体(22)。
[0026]图12:A和B)GBM RNA转录物的序列比对，所述转录物如来自成胶质细胞瘤原代细胞培养物(从3个不同烧瓶中收集)的CMV DNA，显示了快速早期(IE)基因中内含子2缺失。IE1、IE9、IE17.5和IE19的编码序列与外显子2和外显子3的Merlin参照序列(基因库AY446894.2) 一起显示。
[0027]图13:使用人巨细胞病毒(CMV)单克隆抗体(克隆810R)对神经母细胞瘤(NB)原发性肿瘤的Western印迹分析。CMV蛋白立即早期(IE)55、IE72和IE86并不丰富；仅一个样品显示了 IE55(NB7)。相反，新蛋白重新表达的大小是38、31、20和lOkDa。图14显示阳性对照。
[0028]图14:使用人巨细胞病毒(CMV)单克隆抗体(克隆810)对成胶质细胞瘤原发性肿瘤的Western印迹分析。CMV蛋白立即早期IE55、IE72和IE86并不丰富；仅两个样品显示了 IE72(42，50)。相反，表达的新蛋白的大致分子量是50、53、28、24、19和lOkDa。阴性对照是未感染的成纤维细胞MRC-5 ;阳性对照在感染后15天感染的MRC-5。
[0029]图15:使用针对IE86的人巨细胞病毒(CMV)肽抗体对成胶质细胞瘤原发性肿瘤细胞培养物的Western印迹分析。两次曝光以显示有野生型CMV株VR1814的病毒感染细胞的阳性对照。在原代培养中CMV蛋白IE55和IE86以及40kDa和20kDa蛋白非常丰富，而缺失在原发性成胶质细胞瘤中表达的数种独特蛋白。仅有两个样品表达50、53kDa蛋白(30，46)，三个样品表达28kDa蛋白(42，47，48)。相反，新蛋白重新表达的大小是50、53、28、
24、19 和 IOkDa0
[0030]图16:使用包含细菌人工染色体(BAC)载体中人巨细胞病毒(CMV)全基因组的CMV探针的荧光原位杂交(FISH)分析。A)感染7天后CMV野生型感染细胞(AD169)。B)CMV野生型病毒的健康载体。C)成胶质细胞瘤的印迹显示了 CMV基因组的外周定位，有时扩增为如D)另一个成胶质细胞瘤患者所示。CMV基因组的外周定位模式在载有癌细胞CMVIE A i2株的癌症患者中极不同，并且可重复(n=40; 100%)。[0031]图17:A)使用包含细菌人工染色体(BAC)载体中人巨细胞病毒(CMV)全基因组的CMV探针的荧光原位杂交(FISH)分析显示了成胶质细胞瘤患者肿瘤细胞中CMV基因组整合入染色体17。表示染色体17的两个染色单体上所存在CMV DNA的两个小点在更高放大倍数下可见⑶。
[0032]图18:A)GBM患者中发现RNA转录物的序列比对。已知来自Awasthi等J Virol,2004年8月，第8191-8200页(31)的剪接变体的示意图。来自发表杂志(Awasthi等，JVirol，2004年8月，第8191-8200页(31)，显示IEl和IE2的氨基酸比对和剪接变体)的立即早期(IE)19、IE17.5和IE9的序列比对。B)附图显示来自IE基因的外显子2、3、4和5的多个剪接变体。
[0033]发明详述
[0034]定义
[0035]本文所述“内含子”是基因中通过RNA剪接除去以生成基因最终成熟RNA产物的任意核苷酸序列。术语内含子指基因中的DNA序列，但是在有内含子的基因转录的RNA转录物相应序列中除去。
[0036]本文所述“外显子”指转录成信使RNA的蛋白合成信息编码DNA的核酸序列。
[0037]本文定义的“CMV IEAi2”也称为“CMVIEAint2”，指作为CMV独立株的CMV基因变体，对应图5中所示CMV IE基因组的核酸序列，但是其中称为立即早期区域的内含子2对应部分(IE的内含子2示于SEQ ID NO: 17)DNA中缺失、缺少或删除，如图6、7和8所示。所述野生型CMV株参照基因库(AY446894.2 Merlin)，在包含IE基因的碱基对位点170689-176186有立即早期基因，如图5中是参照基因，和图8缺失内含子2的CMV IEAi2。因此，所述基因变体还表征为所述基因变体缺失Merlin参照序列AY446894.2 (野生型CMV)的位点173903到位点174019的核酸序列。
[0038]“立即早期”(IE)基因是在急性感染和响应广泛细胞刺激中短暂和快速活化的基因。这表示感染中CMV基因组转录的第一组基因，随后是其控制转录的早期和晚期基因。IE基因表示在任何新蛋白合成前，对刺激的第一轮响应中于转录水平活化的有效反应机理。定位在CMV基因组的病毒长独特(Unique long) (UL)基因片段上的主要立即早期基因UL123/122，指位于野生型CMV Merlin株(基因库AY446894.2)的碱基对位点170689-176186的区域。主要立即早期基因在主要立即早期(MIE)启动子控制下转录，生成编码数个IE蛋白(IEl或IE72、IE2或IE82-86、IE86、IE2-55或IE55)的正义RNA转录物。这些蛋白共有外显子2和外显子3，并且因此有相同的蛋白N末端。除了这些主要IE蛋白，其他IE蛋白通过翻译修饰的mRNA分子转录物生成(见下)。
[0039]本文所述巨细胞病毒(CMV) “基因变体”指仅缺失内含子2的CMV变体或新的CMV病毒株，新的CMV病毒株与其他CMV株相比是变体，其中通常称为CMV基因组的立即早期区域(见图5)已改变并且不包含区域内含子2(见图6、7和8)。因此，所述变体是“基因改变“或“遗传改变”，因为变体已经在CMV病毒的DNA水平发生，并且因此在这个基因变体的CMV蛋白转录和翻译后的事件(下文进一步解释)中扩大。SEQ ID NO:1核酸序列定义了本文定义的以及与野生型CMV相比的基因变体的DNA区域特征。这个区域对应野生型CMV的外显子2和3，由于内含子2缺失，其直接连接到野生型CMV基因变体的DNA上。如果CMV病毒有这种修饰区域，其能用于鉴定这种CMV病毒是野生型CMV的基因变体。这能使用PCR方法或本文进一步定义的方法进行。
[0040]“剪接变体”由有时称为可变剪接(或差异剪接)的过程生成，通过所述过程由基因转录(初级基因转录物或前mRNA)生成的RNA外显子(例如本文中的基因变体CMVIEA i2)在RNA剪接中以多种方式重新连接。在分子生物学中，“RNA剪接”是转录后对RNA的修饰，其中移除内含子并连接外显子。这对于典型真核细胞信使RNA(mRNA)而言，在其能用于通过翻译生成正确蛋白之前是必需的。对很多真核内含子而言，由剪接体(小核核糖核蛋白(snRNP)复合物)催化的一系列反应完成剪接，但是也有自我剪接的内含子。
[0041]所得的不同mRNA可以翻译成不同的蛋白同种型，并且都由野生型CMV感染的5’末端转录生成。在主要IE基因中，已知6个已知的剪接变体生成变体IE蛋白，例如包含外显子2和外显子3 (见图5和8) ；IE9 (AY445661.1 ;外显子2和3和外显子4的2个氨基酸；预测是10kD，但在感染细胞中不能观察到的蛋白)、IE19(AY436380.1 ;外显子2，3和外显子4的片段，生成38kD蛋白)、IE17.5 (AY445660.1 ;外显子2，3和外显子4的小片段，共有IE19，生成31kDa蛋白)、IE18(SEQ ID NO: 2 ;外显子2，3和5，生成18kDa蛋白)。两个IE 蛋白从外显子 5 生成；IE40 (SEQ ID NO: 3; 40kDa 蛋白)和 IE60 (SEQ ID N0:4;60kDa 蛋白)。因此，单个基因可以编码多个蛋白。因而，本文不同的“剪接变体”通过基因变体CMVIE Δ i2转录中发生的不同剪接事件生成，以生成新的IE RNA转录物和IE蛋白。
[0042]因此，本发明涉及巨细胞病毒(CMV)的基因变体，本文称为CMV IEΔi2或CMVIE Δ int2，所述基因变体缺失CMV基因组的IE基因的内含子2。所述CMV基因变体显示在遭受癌症疾病的患者中有高流javascript:addCharactor('%CE%94');行性，这在下文进一步说明。
[0043]发现CMV IE Δ 12在有不同癌症形式的患者中有高流行性(72/86，84%)，而在病毒血症患者(1/19，10%)和健康群体(15/100 ;2010年测试的15%，1995年测试的0/285)中检测出的频率较低(32)。有这种CMV基因变体感染的肿瘤细胞表达RNA剪接变体和新的CMVIE蛋白，进一步帮助癌症的建立和发展。这种新的CMV株检测为活性病毒感染，在不同组织/器官的肿瘤细胞中生成病毒蛋白，而肿瘤周边的非肿瘤组织仍保持CMV蛋白阴性。
[0044]所述CMV IEA i2分离自100个临床分离物中的3个。在全部三个示例中，所述CMV IE Δ 12病毒用野生型CMV病毒分离，并且似乎有更低的生长速率和更低的复制效率。
[0045]目前还不知道CMV IE i2株的载体对癌症或CMV阳性肿瘤发展的终身风险是什么，仅有84%载有CMVIE Δ i2株。因此，还不知道10-15%感染有CMV IE Δ i2株的个体中有多少会患癌，但出于多种原因仍需要鉴定这种CMV IEΔ12株的载体，这在下文会进一步说明。
[0046]目前还不知道基因变体CMV IE Δ i2的转录是怎样调节的。在肿瘤组织样品中，存在CMV IE Δ 12与剪接CMV变体IE蛋白的高表达相关联。
[0047]因此，本发明的一方面中，可以检测哺乳动物癌症的倾向和/或诊断癌症形式，所述检测和/或诊断通过鉴定CMV Δ IEi2株的载体，例如通过检索SEQ ID NO:1中公开的变体鉴定标记，和使用多种常用技术。这种信息能用于避免通过生物样品在个体之间转移CMVΔIE12株，所述生物样品例如通过血液捐赠、器官和干细胞移植以及哺乳。[0048]约70%的成年群体是巨细胞病毒(CMV)的载体。近期在>90%不同来源的肿瘤中发现CMV蛋白和核酸，所述肿瘤包含成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌。越来越多的证据提示许多CMV蛋白是致癌或癌症调节性的，但是仅有少数CMV载体患癌。在84%肿瘤患者、原发性肿瘤培养物(89%)或细胞系中检测到至今未知的CMV病毒株，而仅在0-15%健康血液供体和10%CMV病毒血症患者中发现此病毒株。所述病毒株通过在CMV基因组立即早期区域中缺失内含子2来鉴定。剪接RNA变体和独特(unique)病毒蛋白在肿瘤细胞中通过CMV IE A i2株生成。CMV IE A i2株在个体中引起癌症的致癌能力外显率仍然有待揭示。经血液输入扩散这种病毒能通过所述方法防止，以测定哺乳动物中存在这种CMV株，如本发明所示例。
[0049]本发明公开了确切证据，显示肿瘤中CMV感染描述了与不同癌症形式高度有关的新CMV变体(CMV IEAi2)。有这种CMV变体的癌细胞感染表示新的感染实体，从癌症干细胞中生成缺陷性颗粒“致密体”，因而提出了癌症诊断和发展的新模型。作为支持，揭示了新的CMV遗传变体，在CMV基因组的主要立即早期区域中恒定缺失内含子2。
[0050]在原发性肿瘤、原发性肿瘤培养物和细胞系中，CMV感染的肿瘤细胞生成新RNA转录物和CMV IE蛋白。RNA转录物和蛋白通过致密体或外来体(exosome)从CMV DNA阳性细胞递送到周围细胞，在不复制病毒的细胞中引起CMV蛋白表达，从而使得细胞转化，因为其不经历裂解感染。 [0051]不受特定理论的限制，患肿瘤的组织/器官可能依赖于载有CMV A IEi2株的潜伏感染细胞向组织的募集和病毒再活化，通过主要递送缺陷性病毒颗粒(即致密体或外来体)中的CMV蛋白和RNA造成靶标组织中细胞的致癌转移和癌症发展。由于炎症是潜伏CMV重新活化的驱动力，癌症开始的起始步骤可能依赖于炎症这一熟知的癌症风险因子。当活化时，所述CMV IE A i2会从CMV IE区域生成新的RNA转录物(正义和反义RNA，如图12中由CMV 1￡八12生成所述)。在CMV致密体中的细胞之间转移IE蛋白，是很多癌症形式的主要原因。
[0052]CMV IEA i2株在已建立癌中如此普遍的事实进一步加强了其潜在高度恶性潜能的猜疑。变体CMV株(CMV IEA12)的检测因而可以在输入血液或干细胞移植物、在器官移植前进行，以避免貌似致癌CMV株的转移，和避免在患者生命晚期发展疾病。这可以如本发明所示方面来进行。
[0053]再者，多于90%CMV血清阳性哺乳母亲在其乳汁中有重新活化的潜伏CMV，并且一岁孩童中CMV的流行性是30-40%，主要归因于通过乳汁的病毒转移。因此，哺乳期母亲会选择测试其是否是CMV IE A 12株的载体，以避免哺乳和把貌似致癌CMV株转移给其小孩，并且因而降低未来患癌的风险。所述测试方法也应用于可以包含病毒的新鲜和存储精液，以避免通过精子注射转移病毒。因而，本发明也涉及从哺乳母亲获得的生物样品中鉴定和/或检测本文所述基因变体的方法。
[0054]人样品中存在CMV IE A i2(组织，或体液如血液、血清、血浆、乳汁、精液、尿液和唾液，或干细胞样品)用特异检测立即早期基因缺失内含子2的PCR技术来诊断，并且新蛋白使用Western印迹或ELISA方法检测。本文公开了本发明所包含并且在材料和方法部分详述的三个诊断PCR方法示例，显示了从获自有不同常见癌症形式的患者生物样品的野生型CMV株中检测CMV IE A i2株的可行性。[0055]使用不同CMV特异抗体通过Western印迹检测肿瘤细胞的细胞裂解液中由CMVIEA i2株生成的新蛋白。
[0056]使用这些蛋白特异抗体的ELISA用于匹配蛋白，以进一步在夹心ELISA设置中检测。因此，这可以用于本发明的某些方面。另外，从5’末端或3’末端转录的新型正义和反义转录物蛋白分别用于ELISA以检测针这些独特蛋白生成的抗体，筛选其在血清或血浆中的存在以定义CMV IEA i2株的载体，并且用作疾病的生物标记。在本发明的其他方面，静脉内免疫球蛋白中CMV的抗体或对CMV IE A 12株所生成致密体包膜中存在的CMV蛋白特异的单克隆或多克隆抗体用于在人样品(如血清或血浆)中富集这些颗粒，以检测CMV IE A i2株的活性形式。PCR、Western印迹或ELISA技术用于确证核酸或新蛋白的存在。
[0057]因此，一方面，本发明涉及巨细胞病毒(CMV)的基因变体，所述基因变体表征为CMV基因组的立即早期(IE)基因缺失内含子2 (CMV IEAi2), IE的内含子2序列示于SEQID NO: 17。所述基因变体能因此进一步表征为缺失SEQ ID NO: 17核酸，即Merlin参照序列AY446894.2的位点173903到位点174019的核酸序列。其中相较野生型株，所述基因变体CMV IE A i2中去除或删除所述序列(SEQ ID NO: 17)，在所述基因组的区域，如SEQ ID NO:1特定所示生成DNA序列，即其中由于缺失内含子2，外显子2和3邻接。
[0058]SEQ ID NO:1通过使用SEQ ID NO: 7和8特定所示引物生成，并且用于扩增CMVDNA0 引物位置是 Merlin 序列 AY446894.2 的位点 173741 — 174073。
[0059]本文其他方面中，包含本文所定义基因变体转录获得的RNA剪接变体。在另一个方面，本发明涉及基因变体CMV IE Ai2转录获得的RNA剪接变体。一方面，所述RNA剪接变体由CMV IE基因的外显子2和3，和/或其部分组成。[0060]本
【发明内容】
中，包含外显子一个或多个部分的RNA剪接变体指RNA剪接变体，其由例如一个外显子的一部分和完整的另一外显子构成，如图12b所示。
[0061]另一方面，所述RNA剪接变体由CMV IE基因的外显子2、3和4或其部分组成。另一方面，所述RNA剪接变体由CMV IE基因的外显子2、3和5和/或其部分组成。应理解，在本文所示本发明的所有方面，本文所述基因变体(CMV IE A i2)和/或RNA剪接变体和/或蛋白能用于例如本发明的任何方法或应用或试剂盒，以鉴定CMVIEA i2株和其载体。
[0062]本发明另一方面涉及本文所定义RNA剪接变体编码的蛋白，所述蛋白选自大小约为 150、125、86、72、55、53、50、40、38、36、32、31、24、20、19、18、14、12 和 IOkDa 的 CMV 蛋白。
[0063]本发明另一方面涉及在所述生物样品中检测是否存在CMV基因变体(CMVIE A i2)和/或如本文所定义从其转录的一个或多个RNA剪接变体，和/或从本文所定义剪接变体翻译的一种或多种蛋白，所述方法包括步骤:a)从哺乳动物提供生物样品，b)通过对步骤a)所得样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述一种或多种剪接变体翻译的一种或多种蛋白。
[0064]本发明另一方面涉及在所述生物样品中检测是否存在CMV基因变体(CMVIE A i2)和/或其转录的RNA剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白，所述方法包括步骤:a)对所述样品进行技术分析，并且其后，b)在所述生物样品中检测是否存在CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从剪接变体翻译的一种或多种蛋白。[0065]另一方面，本发明涉及检测哺乳动物患癌倾向的方法，所述方法包括步骤:a)从所述哺乳动物提供生物样品，和b)通过对步骤a)所得样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从剪接变体翻译的一种或多种蛋白，和c)基于所述哺乳动物的所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体(CMV IE A i2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白以测定患癌的倾向。
[0066]一方面，本文定义了检测哺乳动物患癌倾向的方法，所述方法包括步骤:a)通过对生物样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从剪接变体翻译的一种或多种蛋白，和b)基于所述哺乳动物的所述生物样品中是否存在CMV基因变体(CMV IE A i2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白以测定患癌的倾向。
[0067]另一方面，本发明涉及诊断哺乳动物(所述哺乳动物有CMV感染)巨细胞病毒(CMV)相关癌症形式的方法，所述方法包括步骤:a)从所述哺乳动物提供生物样品，和b)通过对步骤a)所得样品进行技术分析以测定所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，并且基于所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的蛋白以诊断所述哺乳动物是否有CMV相关癌症疾病。
[0068]另一方面，本文定义了诊断哺乳动物(所述哺乳动物有CMV感染)巨细胞病毒(CMV)相关癌症的方法，所述方法包括步骤:a)通过对生物样品进行技术分析以测定所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，和b)基于所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的剪接变体和/或其翻译的蛋白以诊断所述哺乳动物是否有CMV相关癌症疾病。
[0069]本文定义的方法中，是否存在本文定义的CMV基因变体(CMV IE A i2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白是根据所述哺乳动物中是否存在上述基因变体、剪接变体和/或蛋白的抗体来测定。
[0070]另外，在本文定义的方法中，是否存在本文定义的CMV基因变体(CMV IEAi2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白可以通过所述哺乳动物中是否存在针对本文所定义CMV基因变体，针对从CMV基因变体转录的一种或多种剪接变体和/或针对从其翻译的一种或多种蛋白的T细胞来测定。
[0071]本文定义方法中使用的所述生物样品可以是本文定义的任意生物样品，从这些样品中可以分离出病毒颗粒以用于检测。如果所述生物样品包含细胞，这些细胞可以在检测病毒材料前裂解，并且所述病毒材料之后从其中分离。所述生物样品也可以是除了细胞样品之外的血浆样品。因此，本
【发明内容】
中，所述生物样品可以选自但不限于血液样品、血浆样品、组织样品、干细胞样品、器官移植物样品、精液样品、尿液样品、唾液样品和乳汁样品。
[0072]在本文所述方法中，所述技术分析可以通过DNA检测方法例如ISH (原位杂交)来进行。
[0073]—方面，本发明涉及本文定义的方法，其中所述方法的所述技术分析通过包含聚合酶链式反应(PCR)的方法来进行，所述PCR方法例如TaqMan ?实时PCR或序列捕获PCR。一方面，所述PCR可以通过扩增CMV的IE基因外显子2和3的至少部分来进行，以测定SEQID NO:1的存在，即在所述样品中检测CMV IE A i2。这是通过使用图5和图8和表1中示例的引物来进行。这种方法也用于在载有CMV IE A i2潜伏形式的干细胞中检测CMV IEA12,例如在⑶34阳性造血干细胞、在循环或组织驻留⑶133阳性干细胞和在循环或组织驻留内皮祖细胞中，所述细胞通过其表达血管内皮细胞生长因子2(VEGFR2)来鉴定。[0074]另一方面，本发明所述方法的技术分析通过使用FISH技术(荧光原位杂交)进行。FISH是用于检测和定位染色体上是否存在特异DNA序列的方法。FISH使用的荧光探针仅仅结合到与其有高度序列相似性的染色体部分上。荧光显微镜能用于发现荧光探针结合到染色体的哪个部分。FISH经常用于发现DNA中的特异元件以用于基因建议、医疗和特异性鉴定。FISH也能用于检测和定位组织样品中的特异mRNA。在这种背景下，其能在细胞和组织中帮助定义基因表达的空间一时间模式。在其他方面，FISH技术能包含DNA或RNA探针，以分析检测基因变体CMV IE A i2感染细胞中的DNA定位特异模式，以及鉴定CMVIE A i2 DNA整合到人染色体中。与潜伏野生型CMV或野生型CMV活性复制相比，CMV阳性肿瘤细胞中的DNA定位模式显著不同。
[0075]另一方面，使用抗体进行本发明方法的技术分析。这种抗体可以例如针对CMV基因组立即早期(IE)区域的外显子2和3(即在其上编码蛋白)，并且因此测定在要分析的生物样品中是否存在CMV基因变体。其他方面中，也能使用针对其他区域的抗体，例如针对非感染CMV颗粒的抗体，所述CMV颗粒如来自癌症患者血液、血浆或血清的致密体或外来体。本发明的其他方面中，本文所述的不同技术分析方法能联合鉴定是否存在CMV IEAi2基因变体和/或一个或多个RNA剪接变体和/或从所述RNA剪接变体表达的一种或多种蛋白，如抗体检测然后PCR或Western印迹，或任意其他组合。抗体也能用于检测是否存在非感染性或缺陷性CMV颗粒，包含从基因变体CMV IE A i2翻译的致密体。本
【发明内容】
中，本文所示例方法能用于诊断癌症，其中所述癌症选自:成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性黑素瘤、皮肤癌和肉瘤、肾癌、胰腺癌及其转移。如果癌症形式涉及本文定义的CMV基因变体，也可以诊断本文没有描述的其他癌症形式。
[0076]本文公开的方法中，用SEQ ID NO:1所含的核酸(例如通过扩增所述区域的PCR方法)来检测本文定义的CMV基因变体(CMV IE A i2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。
[0077]本文公开的任何方法也可以是体外方法。
[0078]另一方面，本发明也涉及使用本文定义的CMV基因变体(CMV IEAi2)和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，以检测哺乳动物的癌症倾向。
[0079]另一方面，本发明涉及使用本文定义的CMV基因变体(CMV IEAi2)和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，以诊断哺乳动物巨细胞病毒(CMV)相关癌症形式。所述能诊断的癌症形式可选自:成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性黑素瘤、皮肤癌、肉瘤、基底细胞癌和胰腺癌。如果癌症形式涉及本文定义的CMV基因变体，也可以诊断本文没有描述的其他癌症形式。本文也涉及使用CMV基因变体(CMV IE A i2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白，其中所述变体通过使用SEQ ID NO:1所含核酸检测，例如通过在扩增所述区域的PCR方法中使用SEQ ID NO:1。
[0080]本
【发明内容】
中，本文所述哺乳动物能是任意哺乳动物，例如人类。
[0081]一方面，本发明也涉及试剂盒，所述试剂盒包含在获自哺乳动物的生物样品中诊断、和/或检测是否存在CMV基因变体(CMV IEA12)和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，也包含载有潜伏CMV IE A 12的细胞例如⑶34和VEGFR2阳性细胞。一方面，所述试剂包含进行聚合酶链式反应(PCR)的试剂。另一方面，所述试剂包含抗体。
[0082]一方面，本发明也涉及诊断方法/试剂盒，所述诊断方法/试剂盒包含诊断试剂，和/或检测针对患者血清或血浆样品中CMV IE A 12株的剪接变体IE蛋白生成的抗体(使用方法以检测对CMV IE A i2株相关肽特异的抗体)，和更高水平的这些抗体；例如使用IE剪接变体蛋白涂层的ELISA板、膜或珠，等等，作为癌症或患癌风险的生物标记。
[0083]一方面，本发明也涉及诊断方法/试剂盒，所述诊断方法/试剂盒包含试剂以诊断、和/或检测患者中与CMV IE A 12株生成肽反应的T细胞，作为癌症或患癌的生物标记。
[0084]另外，常见人癌症形式中CMV IE A i2株感染的细胞表示恶性转化的细胞。在肿瘤细胞中鉴定以更高丰度生成的本文所定义新IE CMV蛋白允许靶向新CMV蛋白的免疫治疗和治疗性疫苗接种，并且因而有效消除CMV IEAi2株感染的细胞。显示了肿瘤中的干细胞都表达这些CMV蛋白以及高水平I类和II类MHC分子，显示了将其靶向特异免疫治疗的可行性。
[0085]通过血浆去除术从癌症患者富集的抗原呈递细胞(例如树突细胞)用载体中的CMVIE A i2 DNA、RNA离体培养以在细胞中生成蛋白，或者来自肿瘤的纯化蛋白或外显子2和外显子3的重组蛋白会用于呈现患者的自体T细胞。培养中扩增的活性T细胞作为过继性治疗再给予患者以治愈癌症。或者，在树突细胞疫苗接种方案中，树突细胞通过系列注射给予回患者以刺激体内T细胞扩增成CMV IE A 12相关肽。两种方案的目的是杀死癌症患者中病毒感染的肿瘤细胞和肿瘤干细胞。
[0086]所述CMV IEA i2株蛋白用于诱导抗体生成，包含细胞凋亡诱导抗体，旨在用于转移至癌症患者以发现和杀死病毒感染的肿瘤细胞和肿瘤干细胞。因此，本发明一方面涉及本文所述的这种治疗方法。
[0087]其他方面中，本文所述的CMV IEA i2基因变体用于发展保护疫苗以从社会中消除这种病毒株。基于蛋白的表达载体和技术用于表达新的CMV IEAi2 IE蛋白，所述蛋白用于生成就预防和治疗疫苗而言针对CMV IE A i2株的亚基疫苗。发展新型CMV IEAi2株的DNA疫苗以表达新的IE蛋白，所述蛋白用于靶向CMV IE A i2株的预防和治疗疫苗。因此，本发明的其他方面涉及用作治疗或预防疫苗的编码CMV IE Ai2株的疫苗载体。另一方面，本发明涉及本文定义的CMV基因变体(CMV IEAi2)，或使用SEQ ID N0:1，和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，以制备针对CMV感染进行治疗或预防疫苗接种的的疫苗载体。在一些方面，RNA转录物能用于表达本文公开的来自CMVIE A i2IE区域的新CMV蛋白，所述蛋白用作治疗或预防疫苗接种的疫苗载体。在其他方面，从CMVIE A i2的IE区域生成的IE蛋白能用于过继性治疗以(离体)刺激T细胞。另外，本文所述转录物和蛋白能如本文所示例进一步用作免疫治疗的靶标并且用于开发预防和治疗疫苗。在本发明的一些方面，颗粒可以从血液中选择，并且用作原发性癌症或转移疾病的生物标记。这种颗粒也可以从肿瘤细胞培养物分离并且用于疫苗接种。载有基因变体CMV IEA12的循环肿瘤细胞能用PCR检测，例如作为癌症和转移疾病的生物标记。
[0088]本发明的其他方面中，能避免通过人组织或细胞移植来转移CMV IE A i2株(包含血液灌注、干细胞或器官移植物、或从哺乳期妇女到小孩)从而消除癌症风险的转移，所述避免是通过检测获自哺乳动物(如人)的生物样品中是否存在基因变体CMV IE A i2和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白。所述方法也能用于匹配CMV IE A 12器官和血液供体与载有相同株的受体。
[0089]实验部分
[0090]缩写
[0091]
【权利要求】
1.一种巨细胞病毒(CMV)基因变体，其特征在于，缺失CMV基因组立即早期(IE)基因的内含子 2 (SEQ ID: 17) (CMV IEAi2)。
2.如权利要求1所述的基因变体，其特征在于，缺失的是Merlin参照序列AY446894.2 (野生型CMV)的位点173903到位点174019的核酸序列。
3.—种从权利要求1-2中任一项所述的基因变体转录获得的RNA剪接变体。
4.如权利要求3所述的RNA剪接变体，其特征在于，所述剪接变体由CMVIE基因的外显子2和3，和/或其一个或多个部分组成。
5.如权利要求3所述的RNA剪接变体，其特征在于，所述剪接变体由CMVIE基因的外显子2、3和4，和/或其一个或多个部分组成。
6.如权利要求3所述的RNA剪接变体，其特征在于，所述剪接变体由CMVIE基因的外显子2、3和5，和/或其一个或多个部分组成。
7.一种由权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体或由权利要求3-6中任一项所述的RNA剪接变体所编码的蛋白，所述蛋白选自大小约150、125、76、75、72、55、53、50、40、38、36、32、31、30、25、19、18、14、12 和 IOkDa 的 CMV 蛋白。
8.在生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMVIE A i2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的RNA剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多 种蛋白的方法，所述方法包括如下步骤: a)提供来自所述哺乳动物的生物样品； b)通过对步骤b)所得样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求4-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。
9.在生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMVIE A i2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的RNA剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白的方法，所述方法包括如下步骤: a)对所述样品进行技术分析，然后 b)在所述生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。
10.检测哺乳动物患癌倾向的方法，所述方法包括如下步骤: a.提供来自所述哺乳动物的生物样品， b.通过对步骤a)所得样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白，和 c.在所述生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMVIE A i2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白，以测定所述哺乳动物患癌的倾向。
11.检测哺乳动物患癌倾向的方法，所述方法包括如下步骤: a)通过对生物样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白，和 b)基于所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMVIE A i2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白确定所述哺乳动物患癌的倾向。
12.诊断哺乳动物巨细胞病毒(CMV)相关癌症形式的方法，所述哺乳动物载有CMV感染，所述方法包括如下步骤: a)提供来自所述哺乳动物的生物样品； b)通过对步骤a)所得样品进行技术分析测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白，和 c)基于在所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的剪接变体和/或从其翻译的蛋白诊断所述哺乳动物是否有CMV相关癌症疾病。
13.诊断哺乳动物巨细胞病毒(CMV)相关癌症形式的方法，所述哺乳动物载有CMV感染，所述方法包括如下步骤: a)通过对生物样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白，和 b)基于所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的剪接变体和/或从其翻译的蛋白诊断所述哺乳动物是否患有CMV相关癌症疾病。
14.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IE A i2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白是根据所述哺乳动物中是否存在上述基因变体、剪接变体和/或蛋白的抗体来测定的。
15.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IE A i2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白是根据所述哺乳动物中是否存在针对如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体、针对权利要求3-7中任一项所述从CMV基因变体转录的一种或多种剪接变体和/或针对从其翻译的一种或多种蛋白的T细胞来测定的。
16.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自血液样品、组织样品、干细胞样品、器官移植物样品、精液样品、尿液样品、唾液样品、细胞拭子或乳汁样品。
17.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述技术分析通过DNA检测方法如ISH(原位杂交)进行。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述技术分析通过包含聚合酶链式反应(PCR)如Taqman PCR或序列捕获PCR试验的方法来进行。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述PCR通过扩增CMV的IE基因外显子2和3的至少部分来进行。
20.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述技术分析使用FISH技术(荧光原位杂交)进行。
21.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述技术分析使用抗体来进行。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗体针对从CMV基因组立即早期(IE)区域的外显子2和外显子3翻译的蛋白。
23.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症选自:成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性黑素瘤、皮肤癌、和肉瘤、肾癌、胰腺癌及其转移。
24.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，用SEQID NO:1包含的核酸来测定如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IE A i2)和/或如权利要求3_7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。
25.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是体外方法。
26.如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的RNA剪接变体和/或从其翻译的蛋白在检测哺乳动物癌症倾向中的应用。
27.如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的RNA剪接变体和/或从其翻译的蛋白在诊断哺乳动物巨细胞病毒(CMV)相关癌症中的应用。
28.如权利要求26-27中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症形式选自:成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性黑素瘤、皮肤癌、和肉瘤、肾癌和胰腺癌。
29.如前面权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，用SEQID NO:1包含的核酸来测定如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IE A i2)和/或如权利要求3_7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。
30.一种包含试剂的试剂盒，所述试剂诊断、和/或检测获自哺乳动物的生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IE A i2)，和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的剪接变体和/或从其翻译的蛋白。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包含进行聚合酶链式反应(PCR)或序列捕获PCR试验的试剂。
32.如权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包含抗体。
【文档编号】G01N33/68GK103649109SQ201280021200
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年4月13日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】赛西莉亚·那乌克勒 申请人:赛西莉亚·那乌克勒