专利名称：人胸腺素α原基因突变体合成、表达及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及人胸腺素α原的全基因合成、基因工程和含有胸腺素α原的制剂作为治疗人类免疫缺陷性疾病和癌症的治疗药物。
胸腺上皮细胞分泌的多种类激素在T淋巴细胞分化成熟的过程中起着重要的作用。胸腺素α1就是此类多肽之一，它是由28个氨基酸残基组成的等电点为4.2的酸性多肽，分子量为3KDa。它具有胸腺素组分V的部分功能。同时，在从胸腺素组分V分离α1时，发现了另一组分，它由35个氨基酸残基组成，其N-末端的28个氨基酸序列与胸腺素α1完全一致，具有与α1相同的生物学活性，称之为胸腺素α2。并且α1与α2C-末端最后一个氨基酸皆为谷氨酸，推测可能是某一分子较大的蛋白质在蛋白酶作用下分解成α1和α2两种活性成分。
Haritos等在液氮中直接匀浆新鲜胸腺后，迅速放入煮沸的磷酸盐缓冲液，以灭活内源蛋白酶，在进行蛋白分离时，并未发现胸腺素α1和α2，而得到一个分子量为12KDa的酸性蛋白，其等电点为3.55。氨基酸序列分析表明，其N-末端的前28个氨基酸残基与α1序列相同，前35个与α2序列相同，因此将该蛋白质称为胸腺素α原(prothymosinα，Pro Tα)。
以前胸腺素α原的基因克隆，都是通过PCR的方法，从其cDNA文库中扩增基因，由于其DNA序列中GC含量较高，因而表达水平一般偏低。国外多采用融合蛋白的方法进行表达，这又为以后的分离提取带来了困难，我们利用密码子的兼并性降低了其DNA中的GC含量，选择了大肠杆菌偏爱的密码子，进行了全基因合成，利用基因工程方法制备人胸腺素α原取得了成功。
本发明采用下述技术方案(1)鉴于遗传密码有兼并性和大肠杆菌对氨基酸密码子的偏爱与人体细胞的差异，本发明专门设计合成了人胸腺素α原基因大肠杆菌偏爱密码子的全DNA片段，它可以在不改变产物人胸腺素α原的氨基酸组成与排列顺序的基础上，提高胸腺素α原基因在大肠杆菌中的表达水平。其步骤为首先设计DNA序列，将全基因和起始、终止密码子、酶切位点等分成12个片段合成正、反两链，然后再以正、反两条链的5′端第1段序列为正、反向引物，进行PCR扩增，得到PCR产物与pUC19连接，测序正确后将PCR扩增产物插入国内已广泛采用的高效表达载体pBV220中，构建成胸腺素α原表达质粒pThα。它能在大肠杆菌HB101和DH5α中高表达，使胸腺素α原占菌体总蛋白的20％左右，表达率经100次以上传代不降低。
(2)通过发酵工程菌，用2YT作为基础培养基，适当增加碳源和氮源，通过优化溶氧、搅拌速度、发酵pH值等工艺参数，最终培养物OD600值可达25左右，生物量为每升培养物30-35g，产物表达率在20-25％之间。产物表达量可达每升培养物200mg以上。
(3)在此基础上建立了纯化工艺，其中包括菌体的破碎和产物抽提、热处理去除杂蛋白、阴离子交换层析和凝胶排阻层析精制等。
所建立的工艺稳定、回收率高、活性好。本工艺具有以下特点①通过热处理去除了90％以上的可溶性蛋白，而目标蛋白胸腺素α原无损失；②由于胸腺素α原pI＜4，因而阴离子交换层析可去除几乎所有的杂蛋白；③最后一步凝胶排阻层析可以去除大小分子量的酸性杂质。本工艺对三批各22.5L发酵产物纯化后每批可得纯品3-5g。
(4)纯品加入药用甘露醇以及磷酸盐缓冲液等稳定剂和助溶剂后，用微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成粉状成品。注射用水溶解后应用，可用于人免疫缺陷性疾病和癌症的治疗。
本品在体外能明显提高淋巴细胞玫瑰花结形成率，据此可以测定胸腺素α原的生物活性。
胸腺素α原治疗病毒性肝炎或在增进免疫系统反应性方面的作用机理尚未完全查明。在多个不同的活体外试验，它促使致有丝分裂原激活后的外周血淋巴细胞的T细胞成熟作用，增加T细胞在各种抗原或有丝分裂原激活后产生各种淋巴因子例如α，γ干扰素，白介素-2和白介素-3的分泌和增加T细胞上的淋巴因子受体的水平。它同时通过对T4(帮助者/诱导者)细胞的激活作用来增强异体和自体的人类混合的淋巴细胞反应。胸腺素α原可能影响NK前体细胞的募集，前体细胞在暴露于干扰素后变得更有细胞毒性。在活体内，胸腺素α原能增强经刀豆球蛋白激活后的小鼠淋巴细胞增加分泌白介素-2和增加白介素-2受体的表达作用。
本发明运用重组DNA技术，采用分段合成技术再拼接形成胸腺素α原全基因，在不改变编码氨基酸的前提下，改变基因部分核苷酸，从而提高了产物的表达，且产物以可溶性形式存在于大肠杆菌胞浆内，产物活性高。下游纯化方式简便，收率高，达到临床用药的质量要求。本产品用于免疫缺陷性疾病、病毒性肝炎和癌症的治疗，能得到显著的疗效。
本发明用下述实例进行说明
实施例1、基因编码序列设计采用大肠杆菌偏爱密码子，并在5′端加入ATG起始密码子和EcoRI酶切位点，3′端引入BamHI酶切位点，全序列长352bp，分成12个片段合成，示意图如下P1P2 P3 P4 P5 P65′ 3′3′ 5′N6N5 N4N3 N2 N1CGGAATTCATGTCTGATGCAGCTGTAGATACTAGCTCTGAAATCACTACTAAGGACTTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTGGAAAGAGCAGAAAATGGTAGAGACGCTCCTGCTAACGGTAATGCTGAGAATGAGGAAAACGGTGAGCAGGAGGCTGACAATGAGGTAGACGAAGAAGAGGAAGAAGGTGGTGAGGAAGAGGAGGAGGAAGAAGAAGGTGATGGTGAGGAAGAGGATGGTGATGAAGATGAGGAAGCTGAGTCTGCTACTGGTAAGCGTGCAGCTGAAGATGATGAGGATGACGATGTCGATACTAAGAAGCAGAAGACTGACGAGGATGACTGAGGATCCGCP1CGG AAT TCA TGT CTG ATG CAG ATG TAG ATA CT32metP2AGC TCT GAA ATC ACT ACT AAG GAC TTA AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTG GAAGAG GCA GAA AAT G63merP3GTA GAG ACG CTC CTG CTA ACG GTA ATG CTG AGA ATG AGG AAA ACG GTG AGCAGG AGG CTG ACA A64merP4TGA GGT AGA CGA AGA AGA GGA AGA AGG TGG TGA GGA AGA GGA GGA GGA AGAAGA AGG TGA TGG T64merP5GAG GAA GAG GAT GGT GAT GAA GAT GAG GAA GCT GAG TCT GCT ACT GGT AAGCGT GCA GCT GAA G64merP6ATG ATG AGG ATG ACG ATG TCG ATA CTG AGA AGC AGA AGA CTG ACG AGG ATGACT GAG GAT CCG C64merN1G CGG ATC CTC AGT CAT CCT CGT CAG TCT TCT G32merN2CT TCT TAG TAT CGA CAT CGT CAT CCT CAT CAT CTT CAG CTG CAC GCT TACCAG TAG CAG ACT CA64merN3G CTT CCT CAT CTT CAT CAC CAT CCT CTT CCT CAC CAT CAC CTT CTT CTT CCTCCT CCT CTT CT64merN4CAC CAC CTT CTT CCT CTT CTT CGT CTA CCT CAT TGT CAG CCT CCT GCT CACCGT TTT CCT CAT T64merN5CT CAG CAT TAC CGT TAG CAG GAG CGT CTC TAC CAT TTT CTG CCT CTT CCACAA CTT CCT TCT TC64mcrN6T CCT TTA AGT CCT TAG TAG TGA TTT CAG GGC TAG TAT CTA CAG CTG CAT CAGACA TGA ATT CCG64mer
实施例2、全长片段的克隆、测序鉴定1)5′端磷酸化将合成的12个片段用水溶解各取50pmol，40微升反应体积，用T4多核苷酸激酶将ATP的γ-磷酸基转移到各片段的5′端，具体反应条件为37℃，60min。然后70℃，5min灭活。
2)退火连接上述反应产物，95℃，5min，于保温杯中缓慢降温(过夜)。次日加T4 DNA连接酶，12℃过夜(12h以上)。
3)PCR扩增以连接产物为模板，N1，P1为引物，63℃退火，72℃延伸40s，30个循环。
4)回收PCR产物，双酶切后与同样酶切的质粒pUC19连接，转化到DH5α受体菌，蓝白斑筛选获得阳性转化子，挑选10个转化子测序。
5)测序结果表明，上述10个转化子克隆只有一个序列与设计序列完全一致(测得的核苷酸序列及相应的氨基酸序列见表1)。
实施例3、表达载体的构建从pUC19/Thα酶切获得目的基因片段，回收后连接已双酶切的pBV220表达载体，转化后用PCR方法筛选阳性克隆，且酶切正确。含有以上表达质粒(pThα)的DH5α工程菌经扩增培养、温度诱导，在12kd左右多出一条蛋白条带。
实施例4、人胸腺素α原的发酵生产工程菌30℃过夜培养后，按5％比例接种于2YT培养基中，30℃培养到OD600为2.0时，将温度升至42℃，此时胸腺素α原即诱导产生，4h后收集菌体。在表达的不同时机加氮源、碳源等营养素。最终发酵产物密度可达OD600为25，生物量为每升培养物30-35g。电泳鉴定胸腺素α原表达水平，薄层扫描显示胸腺素α原占菌体总蛋白的20-25％之间。
实施例5、工程菌的保存及稳定性工程菌加30％甘油，-20℃保存。短期保存菌种可用琼脂LB平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行酶切鉴定，结果三者相同。同时三个菌扩增培养物的产物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例6、胸腺素α原的分离纯化人胸腺素o原在菌体内以可溶性形式存在于菌体胞浆内，菌体破碎后离心回收上清，上清80℃作用5min离心收集上清，产物得到初步纯化。上清再经DEAE-Sepharose柱层析可以得到电泳纯的胸腺素α原。最后用Sephacryl S-100精制得到12kd的胸腺素α原。
实施例7、胸腺素α原产物的鉴定
SDS-PAGE和HPLC检定纯度均在98％以上，玫瑰花结实验表明其具有明显的生物活性。N末端蛋白质序列分析与体内天然蛋白相同，顺序是Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu。
实施例8、无菌过滤、分装、冻干根据蛋白含量和活性，按以下比例加辅料和稳定剂重组人胸腺素α原每支含0.75、1.5和3.0mg，缓冲体系为10mM PB，pH6.8，5％甘露醇，以上辅料必须符合注射用药的要求。
无菌过滤在环境洁净度达到100级的条件下，用0.22μM微孔滤膜过滤，分装、冻干、封口、贴签、装箱。保存于2～8℃的冷藏环境中。1 CG GAA TTC ATG TCT GAT GCA GCT GTA GAT ACT AGC TCT GAA ATC ACT ACT AAG GAC TTA2 Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Set Set Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu101 AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAT GGT AGA GAC GCT CCT GCT AAC GGT2 Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala Pro Ala Asn Gly20 30AAT GCT GAG AAT GAG GAA AAC GGT GAG CAG GAG GCT GAC AAT GAG GTA GAC GAA GAA GAGAsn Ala Glu Asn Glu Glu Asn Gly Glu Glu Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu40 501 GAA GAA GGT GGT GAG GAA GAG GAG GAG GAA GAA GAA GGT GAT GGT GAG GAA GAG GAT GGT2 Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly60 701 GAT GAA GAT GAG GAA GCT GAG TCT GCT ACT GGT AAG CGT GCA GCT GAA GAT GAT GAG GAT2 Asp Glu Asp Glu Glu Ala Glu Set Ala Thr Gly Lys Arg Ala ala Glu Asp Asp Glu Asp80 901 GAC GAT GTC GAT ACT AAG AAG CAG AAG ACT GAC GAG GAT GAC TGA GGA TCC GC2 Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp100 110表1.胸腺素α原cDNA及氨基酸序列(1.核苷酸序列2.氨基酸序列＿代表根据密码子的兼并性、改动之处)
权利要求
1.一种制备人胸腺素α原的方法，包括(1)合成富含A、T的全基因；(2)将(1)得到的基因克隆到表达载体中；(3)用所述的表达载体转化原核细胞得到工程菌；(4)通过发酵技术扩增工程菌，得到人胸腺素α原的高水平表达。
2.根据权利要求1的方法，得到表1所示的序列。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的表达载体选用pBV200，原核细胞为大肠杆菌DH5α和HB101。
4.根据权利要求1方法制备的胸腺素α原。
5.权利要求4的胸腺素α原在人类免疫缺陷性疾病、病毒性肝炎和癌症治疗方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组人胸腺素α原(Pro Tα)的制备方法。本发明利用遗传密码的兼并性,设计了大肠杆菌偏爱的密码子,降低了DNA序列中的GC含量,合成了Pro Tα的DNA序列。将PCR扩增的人Pro Tα基因与原核表达载体如pBV220组装成高效表达质粒,转化大肠杆菌后用温度诱导Pro Tα基因表达,表达量达到菌体总蛋白的20－25%。工程菌经发酵扩增,破碎后保留上清。上清经热处理后,进行阴离子交换层析和凝胶排阻层析二步法纯化产品。纯品加保护剂后制成药用冻干制剂。该制剂可用于人类免疫缺陷性疾病、病毒性肝炎和癌症的治疗。
文档编号A61P35/00GK1326947SQ0010795
公开日2001年12月19日 申请日期2000年6月1日 优先权日2000年6月1日
发明者徐明波, 王勇波, 黄向东, 赵冰, 卢安京 申请人:北京双鹭药业有限责任公司