一种检测线粒体dna a1555g突变的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学检测领域，具体的本发明提供了一种检测线粒体DNAA1555G突变的试剂盒，此外本发明还提供了该试剂盒在预测美尼尔氏病发病可能性中的应用。
【背景技术】
[0002]美尼尔氏病，又称眩晕症、内耳眩晕症、膜迷路积水，是一种常见病、多发病。本病症状的出现是由内耳膜迷路内积水膨胀，压迫内耳终器所致。有如下4个症状:眩晕、耳聋、耳鸣及耳内闷胀感。其中眩晕多为突然发作的旋转性眩晕。患者常感周围物体围绕自身沿一定的方向旋转，闭目时症状可减轻。常伴恶心、呕吐、面色苍白、出冷汗、血压下降等自主神经反射症状。头部的任何运动都可以使眩晕加重。患者意识始终清楚，个别患者即使突然摔倒，也保持着清醒状态。眩晕持续时间多为数10分钟或数小时，最长者不超过24小时。眩晕发作后可转入间歇期，症状消失，间歇期长短因人而异，数日到数年不等。眩晕可反复发作，同一患者每次发作的持续时间和严重程度不尽相同，不同患者之间亦不相同。且眩晕发作次数越多，每次发作持续时间越长，间歇期越短。
[0003]据报道，约20%的美尼尔氏病患者有家族史，该疾病很可能是一种基因与环境共同作用所致的疾病，目前已研究的致病基因主要包括凝血因子C同源物基因(C0CH)、人白细胞抗原基因(HLA)、水通道蛋白基因(AQP)和钾离子通道基因(KCNE)。
【发明内容】
[0004]发明人通过分析大量临床样本，发现线粒体DNA A1555G突变与美尼尔氏病显著相关。该发现提供了一种预测美尼尔氏病发病可能性的新方法，为美尼尔氏病的早期诊断、预防提供了新的思路。
[0005]—方面，本发明提供了一种检测线粒体DNA A1555G突变的试剂盒，其包含一对引物:
弓I 物 1:acgcattaatttagagaagg，
引物 2:tgggattttttaggtagtgg0
[0006]另一方面，本发明提供了该试剂盒在在预测美尼尔氏病发病可能性中的应用。
[0007]进一步的方法，应用包括使用试剂盒中的引物扩增待测对象基因组DNA样品后电泳检测，如果得到702bp片段，则表明样品主体有A1555G突变，进而有较高的美尼尔氏病发病可能性。
[0008]再另一个方面，本发明提供了引物对在制备预测美尼尔氏病发病可能性的试剂盒中的应用，其中引物对序列为:
弓I 物 1:acgcattaatttagagaagg，
引物 2:tgggattttttaggtagtgg0
[0009]
【具体实施方式】
[0010]1引物设计与合成
使用引物设计软件Primer Premier 6.0，根据Genbank中的人线粒体DNA序列设计检测A1555G突变的引物对:
弓I 物 1:acgcattaatttagagaagg，
引物 2:tgggattttttaggtagtgg0
[0011]设计的引物对由上海英骏公司合成。
[0012]2具体检测过程样品处理:
取这待测者的血滤纸片，将血滤纸片剪碎纸片放入1.5ml Eppendorf管，加入900 μ 1红细胞裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl, pH 7.6)室温静置lOmin，充分裂解红细胞，12000rpm离心lmin，收集白细胞沉淀；在装有白细胞沉淀的1.5mlEP管中加入600 μ 1的细胞裂解液(10mmol/L Tris-Cl、lmmol/L EDTA、0.1% SDS，pH 8.0)和3“1 的蛋白酶溶液(20mg/ml蛋白酶K)，充分混匀，55°C恒温消化裂解2?3h ;待消化液降至室温，加入200 μ 1预冷5mol/L醋酸钾溶液，充分混匀，12000rpm_4°C离心15min ;取约700 μ 1上清加入600 μ 1异丙醇于一新的1.5ml Eppendorf管中，充分混勾，-20°C冰浴30min后，12000rpm离心lOmin收集DNA沉淀；加入600 μ 1乙醇洗涤DNA沉淀，12000rpm离心5min，弃上清，待乙醇挥发干燥后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后-20°C保存备用。
[0013]PCR 过程:
PCR 反应体系为 lOxPCR 缓冲液 4μ UdNTP (2.5mM) 2.5 μ UMgCl2 (25mM) 2.5 μ 1、引物 1 (5μΜ) 0.5μ1、引物 2 (5 4]\00.5“1、丁&1酶(51]/^1) 0.5 μ 1、模板 DNA 50ng、双蒸水补充至25 μ 1。
[0014]PCR反应过程为94°C预变性5min ;94°C变性30s，63°C退火30s，72°C延伸30s，循环7次；94°C变性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，重复循环30次；72°C延伸5min。
[0015]电泳方法为PCR产物10 μ 1在2%的琼脂糖凝胶中电泳，经ΕΒ染色后在紫外线检测仪上观察并照相记录结果。
[0016]结果判读方法为如果得到702bp片段，则表明样品主体有A1555G突变；如果未发现702bp片段，则表明样品主体没有A1555G突变。
[0017]3引物特异性验证
选取下面第4部分中的阴性样本(无A1555G突变)10例，阳性样本6例(有A1555G突变)进行了线粒体DNA 12S rRNA直接测序分析，结果与使用本发明引物PCR检测结果完全相同，证明了本发明的引物对具备良好的特异性和准确性。
[0018]4美尼尔氏病与A1555G突变的关联分析
选取临床中发现的一个中国北方美尼尔氏病家系中的9位患者(分布在2代中)和4位非患者，以及100名无血缘关系的正常对照，按照【具体实施方式】第2部分的方法进行检测。
[0019]家系中所有9位患者里均发现了 A1555G突变；家系中4位非患者里均无A1555G突变；100名无血缘关系的正常对照中1位有A1555G突变，99位无A1555G突变。
[0020]结果初步表明了 A1555G突变与美尼尔氏病之间存在一定关联性。
【主权项】
1.一种检测线粒体DNA C1494T突变的试剂盒，其包含一对引物:弓I 物 1:acgcattaatttagagaagg，引物 2:tgggattttttaggtagtgg02.权利要求1的试剂盒在预测美尼尔氏病发病可能性中的应用。3.权利要求2的应用，该应用包括使用试剂盒中的引物扩增待测对象基因组DNA样品后电泳检测，如果得到702bp片段，则表明样品主体有C1494T突变，进而有较高的美尼尔氏病发病可能性。4.引物对在制备预测美尼尔氏病发病可能性的试剂盒中的应用，其中引物对序列为:引物 1:tacgaaagtggctttaacata，引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD
【专利摘要】本发明公开了一种检测线粒体DNA？A1555G突变的试剂盒，其包含一对引物，引物1：acgcattaatttagagaagg，引物2：tgggattttttaggtagtgg。此外，本发明还提供了该试剂盒在预测美尼尔氏病发病可能性中的应用。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105296607
【申请号】CN201510473347
【发明人】于刚, 菅慧蓉, 陈刚, 李赟, 张天阳, 代小燕, 王国涛
【申请人】于刚
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年8月5日