专利名称：线粒体全基因组dna扩增、引物、测序及突变检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学，特别是涉及可用于线粒体全基因组DNA扩增的引物对组、试剂盒、扩增方法、测序方法以及线粒体DNA突变检测方法。
背景技术：
线粒体基因组(mitochondrial DNA, mtDNA)呈闭合双链环状结构，长度为16569bp，分为编码区和非编码区。编码区共37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸(tRNA)、2个编码核糖体核糖核酸(12S和16S rRNA)，13个编码多肽。mtDNA基因排列紧密，序列间没有内含子。mtDNA的分子结构特点决定其具有以下独特的遗传特性:
(1)高拷贝数，一般来说，人类体细胞的细胞核内仅有两个染色体DNA拷贝，而大多数细胞质内却有1000至数千个mtDNA拷贝；(2)表现为严格的母性遗传特点，mtDNA随母本的卵细胞传递给后代；(3)具有较高的突变率，大量研究显示mtDNA突变频率较核基因组高10倍以上；(4)异质性，突变的mtDNA与野生型的mtDNA以不同比例共存于一个细胞质内。由于mtDNA的高突变率和mtDNA的高度进化保守性，多数mtDNA新突变都为有害突变，并且mtDNA突变导致的临床表型极为广泛，几乎涉及到所有的组织和器官，许多病人并不出现典型症状，给临床诊断带来了极大的困难，很多线粒体疾病无法得到确诊。故线粒体基因组的准确检测具有重要的临床指导意义。目前临床上对于mtDNA的检测，还仅集中在对少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，如对线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS)常见突变A3243G的筛查，阳性检出率低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。此外，这些位点的选择都是基于其他人种(主要是白种人)的实验数据，中国人的基因突变位点与欧洲人的突变位点在规律上有很大的区别。目前最常用的mtDNA的检测方法是应用聚合酶链式反应(PCR)扩增出目的DNA片段，然后采用荧光标记序列分析仪(如3730DNA序列分析仪)对扩增产物直接进行测序。由于荧光标记序列分析仪对测序片段长度的限制，需要用26对甚至更多对引物对线粒体基因组进行多重PCR，将其分割成26段甚至更多片段来进行测序，操作过于繁琐，并且无法检测拷贝数很低的变异。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的:扩增线粒体基因组，可通过设计最少2对PCR引物来完成，但是，引物对数目少对DNA模板的质量要求高，基因组模板不能有过多降解，并且对Taq酶的要求也更高，需要能扩增出IOkb长片段的Taq酶进行PCR，扩增片段太长同时也会增加碱基的错配率，降低检测的准确性。而设计更多对的引物来扩增线粒体基因组，如26对、43对，PCR和后续的纯化操作繁琐，PCR产物片段短，适用于线粒体基因选择部分区域做sanger测序。选用引物对数量适中，如本发明方案的8对，其优势在于，对模板的要求低，PCR产物错配率低，检测准确性高，更适用于后续的高通量测序平台。本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种可用于线粒体全基因序列扩增的引物对组。本发明的另一目的在于提供一种线粒体全基因组DNA扩增方法。本发明的再一目地在于提供一种线粒体全基因组的测序方法。本发明的还一目的在于提供一种线粒体DNA的突变检测方法。本发明的再一目的在于提供一种可用于线粒体全基因组DNA扩增的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:本发明公开了用于扩增线粒体全基因组序列的引物对组，所述引物对组包括以下a-h中的至少一对引物，优选含有A-H中的所有八对引物，a、seq ID N0.1:5，-CACTCCCATACTACTAATCTC-3，，seq ID N0.2:5，-TAGCATGTACTGCTCGGAGGT-3J，b、seq ID N0.3:5’ -GTCCTAAACTACCAAACCTGC-3J，seq ID N0.4:5，-GTGTTAGTCATGTTAGCTTG-3，，c、seq ID N0.5:5，-ATCTCTCCCTCACTAAACGTAAG-3，，seq ID N0.6:5，-ATGAGGGCGTGATCATGAAAGGT-3J，d、seq ID N0.7:5，-GCATACACCACATGAAACATC-3J，seq ID N0.8:5，-ATGCCGTCGGAAATGGTGAAG-3J，e、seq ID N0.9:5，-TCCCACTCCTAAACACATCC-3J，seq ID N0.10:5，-AAACCCGGTAATGATGTCGG-3J，f、seq ID N0.11:5，-GCCCACGGGCTTACATC-3’，seq ID N0.12:5，-GATTGTTAGCGGTGTGGTCG-3J，g、seq ID N0.13:5，-GCCTTCTTACGAGCCAAAACC-3，，seq ID N0.14:5，-TCCAGCGTCTCGCAATGCTAT-3J，h、seq ID N0.15:5，-TTCGCCTACACAATTCTCCG-3J，seq ID N0.16:5，-TTTATGGGGTGATGTGAGCC-3，。本发明还公开了一种线粒体全基因组DNA扩增方法，所述方法包括，采用上述的引物对组，以线粒体DNA为模板，进行PCR扩增。所述PCR扩增时，各引物对的退火温度为52_56°C，优选为56°C。本发明进一步公开了一种线粒体全基因组测序方法，所述方法包括，采用上述的方法扩增得到线粒体全基因组DNA，构建测序文库，采用高通量测序平台进行全基因组测序。所述高通量测序平台选自Illumina solexa/Hiseq、ABI SOLiD、Roche454 和单分子测序装置之一；在本 发明一个优选的实施方式中，所述高通量测序平台为IlluminaMiseq测序仪。具体地，所述测序方法包括，将PCR扩增得到的产物分别纯化并混合后，制备DNAPaired-End PCR Free 文库，插入片段为 10(Tl000bp，优选为 400 600bp，更优选 500bp，制备好的文库质检合格后在Miseq测序仪上直接测序检测，读长150bp。
在本发明一个具体的实施方式中，制备DNA Paired-End PCR Free文库具体包括1、将PCR产物打断，使打断后DNA主带大小集中在插入片段大小，回收所需大小的目的片段；i1、将步骤i的产物进行末端修复；ii1、将步骤i i的产物进行3 ’端加A碱基；iv、将步骤iii的产物片段加上测序接头；V、选择并回收目的DNA片段，获得所述DNA文库；任选地，所述目的片段为10(Tl000bp，优选为400 600bp，更优为500bp。构建好的文库优选 进一步进行文库质量检测，可以使用例如Agilent2100Bioanalyzer和ABI StepOnerPlus Real-Time PCR System进行质量和产量的检测。本发明还公开了一种线粒体DNA的突变检测方法，所述方法包括，采用上述的方法进行线粒体全基因组测序，获得线粒体全基因组DNA序列，将测序结果与线粒体参考序列比对。所述线粒体参考序列优选为修正后的剑桥参考序列NC_012920.1。本发明还公开了一种试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物对组。所述试剂盒用于线粒体全基因组DNA扩增。由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于:本发明利用给定的引物直接扩增结合直接测序的方法，能够得到线粒体全基因组序列，可以一次性检测线粒体基因的全部突变，能够应用于大多数线粒体基因突变引起的疾病的检测。其中Miseq测序仪是在单个仪器上整合了扩增、测序和数据分析的新一代测序仪，在简单、快速、灵活和低成本方面占据优势，特别适用于线粒体基因组测序。本发明可应用于辅助线粒体疾病临床诊断，发病机理的研究，遗传学研究以及不同人群单倍型分型。
图1为本发明线粒体基因PCR产物电泳图。注:1:引物a PCR产物；2:引物b PCR产物；3:引物c PCR产物；4:引物d PCR产物；5:引物e PCR产物；6:引物f PCR产物；7:引物g PCR产物；8:引物h PCR产物；M:DNAMarker III图2为本发明测序文库制备流程图。图3为本发明实施例的检测样本3243位点的reads图。
具体实施例方式临床上重要的变异散布于mtDNA基因组中，而mtDNA全基因组很难被扩增。本发明开发出一种用8对引物多重PCR扩增出mtDNA全基因组的测序系统，以解决上述问题。本发明合成了能够扩增出线粒体全基因组碱基的8对高特异性PCR引物。本发明所涉及的这8对PCR引物经实验证明，能够对线粒体全基因组进行特异性扩增，并通过直接测序的方法得到真实可靠的线粒体全基因组序列资料。本发明提供了的线粒体测序用8对PCR引物，覆盖了线粒体基因组全长，以下表I列出了该8对PCR引物序列。表I PCR引物序列
权利要求
1.用于扩增线粒体全基因组序列的引物对组，其特征在于:所述引物对组包括以下A-H中的至少一对引物，优选含有A-H中的所有八对引物，
2.一种线粒体全基因组DNA扩增方法，所述方法包括，采用权利要求1所述的引物对组，以线粒体DNA为模板，进行PCR扩增。
3.根据权利要求2所述的线粒体全基因组DNA扩增方法，其特征在于:所述PCR扩增时，各引物对的退火温度为52-56°C，优选为56°C。
4.一种线粒体全基因组测序方法，所述方法包括，采用权利要求2或3所述的方法扩增得到线粒体全基因组DNA，构建测序文库，采用高通量测序平台进行全基因组测序。
5.根据权利要求4所述的线粒体全基因组测序方法，其特征在于:所述高通量测序平台为Miseq测序仪。
6.根据权利要求5所述的线粒体全基因组测序方法，其特征在于:所述测序方法包括，将PCR扩增得到的产物分别纯化并混合后，制备DNAPaired-End PCR Free文库，制备好的文库质检合格后在Miseq测序仪上直接测序检测。
7.根据权利要求6所述的测序方法,其特征在于:所述制备DNAPaired-EndPCR Free文库具体包括， 1、将所述PCR产物打断，使打断后DNA主带集中在目的片段大小范围； i1、将步骤i的产物进行末端修复； ii1、将步骤ii的产物进行3’端加A碱基； iv、将步骤iii的产物片段加上测序接头； V、选择并回收目的DNA片段，获得所述DNA文库； 任选地，所述目的片段为100 lOOObp，优选为400 600bp，更优为500bp。
8.—种线粒体DNA的突变检测方法，所述方法包括，采用权利要求4-6任意一项所述的方法进行线粒体全基因组测序，获得线粒体全基因组DNA序列，将测序结果与线粒体参考序列比对。
9.根据权利要求8所述的突变检测方法，其特征在于:所述线粒体参考序列为修正后的剑桥参考序列NC_012920.1 ο
10.一种试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对组。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒用于线粒体全基因组DNA扩增。
全文摘要
本发明公开了一种用于线粒体全基因组扩增的引物对组、试剂盒。还公开了线粒体全基因组DNA的扩增方法、测序方法及突变检测方法。本发明利用给定的引物直接扩增结合直接测序的方法，能够得到线粒体全基因组序列，可以一次性检测线粒体基因的全部突变，能够应用于大多数线粒体基因突变引起的疾病的检测。
文档编号C12Q1/68GK103173441SQ201310046250
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者费凌娜, 尉姗姗, 高景红, 叶李莉, 田玉娇, 易鑫 申请人:深圳华大基因研究院