一种用于人单个细胞基因组或线粒体dna pcr扩增的内参系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统，包含一对与细胞核重复核苷酸片段匹配的特异性引物和探针，其引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，探针序列如SEQ ID No.3。该内参系统可用于单细胞扩增的质控及线粒体基因等相对拷贝数计算等。该系统的基本形式是基因组DNA PCR以及TaqMan荧光定量PCR法，其内参是基于细胞核重复核苷酸序列设定的，适用于单细胞，亚细胞模板量的DNA PCR扩增内参，对稀有样品特别适用，从而使得单细胞拷贝数等数据呈现出真正的可靠性与价值。该系统可用于单细胞基础研究，及临床样品检测。
【专利说明】-种用于人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参 系统
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可用于人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统，属 于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 单细胞基因扩增开始于上世纪90年代。目前，单细胞PCR扩增在辅助生殖，肿瘤 等领域使用非常广泛，体外受精卵细胞功能检测，循环肿瘤细胞遗传检测，这些都是单细胞 基因扩增检测的典型例子。随着高通量测序技术在研发与临床应用的逐步开展，单细胞基 因组扩增检测应用越来越广泛。
[0003] 但是在常规的实验中，我们发现单个细胞DNA检测常常会出现细胞没有挑到，细 胞全部或部分丢失，裂解不完全等现象，这就使得内参非常重要，否则，其扩增出的产物，测 出的基因绝对拷贝数等的代表性及意义就非常有限。
[0004] 只有两个拷贝，只局限于一个染色体的小区域的其它内参类型（如Actin， tubulin等），尽管在多细胞水平可以作为内参，在单细胞水平则不适合做内参，因为其无 法反映一个细胞其它区域的残缺。在做单细胞反转录RT-PCR时，因为同一种RNA可以有很 多拷贝，所以，其它类型的内参也可以做单细胞RT-PCR的内参，但不适合于单细胞基因组 或线粒体DNA扩增的内参。
[0005] 线粒体是细胞的重要炼油厂，能量来源。胎儿的线粒体基本从母亲卵细胞获得。卵 细胞线粒体功能直接影响早期受精卵的分裂，生长，胚胎的发育等。一些卵细胞线粒体异常 的妇女，体外辅助生殖成功率低，而将受精卵细胞核移到去核的正常卵细胞的胞浆中则能 纠正卵细胞线粒体的遗传缺陷，这是解决线粒体病，线粒体严重缺失的重要方法。
【发明内容】
[0006] 申请人:发明了一种用于人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统。
[0007] 由于所针对的是单个细胞检测，因此在传统的检测中常常会出现细胞没有挑到， 细胞全部或部分丢失，裂解不完全等现象，这就使得内参非常重要，否则，其扩增出的产物， 测出的基因绝对拷贝数等的代表性及意义就非常有限。一般的基因在单个细胞内只有两个 拷贝，且只局限于一条染色体的一个非常小的区域，不适用于做单细胞或亚细胞DNA扩增 内参。由于重复核苷酸序列在一个细胞核里面有几十万到百万拷贝，总量可达基因组顺序 的10 %，而且在每个染色体都有广泛分布。由于其拷贝数大且比较稳定，因此本发明选择了 细胞核重复核苷酸序列作为单细胞DNA扩增的内参从而用于人单细胞DNA PCR扩增质量控 制，线粒体等基因扩增相对拷贝数计算等。
[0008] 有些单个细胞来源非常有限，如人卵细胞，而一个细胞常常又需要做很多不同的 检测或研究，以及实验的重复，这使得能用于做单个检测的遗传物质远远低于一个细胞的 遗传物质总量。我们的内参系统非常适合于这种亚细胞水平下的检测。
[0009] 本发明的内参系统是以单细胞基因组扩增PCR或TaqMan荧光定量PCR为基本形 式，以细胞核重复核苷酸片段为内参。内参引物与目标引物同存在与一个反应体系中，分别 同时扩增目标基因与内参片段。在TaqMan PCR扩增中，探针的存在增加了反应信号的特异 性。反应体系中还包括单细胞裂解物（扩增模板），DNA聚合酶，扩增底物，及反应缓冲液。 [0010] 在本发明的内参系统中，包含一对与细胞核重复核苷酸片段匹配的特异性引物和 探针，其引物序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,探针序列如SEQ ID No. 3。
[0011] 如本领域技术人员所知，上述的序列并非是绝对的，还可以采用与上述序列具有 较高同源度的序列，所述较高同源度是指上述序列的两端变换或加减5-10个核苷酸碱基， 或中间顺序碱基有5-10个被替代，或两者都有。
[0012] 本发明的内参系统可以用于单细胞扩增试剂盒，该试剂盒可用于内参用于检测人 单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控，验证待测样品有无收集 到单个细胞，如有，单个细胞的遗传物质是否完整，如部分丢失，或细胞裂解不完全。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为不同人细胞扩增模板量内参扩增线性图（0. 1-10个Hela细胞）。
[0014] 图2为单个人卵细胞线粒体及内参qPCR扩增图（上部为线粒体基因扩增，下部为 内参基因扩增。实际模板用量0.05个卵细胞）。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1 :不同人细胞扩增模板量内参扩增线性关系
[0016] 取生长正常的人Hela细胞50个，裂解在IOul细胞裂解液中（细胞裂解液由Tris 缓冲液，加 SDS及蛋白酶K组成），充分裂解后（50°C 50分钟，80°C 10分钟），用细胞裂解液 稀释成每2ul含0. 1，0. 3，1，3,9个细胞，作为模板，做TaqMan qPCR扩增内参。扩增后，计 算各反应组Ct值。每组两个重复。
[0017] 实验结果如下表1和附图1所示。
[0018] 表1 :不同人细胞扩增模板量对应的Ct
[0019]
【权利要求】
1. 一种用于人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统，包含一对与细胞核 重复核苷酸片段匹配的特异性引物和探针，其引物序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,探 针序列如SEQ ID No. 3。
2. 根据权利要求1所述的内参系统，其特征在于引物或探针顺序为与上述序列具有较 高同源度的序列，所述较高同源度是指上述序列的两端变换或加减5-10个核苷酸碱基，或 中间顺序碱基有5-10个被替代，或两者都有。
3. 根据权利要求1或2所述的内参系统，其特征在于内参用于检测人单个细胞线粒 体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控，验证待测样品有无收集到单个细胞，如 有，单个细胞的遗传物质是否完整，如部分丢失，或细胞裂解不完全。
4. 根据权利要求1，2, 3任一所述的内参系统，其特征在于基于这个基本方法研发成的 检测试剂盒，用于实验室研究，或临床样品检测。
【文档编号】C12N15/11GK104372002SQ201410558839
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】朱克卿, 朱霞, 胡月, 陆思嘉, 王春香 申请人:江苏亿康基因科技有限公司