植物质体分裂基因的制作方法

专利名称：植物质体分裂基因的制作方法
本申请要求了临时续展专利申请No.60/020,959(1996年6月28日提交)的优先权。
不适用于关于联邦政府赞助的研究或开发的声明。
背景技术：
农产业已经为多种表型、经济价值高的植物开发提供了可观的资源。粮食作物的有利特点包括活力高、能抗病、高产量、保存时间长以及营养成分高。
高产量粮食作物的开发尤为重要。每年，由于越来越多的土地用于其它用途，因此用于农业生产的可耕地越来越少。而与此同时，人口却迅速增加。因此，必须要增加农业产量来满足全球不断增长人口的营养需求。
现在已经致力于防治害虫、或选择和培育果实数更多、果实更大的变种来开发高产量作物植物。致力这些作物培育是非常耗时，而且劳动强度大，但是从历史上看能随时间增加作物产量。现代的重组DNA调控和基因工程技术为更迅速地生产具有新性状的植物新品种提供了广阔前景。
植物中的光合作用是非常重要的生物合成过程，几乎所有活生物的生存都依赖于光合作用。光合作用在植物细胞的叶绿体中发生。在光合作用中，光能被转化成ATP，而ATP为一系列催化糖类合成的酶反应提供能量。氧分子是光合作用的必要的副产物。由于光合作用是植物中新陈代谢能量的来源，因此光合作用效率与通常植物的生长和活力密切相关。
已经知道，光合作用活性与叶绿体的数量成正比(Leech和Baker,＂Thedevelopment of photosynthetic capacity in leaves＂,J.E.Dale和F.L.Milthorpe(eds),The Growth and Functioning of Leaves.Cambridge University Press,Cambridge.pp271-307,1983)。尽管叶绿体的光合作用功能在生命中处于关键地位，但是关于叶绿体数量和大小的调节方式还知之甚少。
叶绿体也是植物细胞中为CRO植物提供营养成分的众多重要的生化过程的部位。氨基酸和脂质也在叶绿体中合成。质体也是一些重要的次级代谢物和维生素的合成部位。
本领域所需的是一种调控农学和园艺学上重要的植物中的叶绿体数目和大小的方法，以获得更高的植物产量和营养质量。
发明概述本发明涉及一种植物，该植物的基因组中包含一种基因构建物，该构建物包含质体分裂序列和与该基因非固有的、启动该基因在植物中表达的启动子，其中基因在植物中的表达使植物的植物细胞中质体的数目和大小发生改变。
本发明也涉及两个DNA序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3)，它们表示起调节质体分裂作用的一类基因，当它们异位表达时，它们能改变叶绿体以及植物细胞中存在的其它类型质体的数目和大小。
本发明涉及一种基因构建物，该构建物包含质体分裂序列和启动该序列在植物中表达的启动子，其中启动子并不天然地与该质体分裂序列相关。
本发明还涉及一种种子，种子的基因组中包含一种基因构建物，该构建物包含质体分裂序列和与质体分裂序列非固有的、启动该基因在植物中表达的启动子。
本发明还涉及一种植物细胞，该植物细胞的基因组中包含一种基因构建物，该构建物包含质体分裂序列和与质体分裂序列非固有的、启动该基因在植物中表达的启动子。
本发明的目的是提供具有有用性质(包括叶绿体数目增加)的新表型的转基因植物。
本发明的其它目的、优点和特征可在审查了说明书和附图后明显得出。
附图的几个视图的简述

图1示出了FtsZ基因的序列对比描述。
图2示出了下文实施例的质粒组建过程。
图3示出了下文实施例的另一质粒组建过程。
图4示出了下列实施例的另一质粒组建过程。
发明详述本发明的一个方面是一种植物，该植物的基因组中包含一种基因构建物，该构建物包含植物质体分裂基因序列和与质体分裂基因非固有的、启动该基因在植物中表达的启动子。该基因的转基因表达产生了高百分比的新表型，该表型的特征是构建物在其中表达的植物细胞中质体的数目和大小发生改变。
质体是植物细胞存活必需的膜层状的细胞器。光合作用发生在特异性质体即叶绿体中。质体是必需氨基酸、维生素E、前维生素A、淀粉、某些生长激素、脂质以及诸如胡萝卜素、叶黄素和叶绿素等色素合成的部位。由于质体是植物细胞存活所必需的，因此质体分裂的调节起着关键作用。为了保证每个新分裂的细胞均含有存活所必需的质体，因此质体必须在细胞循环时复制并在细胞分裂时分配。
根据种类，叶子中每个细胞的叶绿体数目从原始叶中小于15个原生质体增加到成熟的具有光合作用能力的叶肉细胞中大于150个叶绿体。现已在单子叶植物和双子叶植物中鉴定了叶绿体分裂的发育模式。在单子叶植物中，新形成的叶细胞从叶基的居间分生组织中长出，形成细胞带，从而在叶基到叶尖间形成线性的发育梯度。因此通过叶子特定部位的截面形成了处于相同发育阶段的一类细胞。小麦叶基分生组织中的叶生长在细胞分裂时发生，而在分生组织上方，细胞分裂停止，叶生长由细胞扩展来直接进行。分生组织细胞中每个细胞的叶绿体数目保持恒定，这表明在发育的这一阶段叶绿体的分裂与细胞分裂保持一致。叶绿体数目的增加主要在细胞扩展时发生(Leech和Pyke,＂Chloroplast divison in higherplants with particular reference to wheat.＂s.A.Boffey和D.Lloyd(eds)Division andSegregation of Organelles.Cambridge University Press,Cambridge,pp.39-62,1988)。
双子叶植物中的叶生长模式更为复杂，但是大致与单子叶植物中的相似，对于叶基处非常年轻的细胞来说，生长主要在分裂时发生，而叶基上方的成熟细胞则通过扩展来生长。如同在单子叶植物中的那样，对双子叶植物的切片结果证明，双子叶植物中叶基附近未成熟的分裂细胞中每个细胞的叶绿体数目变化很小，但是随着距叶基距离的增加，扩展细胞中的叶绿体数目增加。在趋向较老的叶子中叶绿体平均数目的增加也反映了叶绿体的分裂模式。例如，在菠菜中，长度为2cm的叶子中平均值小于20个叶绿体/细胞，而完全伸展的长10cm的叶子中平均大于150个叶绿体/细胞。(Lawrence等，Plant Physiol.91:708-710,1986)。总之，这些研究表明，随着叶子的成熟，每个细胞的叶绿体数目(叶绿体分裂数)有发育控制的增长。
植物拟南芥属叶绿体积累和复制突变株(Arabidopsis arc)(经过对EMS诱变和T-DNA诱变的植物种群显微检查鉴定)在叶绿体数目和大小上表现出与野生型有很大不同(Pyke等，Plant Physiol.104:201-207,1994,Pyke等，Plant Physiol99:1005-1008,1992)。现已鉴定了单位叶肉细胞面积的叶绿体数目减少或增加的突变株。令人惊奇的是，叶绿体积累和复制突变株的生长没有被损伤(Pyke等，PlantPhysiol.104:201-207,1994,Pyke等，Plant Phsiol.99:1005-1008,1992)，或在严重的突变株(arc6，与野生型中的83个相比，其每个细胞中平均只有两个叶绿体)中生长破坏不超过30％(Pyke等，Plant Physiol 106:1169-1177,1994；Pyke等，J.Cell Sci.108:2937-2944,1994)。在所有的arc突变株中，开花、致育和种子种质(seedset)均正常。
在测定arc突变株中叶绿体数目和大小间的关系时，测得叶绿体数目的改变被叶绿体大小的反比例改变所补偿，这样，突变株和野生型植物细胞中单位细胞体积的叶绿体体积相当(Pyke等，Plant Physiol.99:1005-1008,1992)。这些数据表明，质体分裂和质体伸展是遗传上不同的过程，它们靠协调叶绿体区室总体大小的反馈机理成为一体。同样，如下文实施例详细描述的那样，作为转基因插入的叶绿体分裂基因的表达导致了叶绿体数目改变，而数目改变也使叶绿体大小发生补偿性地改变。
改变叶绿体分裂基因表达的能力使得植物细胞中叶绿体大小和数目的调控变为可能。已经知道叶绿体数目对光合作用能力有直接影响(Leech和Baker,＂Thedevelopment of photosynthetic capacity in leaves＂,J.E.Dale和F.L.Milthorpe(eds),The Growth and Functioning of Leaves.Cambridge University Press,Cambridge.pp271-307,1983)。因此可以通过控制基因工程植物的质体分裂蛋白水平来使在植物生物合成过程中起关键作用的质体的数目或大小增加，获得有用的植株。作为本发明应用的一个实例，人们可以用本发明来开发出优质高产、在质体中合成的各化合物中一种或多种化合物的生产增强的农学和园艺学上重要的植物。
在下文实施例中描述了本发明中有用的两个拟南芥(Arabidopsis thaliana)质体分裂序列的鉴定和表征。这两个序列命名为cpFtsZ(cp表示叶绿体，SEQ IDNO:1)和AtFtsZ(At表示拟南芥，SEQID NO:3)，它们根据与细菌FtsZ基因(从几种原核物质的Fts(成丝状温度敏感)株中分离获得)的同源性来鉴定。细菌Fts突变株在参与细菌细胞分裂的基因中有温度敏感型突变；由于在细胞分裂时的不完全隔膜形成，这些突变株形成了细菌鞭毛。
细菌细胞分裂蛋白FtsZ是细菌细胞分裂机制中的主要组成。它在分裂开始时装配(assemble)入细胞动力学循环(cytokineticring)中，并在分裂完成后停止装配。由于FtsZ能在体外进行依赖于GTP的聚合反应，而且具有其它与微管蛋白相似的结构，因此假定FtsZ在细菌细胞分裂中起细胞骨架作用。如下文实施例所述，拟南芥属FtsZ蛋白含有一个富含甘氨酸的微管蛋白特征基序，该基序在FtsZ蛋白和微管蛋白间是保守的，对于GTP结合很重要，这表明该蛋白可能起着与微管蛋白相似的细胞骨架作用。
本文的“FtsZ”指拟南芥属cpFtsZ和AtFtsZ，以及来自其它植物的类似基因序列及其保留了质体分裂控制功能的变种和突变株。如下文实施例所述，FtsZ基因在不同的植物种类中高度保守。预计所有植物均含有与拟南芥属质体分裂基因cpFtsZ或AtFtsZ同源的质体分裂基因。细菌FtsZ基因也与这些植物FtsZ基因同源，并且能同样用于转基因植物。
鉴于质体分裂序列在植物种类中的普遍存在性和高度保守性，因此能够合理地期望任何植物的质体分裂基因(FtsZ基因只是其中一个例子)可用于本发明的实践。例如，根据农业或园艺价值来培育的植物可用于本发明的实践中。
特别可以考虑将任何质体分裂序列用于本发明的实践中。“质体分裂序列”指任何具有质体分裂活性的植物DNA序列。质体分裂序列可以是分离自任何植物的未修饰的序列、衍生自任何植物的cDNA序列、被修饰成含有少量核苷酸加入、缺失或取代的基因组或cDNA序列、或合成的DNA序列。该术语同样适用于来自其它植物以及仍能控制质体分裂的等位基因变种和突变株的类似序列。
“质体分裂活性”是指使细胞或质体分裂序列在其中表达的转基因植物中的叶绿体或其它类质体的数目或大小发生改变的能力。
“转基因”用来描述在植物基因组中携带的人工基因构建物并通过基因传递将其插入植物或其原植株中去。这些转基因一旦插入就可通过常规的Medellian遗传传递。
特别可以预计的是，可用选择性地上调或下调质体分裂活性的质体分裂序列转基因来制备转基因植物。为了有更多的质体分裂，可以将质体分裂序列的额外拷贝或高表达拷贝插入植物中。为了有较少的质体分裂，可采用反义质体分裂序列转基因或任何其它基因抑制技术来下调质体的分裂。质体分裂的上调和下调均适用于某些应用。
如实施例中所述的，用农杆菌属(Agrobacterium)转化系统作为模型系统来获得转基因拟南芥属植物。已知农杆菌介导的转化适用于许多双子叶植物和一些单子叶植物。在双子叶植物和单子叶植物中同样适用的其它转化方法也可用于本发明的实践中。转基因植物可通过粒子轰击、电穿孔或植物分子生物学领域普通技术人员已知的其它任何转化植物的方法。目前在植物基因工程技术中的经验是，基因引入的方法对于转基因植物中获得的表型并不非常重要。
本发明也涉及了已知基因构建物，该构建物包含质体分裂序列和与该序列非固有的启动子，该启动子启动植物中质体分裂序列的表达，使其表达水平足以产生新表型。构建物可以含有有义或反义方向的序列。在实施例中描述了三种发现能改变转化的植物细胞中叶绿体数目或大小的构建物的制备过程。简而言之，这些构建物的相关特征包括一个卡那霉素抗性标记，以及CamV 35S启动子，与启动子相连的叶绿体分裂序列和OCS终止子(按照5＇-3＇次序)。
CamV 35S是已知在各类植物中起作用的组成型启动子。也可用能在引入构建物的植物中起作用的其它启动子来产生基因构建物用于本发明实践。它们可以包括其它组成型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子和诱导型启动子。启动子也可含有某些改善转录效率的增强子序列元件。
下文实施例描述了含有卡那霉素抗性基因的表达载体的应用，该抗性基因作为可选择的标记来筛选已经用基因构建物转化的植物。许多可选择标记，包括抗生素和除草抗性基因，是植物分子生物学领域已知的，它们可用来构建适用于本发明实践的表达载体。表达载体可被改造成包含有可筛选标记，如β葡糖醛酸酶(GUS)。
下文实施例中采用的基因构建物用质粒载体pART7和pART27来工程改造(Gleave,Plant Mol.Biol.20:1203-1207,1992)。可以预料，在制备能用来转化植物以使质体分裂序列表达的构建物时，可采用其它质粒载体或病毒载体或分子生物学领域已知的其它载体。我们描述了适于用农杆菌系统来转化的基因构建物的制备。然而，任何获得转基因植物的转化系统均可采用。载体的构建以及该载体与特定转化系统的适应是该领域技术人员能做到的。
本发明还考虑了一种相对野生型植物来改变植物中质体数目和大小的方法。该方法包括下列步骤制备一个基因构建物，该构建物包含质体分裂序列和与该序列非固有的启动子，将基因构建物转化入植物中，使产生的转基因植物生长，从而使基因构建物表达。基因构建物作为植物中的转基因会改变植物中的质体数目。
在下文实施例中，在质体分裂序列作为转基因植物中的转基因表达的植物中，测定叶绿体数目和大小的变化。预计质体分裂序列也参与了其它质体(色质体、造粉质体和油质体)分裂的调节。这些质体在农业上是非常重要的，因为它们分别合成了类胡萝卜素、淀粉和油。调控叶绿体分裂序列的表达以改变叶绿体外其它质体的数目或大小的方法在也本发明的范围和精神内。
下列非限制性实施例的目的只是为了描述。
实施例来自拟南芥的叶绿体分裂基因的分离和鉴定如下所述从拟南芥中分离获得细菌FtsZ基因的同源物。在表达序列标记数据库dbEST(Newman,T．等，Pl.Physiol.106:1241-1255,1994)的同源性搜寻中用大肠杆菌FtsZ的氨基酸序列作为探针。鉴定出来自拟南芥的互补DNA，它与数据库没有指定的匹配，但是表现出与大肠杆菌FtsZ有一小段序列的同源性。从拟南芥属生物资源中心(Biological Resource Center)(目录号105K17T7)获得含有与鉴定序列同源的拟南芥属cDNA序列的克隆，并完全测序。
该命名为cpFtsZ的拟南芥属DNA序列显示在SEQ ID NO:1中。它含有编码433个氨基酸(SEQ ID NO:2)的推定蛋白的开放读框(ORF)，该推定蛋白与几种原核种类的FtsZ序列有显著的同源性。拟南芥属FtsZ蛋白(Mr45000)含有一个富含甘氨酸的“微管蛋白特征”基序，该基序在FtsZ蛋白和微管蛋白间是保守的，并且对于GTP结合很重要(de Boer等，Nature 359:254-256，1992)。结合GTP的能力表示，cpFtsZ可能类似微管蛋白(其活性需要依赖于GTP的聚合反应)那样起细胞骨架作用。在细菌FtsZ蛋白和微管蛋白(Mukherjee等，J.Bact.176:2754-2758，1994)中相同的氨基酸残基在拟南芥cpFtsZ序列中是保守的(除了一个氨基酸外)。
两个细胞系的证据说明，拟南芥cpFtsZ蛋白是核编码的蛋白，它位于叶绿体的基质区室中。拟南芥cpFtsZ的氨基端45-55个残基有典型的叶绿体转运肽的性质，其特征是具有高比例的羟基化氨基酸、少量的酸性残基和丙氨酸作为第二个残基(Keegstra等，A.Rev.Pl.Physiol.,Pl.Molec.Biol.40:471-501，1989)。
其它表明拟南芥cpFtsZ蛋白位于叶绿体中的证据可由体外叶绿体输入实验(Osteryoung等，Nature 376:473-474,1995)来提供。在该实验中，在分离的豌豆叶绿体中检测全长拟南芥cpFtsZ翻译产物的翻译后输入和加工。该实验证明，拟南芥cpFtsZ翻译产物在翻译后被输入叶绿体中，并在叶绿体内切割推定的转运肽，形成了免受蛋白水解酶处理(除非叶绿体膜被去污剂破坏)的可溶的蛋白。
拟南芥属中其它FtsZ同源物的鉴定在dbEST中进行第二次EST时，鉴定出有一小段序列与cpFtsZ有同源性，这表明拟南芥属中至少还有一种其它的FtsZ基因存在。由于该EST的序列表明cDNA经历了重排，因此对含有与cpFtsZ同源的区域的PCR片段进行扩增，并用来筛选拟南芥cDNA文库。分离获得非重排的cDNA并进行测序。这第二种cDNA序列命名为AtFtsZ，其显示在SEQID NO:3中。演绎的氨基酸序列(SEQ IDNO:4)表现出与cpFtsZ和细菌FtsZ蛋白均有约50％的相同性，而且，它含有其它FtsZ蛋白间保守的所有残基。这一演绎的氨基酸序列与鱼腥藻属FtsZ有56％的相同性和73％的相似性，这表明有内共生的起源和叶绿体定位。然而，与cpFtsZ蛋白相反，AtFtsZ体外翻译产物不能输入分离的叶绿体中；这可能是由于AtFtsZcDNA不是全长，它缺失了编码转运肽的区域。cDNA不含有整个基因的说法是因为观察到AtFtsZ cDNA中的第一个ATG在38个氨基酸ORF后发生，并且它成为起始密码子的程度较差(Lutke等，EMBO J.6:43-48,1987)。
在高度严格条件下用cpFtsZ cDNA探测拟南芥序列的Southern和Northern印迹物的杂交研究显示出杂交呈一条带，这表明cpFtsZ很可能由拟南芥中的单个基因编码。
在高度严格条件下用AtFtsZ cDNA作为探针的杂交研究显示了杂交成两个与cpFtsZ杂交序列不同的序列。这表明存在第三种与AtFtsZ有显著同源性的拟南芥FtsZ序列。
嵌合反义基因的构建为了证明cpFtsZ和AtFtsZ的功能是作为质体分裂基因，构建反义基因来减少这两个基因的表达，并测定对质体数目和大小的效果。选用于这些研究的植物转化载体是pART27(Gleave)。两个反义构建物均用标准重组DNA技术来制成。cpFtsZ反义构建物包括743bp XbaⅠ/AvaⅠ限制性片段，该片段以反义方向连接在有相容限制性位点的pART27衍生物中(图2)。AtFtsZ反义构建物包括1166bpSpeⅠ/AvaⅠ限制性片段，该片段以反义方向连接在相同的pART27衍生物中(图3)。在连接产物在大肠杆菌内扩增后，用标准的方法纯化获得少量制备DNA，并对其进行几次诊断性的限制性消化，以确定载体中是否合适地插入了AtFtsZ或cpFtsZ片段。从大肠杆菌转化子分离获得的质粒DNA含有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、cpFtsZ或AtFtsZ基因片段以及OCS终止子(按照5＇到3＇的次序)。
嵌合cpFtsZ有义基因的构建在拟南芥生物来源中心(Biological Resource Center)(目录号105K17T7)获得质粒pZLl(Gibco-BRL)中含有cpFtsZ eDNA的重组质粒，将其用来构建cpFtsZ高表达基因。用NotⅠ使质粒线性化，末端插入Klenow片段。随后通过用EcoRⅠ消化质粒并纯化来获得含有全部cpFtsZ eDNA的片段。将该片段有方向的连接入用SmaⅠ和EcoRⅠ消化的pART7中。获得的质粒用NotⅠ消化。纯化含有嵌合cpFtsZ基因的片段并连接入已经用NotⅠ消化的pART27中(见图4)。
嵌合构建物转移到农杆菌中根据以下方法将质粒DNA转移到农杆菌株GV3101中1)将5μl(约1-2μg)质粒DNA制品加入预先冰冻的正在冻融的感受态农杆菌细胞中；2)在液氮中冷冻细胞，然后通过37℃水浴中培育来解冻；3)将细胞加入1ml YEP(酵母抽提液、蛋白冻、氯化钠)培养基中，并在28℃、轻微搅拌下培育2-4小时；4)将细胞转移到1.5ml离心管中，在微型离心机中离心30秒(12000rpm)来使其沉淀；5)倾析出上清液，使沉淀在100μl液体YEP培养基中重新悬浮；6)将细胞分散在具有下列抗生素的YEP平板上利福平(50μg/ml)、壮观霉素(150μg/ml)和庆大霉素(25μg/ml)；7)使菌落在28℃下培育2天。
为了确定在质粒转移到农杆菌中后没有发生重排，将每个构建物的两个分离的菌落划线培养到分开的平板上(平板中含有YEP和利福平(50μg/ml)、壮观霉素(150μg/ml)和庆大霉素(25μg/ml))，使菌落在28℃下生长2天。使每个平板的5个分离的菌落转移到分离的培养试管中(试管中含有3ml LB液体培养基和100μg/ml壮观霉素)，使菌落在30℃振荡的培养箱中生长两天。用标准方法小规模地制备(少量制备)重组质粒。使5个DNA样品的每一个以5μl悬浮并混合。对DNA进行几次诊断性的限制性消化，并用琼脂糖凝胶电泳来测定获得的片段的大小。分离自农杆菌的质粒DNA其消化获得片段的大小与分离自大肠杆菌的质粒同样消化获得的片段相同。这一结果表明插入的DNA没有发生重排。
拟南芥的转化将转化有合适构建物的农杆菌的单菌落转移到含有25ml YEP和利福平(50μg/ml)、壮观霉素(150μg/ml)和庆大霉素(25μg/ml)的烧瓶中。在30℃振荡培养箱中培育1天后，将25ml培养物转移到含有上述相同抗生素的1升YEP培养基中。使农杆菌细胞在30℃振荡培养箱中培养过夜。使农杆菌培养物在离心机中6000rpm下离心15分钟来沉淀。将细胞沉淀重新悬浮在4升滤过培养基(8.8gMurashige-Skoog盐(Gibco-BRL)、4ml Gamborg＇s1XB5维生素(Gibco-BRL)、2gMES、pH5.7、18μl苄基氨基嘌呤、800μl Silwett L-77)中。将5个罐(每个有5株6周龄拟南芥植物)和滤过培养基一起放在密封玻璃真空中并在15英寸汞柱下维持5分钟。然后将植物放置在噪声抑制(Percival)环境生长室中，20℃光照下16小时，15℃暗处6小时，湿度为70％，密度为100-150μmol m-2s-1。在成熟期收获种子。
转化的T1代幼苗的鉴定对种子进行杀菌，并转移入含有100μg/ml卡那霉素的MS平板(Murashige-salts 4.3g/L、蔗糖20g/L、phytagar 7g/L、pH5.8)中。将平板放置在4℃冷藏箱中2天以使种子春化，然后放置在20℃生长室中(20℃光照下16小时，15℃暗处8小时)。由幼苗长出第一叶和长的分支根可以看出，转化的植物表现出卡那霉素抗性。对卡那霉素敏感的幼苗萌发出漂白的子叶和不分支的根。将深绿色的卡那霉素抗性转化子转移到有蛭石和1X Hoagland的土壤中，使其生长至成熟来收集T2种子。
测定cpFtsZ或AtFtsZ表达的改变对叶绿体数目和大小的影响为了测定改变的cpFtsZ或AtFtsZ表达是否对质体分裂有影响，用Pyke和Leech描述的方法检测转基因系中质体数目和大小的改变(Plant Physiol.96:1193-1195,1991)。将T1或T2转化子的小片子叶或叶组织固定在3.5％戊二醛中1小时，然后转移到pH8.00.1％Na2EDTA中，并在55℃下培育3-5小时。梳下叶肉细胞，在Olympus BH-2显微镜下用可使叶绿体可视化的Nomarski干扰相差光学器件来来检测。
转化子中叶绿体数目和大小的改变发现含有引入的cpFtsZ或AtFtsZ序列的转化子表现出独特的表型，该表型特征是叶绿体的减少数目远远大于野生型叶绿体(表1)。这些结果确认了这些序列在叶绿体分裂起着重要作用，并暗示转基因植物中的叶绿体数目可以控制。
检测的98个AtFtsZ反义转化子中约有60％的扩大的叶绿体数目比野生型少。约一半的转化子只有约1-4个扩大的叶绿体，约10％有约5-20个扩大的叶绿体(表1)。约40％的转化子有正常大小的野生型数目的叶绿体(从80-100)。
在25个转化有含有义方向cpFtsZ的构建物的转化子中，7个转化子的叶肉细胞有数目大量减少的非常大的叶绿体。7个cpFtsZ有义突变株有野生型表型，4个有中间表型，4个有混合表型。三个转化子中质体的数目增加但其体积小于野生型(表1)。
获得26个含有cpFtsZ反义方向的构建物的转化子，在这些植物中，13个表现出野生型表型，4个有数量大大减低的非常大的叶绿体，一个有中间表型，13个有野生型表型，一个的叶肉细胞具有各种大小的叶绿体(表1)。
综合起来，这些结果表明，通过控制cpFtsZ或AtFtsZ的表达水平可以增加或减少转基因植物中的叶绿体数目。
表1拟南芥属AtFtsZ和cpFtsZ转基因植物的表型5基因方向 严重中间 野生型混合* 质体小于 总共(1-4个质 (5-20个质体)(80-100个野生型体)非常大 于野生型 质体)AtFtsZ 反义 48 1039 1 -- 98cpFtsZ 反义4 1 13 8 -- 2610cpFtsZ 有义7 4 7 4 3 25数据确认了cpFtsZ和AtFtsZ是叶绿体分裂基因。
*同一植物的不同细胞中有不同的质体数。
其它植物种类中FtsZ序列的鉴定为了确定其它植物种类中是否含有与拟南芥cpFtsZ或AtFtsZ序列同源的序列，如下进行Southern杂交实验。根据本领域已知的标准方法从各植物种类中分离出基因组DNA。用EcoRⅠ消化DNA，并在琼脂糖凝胶上电泳分离。通过Southern印迹法将DNA片段转移到硝酸纤维素膜上。通过NotⅠ和SalⅠ消化，32P-dATP作放射性标记，并在42℃水性缓冲液中与印迹杂交(如Ausabel等，CurrentPortocols in Molecular Biology,John wiley & Sons,1994中所述)，从pZL1中分离出cpFtsZ cDNA。在适中的严格性(0.2xSSC,45℃)下洗涤印迹，并将其暴露在x-光片下。印迹上显示每一种类均有两条或多条带与cpFtsZ探针杂交。这些结果表明FtsZ同系物存在于其它植物种类中，并且由一个小基因家族编码。
该杂交实验的结果(图X)提供证据表明各个不同的植物种类含有与拟南芥质体分裂基因同源的序列。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人Osteryoung.Katherine W(ⅱ)发明名称植物质体分裂基因(ⅲ)序列数目4(ⅳ)通信地址(A)收件人Quarles & Brady(B)街道1 South Pinckney Street(C)城市Madison(D)州WI(E)国家US(F)邮编53701-2113(V)计算机可读形式(A)记录介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容型(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)本申请资料(A)申请号US(B)申请日(C)分类(ⅷ)律师/代理人信息(A)姓名Seay,Nichol as J.
(B)登记号27,386(C)参考/案卷号920905.90016
(ⅸ)通讯信息(A)电话608-251-5000(B)电传608-251-9166(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1425碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键CDS(B)位置25..1326(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CCACGCGTCC GGAGGAAGTA AACA ATG GCG ATA ATT CCG TTA GCA CAG CTT51Met Ala Ile Ile Pro Leu Ala Gln Leu1 5AAT GAG CTA ACG ATT TCT TCA TCT TCT TCT TCG TTT CTT ACC AAA TCG 99Asn Glu Leu Thr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Leu Thr Lys Ser10 15 20 25ATA TCT TCT CAT TCG TTG CAT AGT AGC TGC ATT TGC GCA AGT TCT AGA 147Ile Ser Ser His Ser Leu His Ser Ser Cys Ile Cys Ala Ser Ser Arg30 35 40ATC AGT CAA TTC CGT GGC GGC TTC TCT AAA CGA AGA AGC GAT TCA ACA 195Ile Ser Gln Phe Arg Gly Gly Phe Ser Lys Arg Arg Ser Asp Ser Thr45 50 55AGG TCT AAG TCG ATG CGA TTG AGG TGT TCC TTC TCT CCG ATG GAA TCT 243Arg Ser Lys Ser Met Arg Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro Met Glu Ser60 65 70GCG AGA ATT AAG GTG ATT GGT GTC GGT GGT GGT GGT AAC AAT GCC GTT 291Ala Arg Ile Lys Val Ile Gly Val Gly Gly Gly Gly Asn Asn Ala Val75 80 85AAC CGG ATG ATT TCA AGC GGT TTA CAG AGT GTT 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Gly Ala Ala165 170 175Pro Val Val Ala Gln Ile Ser Lys Asp Ala Gly Tyr Leu Thr Val Gly180 185 190Val Val Thr Tyr Pro Phe Ser Phe Glu Gly Arg Lys Arg Ser Leu Gln195 200 205Ala Leu Glu Ala Ile Glu Lys Leu Gln Lys Asn Val Asp Thr Leu Ile210 215 220Val Ile Pro Asn Asp Arg Leu Leu Asp Ile Ala Asp Glu Gln Thr Pro225 230 235 240Leu Gln Asp Ala Phe Leu Leu Ala Asp Asp Val Leu Arg Gln Gly Val245 250 255Gln Gly Ile Ser Asp Ile Ile Thr Ile Pro Gly Leu Val Asn Val Asp260 265 270Phe Ala Asp Val Lys Ala Val Met Lys Asp Ser Gly Thr Ala Met Leu275 280 285Gly Val Gly Val Ser Ser Ser Lys Asn Arg Ala Glu Glu Ala Ala Glu290 295 300Gln Ala Thr Leu Ala Pro Leu Ile Gly Ser Ser Ile Gln Ser Ala Thr305 310 315 320Gly Val Val Tyr Asn Ile Thr Gly Gly Lys Asp Ile Thr Leu Gln Glu325 330 335Val Asn Arg Val Ser Gln Val Val Thr Ser Leu Ala Asp Pro Ser Ala340 345 350Asn Ile Ile Phe Gly Ala Val Val Asp Asp Arg Tyr Thr Gly Glu Ile355 360 365His Val Thr Ile Ile Ala Thr Gly Phe Ser Gln Ser Phe Gln Lys Thr370 375 380Leu Leu Thr Asp Pro Arg Ala Ala Lys Leu Leu Asp Lys Met Gly Ser385 390 395 400Ser Gly Gln Gln Glu Asn Lys Gly Met Ser Leu Pro His Gln Lys Gln405 410 415Ser Pro Ser Thr Ile Ser Thr Lys Ser Ser Ser Pro Arg Arg Leu Phe420 425 430Phe ＊(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1628碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键CDS(B)位置3..1316(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TC GAC CCA CGC GTC CGT GTT GTT GCC GCT CAG AAA TCT GAA TCT TCT47Asp Pro Arg Val Arg Val Val Ala Ala Gln Lys Ser Glu Ser Ser435 440 445CCA ATC AGA AAC TCT CCA CGG CAT TAC CAA AGC CAA GCT CAA GAT CCT 95Pro Ile Arg Asn Ser Pro Arg His Tyr Gln Ser Gln Ala Gln Asp Pro450 455 460 465TTC TTG AAC CTT CAC CCG GAA ATA TCT ATG CTT AGA GGT GAA GGG ACT 143Phe Leu Asn Leu His Pro Glu Ile Ser Met Leu Arg Gly Glu Gly Thr470 475 480AGT ACA ATA GTC AAT CCA AGA AAG GAA ACG TCT TCT GGA CCT GTT GTC 191Ser Thr Ile Val Asn Pro Arg Lys Glu Thr Ser Ser Gly Pro Val Val485 490 495GAG GAT TTT GAA GAG CCA TCT GCT CCG AGT AAC TAC AAT GAG GCG AGG 239Glu Asp Phe Glu Glu Pro Ser Ala Pro Ser Asn Tyr Asn Glu Ala Arg500 505 510ATT AAG GTT ATT GGT GTG GGA GGT GGT GGA TCA AAT GCT GTG AAT CGT 287Ile Lys Val Ile Gly Val Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ala Val Asn Arg515 520525ATG ATA GAG AGT GAA ATG TCA GGT GTG GAG TTC TGG ATT GTC AAC ACT 335Met Ile Glu Ser Glu Met Ser Gly Val Glu Phe Trp Ile Val Asn Thr530 535 540 545GAT ATC CAG GCT ATG AGA ATG TCT CCT GTT TTG CCT GAT AAT AGG TTA 383Asp Ile Gln Ala Met Arg Met Ser Pro Val Leu Pro Asp Asn Arg Leu550 555 560CAA ATT GGT AAG GAG TTG ACT AGG GGT TTA GGT GCT GGA GGA AAT CCA 431Gln Ile Gly Lys Glu Leu Thr Arg Gly Leu Gly Ala Gly Gly Asn Pro565 570 575GAA ATC GGT ATG AAT GCT GCT AGA GAG AGC AAA GAA GTT ATT GAA GAA 479Glu Ile Gly Met Asn Ala Ala Arg Glu Ser Lys Glu Val Ile Glu Glu580 585 590GCT CTT TAT GGC TCA GAT ATG GTC TTT GTC ACA GCT GGA ATG GGC GGT 527Ala Leu Tyr Gly Ser Asp Met Val Phe Val Thr Ala Gly Met Gly Gly595 600 605GGA ACT GGC ACT GGT GCA GCC CCT GTA ATT GCA GGA ATT GCC AAG GCG 575Gly Thr Gly Thr Gly Ala Ala Pro Val Ile Ala Gly Ile Ala Lys Ala610 615 620 625ATG GGT ATA TTG ACA GTT GGT ATT GCC ACA ACG CCT TTC TCG TTT GAG 623Met Gly Ile Leu Thr Val Gly Ile Ala Thr Thr Pro Phe Ser Phe Glu630 635 640GGT CGA AGA AGA ACT GTT CAG GCT CAA GAA GGG CTT GCA TCT CTC AGA 671Gly Arg Arg Arg Thr Val Gln Ala Gln Glu Gly Leu Ala Ser Leu Arg645 650 655GAC AAT GTT GAC ACT CTC ATC GTC ATT CCA AAT GAC AAG TTG CTT ACA 719Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Val Ile Pro Asn Asp Lys Leu Leu Thr660 665 670GCT GTC TCT CAG TCT ACT CCG GTA ACA GAA GCA TTT AAT CTA GCT GAT 767Ala Val Ser Gln Ser Thr Pro Val Thr Glu Ala Phe Asn Leu Ala Asp675 680 685GAT ATA CTC CGT CAG GGG GTT CGT GGG ATA TCT GAT ATC ATT ACG ATT 815Asp Ile Leu Arg Gln Gly Val Arg Gly Ile Ser Asp Ile Ile Thr Ile690 695 700 705CCT GGT TTG GTG AAT GTG GAT TTT GCT GAT GTG AGA GCT ATA ATG GCA 863Pro Gly Leu Val Asn Val Asp Phe Ala Asp Val Arg Ala Ile Met Ala710 715 720AAT GCG GGG TCT TCA TTG ATG GGA ATA GGA ACT GCG ACA GGA AAG AGT 911Asn Ala Gly Ser Ser Leu Met Gly Ile Gly Thr Ala Thr Gly Lys Ser725 730 735CGG GCA AGA GAT GCT GCG CTA AAT GCA ATC CAA TCC CCT TTG TTA GAT 959Arg Ala Arg Asp Ala Ala Leu Asn Ala Ile Gln Ser Pro Leu Leu Asp740 745 750ATT GGG ATT GAG AGA GCC ACT GGA ATT GTT TGG AAC ATT ACT GGC GGA 1007Ile Gly Ile Glu Arg Ala Thr Gly Ile Val Trp Asn Ile Thr Gly Gly755 760 765AGT GAC TTG ACA TTG TTT GAG GTA AAT GCT GCT GCG GAA GTA ATA TAT 1055Ser Asp Leu Thr Leu Phe Glu Val Asn Ala Ala Ala Glu Val Ile Tyr770 775 780 785GAT CTT GTC GAT CCA ACT GCC AAT CTT ATA TTC GGT GCT GTT GTA GAT 1103Asp Leu Val Asp Pro Thr Ala Asn Leu Ile Phe Gly Ala Val Val Asp790 795 800CCA GCC CTC AGC GGT CAA GTA AGC ATA ACC CTG ATA GCT ACG GGT TTC 1151Pro Ala Leu Ser Gly Gln Val Ser Ile Thr Leu Ile Ala Thr Gly Phe805 810 815AAA CGA CAA GAA GAG GGA GAA GGA CGA ACA GTT CAG ATG GTA CAA GCA 1199Lys Arg Gln Glu Glu Gly Glu Gly Arg Thr Val Gln Met Val Gln Ala820 825 830GAT GCT GCG TCA GTT GGA GCT ACA AGA AGA CCC TCT TCT TCC TTT AGA 1247Asp Ala Ala Ser Val Gly Ala Thr Arg Arg Pro Ser Ser Ser Phe Arg835 840 845GAA AGC GGT TCA GTG GAG ATC CCA GAG TTC TTG AAG AAG AAA GGC AGC 1295Glu Ser Gly Ser Val Glu Ile Pro Glu Phe Leu Lys Lys Lys Gly Ser850 855 860 865TCT CGT TAT CCC CGA GTC TAA AGCCCAATCT AATCACTACC CTGCACACTG1346Ser Arg Tyr Pro Arg Val ＊870CAGCAATAAC AAACGTGTGT GTACTGGTAG TCTGGTACTG CCTTCTGGGA TACAGCAAGA 1406TGTGTTGATG TATGATCAAG AATCTGTGTG GGTGTGTATA TGTTCTGTCA CTGCCTCTGG 1466TCGTGTTCTT GAATAGGTTG TTTTAGAAAT CGGAGTTTCT CTCTATGTCA CTTCCAAAAC 1526AAAAAAGGAG AAGAAGAATC ACACTTCTCG AACCATAAAC ATACTTATAA GATTATGAGA 1586GTTTTAGCAG AAATTATTGT CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 1628(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度438氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Asp Pro Arg Val Arg Val Val Ala Ala Gln Lys Ser Glu Ser Ser Pro1 5 10 15Ile Arg Asn Ser Pro Arg His Tyr Gln Ser Gln Ala Gln Asp Pro Phe20 25 30Leu Asn Leu His Pro Glu Ile Ser Met Leu Arg Gly Glu Gly Thr Ser35 40 45Thr Ile Val Asn Pro Arg Lys Glu Thr Ser Ser Gly Pro Val Val Glu50 55 60Asp Phe Glu Glu Pro Ser Ala Pro Ser 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355 360 365Ala Leu Ser Gly Gln Val Ser Ile Thr Leu Ile Ala Thr Gly Phe Lys370 375 380Arg Gln Glu Glu Gly Glu Gly Arg Thr Val Gln Met Val Gln Ala Asp385 390 395 400Ala Ala Ser Val Gly Ala Thr Arg Arg Pro Ser Ser Ser Phe Arg Glu405 410 415Ser Gly Ser Val Glu Ile Pro Glu Phe Leu Lys Lys Lys Gly Ser Ser420 425 430Arg Tyr Pro Arg Val ＊43权利要求
1．一种转基因植物，在其基因组中包含基因构建物，该构建物包含有义或反义质体分裂序列和与该序列非固有的、启动该序列在植物中表达的启动子，其中在植物中该序列的表达使植物的植物细胞中质体的数目和大小的与非转基因植物种类相比发生改变。
2．根据权利要求1所述的植物，其中序列包含选自SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:3的序列。
3．根据权利要求1所述的植物，其中构建物从5＇-3＇序包括CaMV 35S启动子、选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的质体分裂序列和OCS终止子。
4．根据权利要求1所述的植物，其中质体是叶绿体。
5．一个DNA序列，其特征在于包含SEQ ID NO:1序列。
6．一个DNA序列，其特征在于包含SEQ ID NO:2序列。
7．一种种子，其特征在于它是权利要求1所述的植物的种子。
8．一种植物，该植物的基因组中包含一个转基因，该转基因包含有义或反义FtsZ基因，与不含转基因的同种植物相比，该基因使植物质体数目发生变化。
9．一种种子，其特征在于它是权利要求8所述的植物的种子。
10．根据权利要求8所述的植物，其中FtsZ基因的编码序列选自cpFtsZ和AtFtsZ。
11．一种植物种子，该种子的基因组中包含一种基因构建物，该构建物包含有义或反义质体分裂序列和与该序列非固有的、启动该序列在植物中表达的启动子，其中序列在植物中的表达使得植物的植物细胞中质体的数目和大小发生改变。
12．一种基因构建物，该构建物包含有义或反义方向的质体分裂序列和启动该序列在植物中表达的启动子，该启动子非质体分裂序列原有的。
13．根据权利要求12所述的基因构建物，其中叶绿体分裂序列选自SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:3。
14．根据权利要求12所述的基因构建物，其中启动子是CaMV 35S启动子。
15．根据权利要求12所述的基因构建物，它还附加有卡那霉素抗性标记。
16．一种改变植物的植物细胞中质体数目和大小的方法，该方法包括下列步骤制备一个基因构建物，该构建物包含有义或反义方向的质体分裂序列和与该序列非固有的、启动该序列在植物中表达的启动子，将基因构建物引入植物中，选择接受基因构建物拷贝的植物，使植物在能使该基因表达的条件下生长。
17．一个DNA序列，其特征在于它从其包含植物FtsZ基因的天然基因组中分离获得。
18．根据权利要求17所述的DNA序列，其中DNA序列是SEQ ID NO:1。
19．根据权利要求17所述的DNA序列，其中DNA序列是SEQ ID NO:3。
全文摘要
公开了在调控植物中的质体分裂中起主导作用的DNA序列。也公开了一种获得具有新表型的转基因植物的方法,该表型的特征是质体数目和大小有所改变。
文档编号C07H21/04GK1223661SQ97195912
公开日1999年7月21日 申请日期1997年6月27日 优先权日1997年6月27日
发明者K·W·奥斯特扬 申请人:内华达州立大学