专利名称：一种利用组培快速转育质体转基因植株的方法
技术领域：
本发明属于作物遗传育种技术领域，特别是利用组织培养技术快速转育质体转基因植株的方法。
背景技术：
高等植物的成熟质体根据颜色和功能的不同，可分为叶绿体、有色体和白色体三类，在一定条件下可以相互转化。质体基因组与细胞核基因组之间既相互独立，又相互依存。细胞核核基因转化一直是植物基因工程的主要研究方向，但其有难以克服的弊端，例如细胞核基因组大，背景复杂；导入的外源基因难以控制；外源基因表达效率低，后代不稳定，或发生转基因沉默等，这些问题将严重影响细胞核基因转化技术的实际应用。质体基因转化技术与核基因转化相比较，表现出它旺盛的生命力，因为它有以下优点①高效表达质体基因组的拷贝数非常大(例如每个叶细胞中含有大约1900 50000个拷贝)，整合在其中的外源基因也会以高拷贝数存在，这为外源基因的高效表达提供条件；②转化的原核基因无需修饰改造就可以在高等植物中进行转化。质体大多数基因的结构、转录与翻译系统均与原核生物类似，因此，对于来自原核生物的有重要价值的外源基因，无需改造和修饰就可在质体中转化并高效表达，这是细胞核基因转化无法做到的；③安全性好大多数植物的叶绿体具有母性遗传的特点，因为在受精过程中，只有花粉细胞核穿过胚珠，花粉的细胞质一般不向后代传递。所以对于大多数植物来说，一旦外源基因插入叶绿体基因组，就不会通过花粉向其它植物中扩散(马三梅和王永飞，2004))，从而保证了基因工程的安全性；④便于遗传操作质体基因组小，结构简单，烟草、水稻和欧龙牙草等几种高等植物的质体基因组已全被测定，其它植物也有许多质体基因被定位和测序， 遗传背景较清楚，便于遗传操作；⑤实现定点整合外源基因可通过同源重组定点整合进入质体基因组。定点整合有利于控制外源基因的表达，保持植物基因的正常功能；⑥易保持纯系、后代不分离。一旦得到纯合而稳定的质体转化体，由于外源基因的母系遗传特性。这种纯系的种子后代不会因为有性杂交而发生分离，将长时间保持为纯系；⑦叶绿体转化还具有无基因沉默和位置效应等优点。烟草和棉花等的细胞质雄性不育与叶绿体DNA有关。在叶绿体遗传转化研究方面，已克隆和成功质体转化甜菜叶绿体的rbcL/atpB基因(李滨胜，崔杰et al. 2008)。 到目前为止，在烟草、拟南芥、马铃薯、番茄、水稻、油菜、棉花、大豆和莴苣等多种作物中进行了叶绿体转化研究并获得成功(李滨胜，崔杰等，2008)。尽管如此，质体转基因技术还是难度较大，转化效率偏低，而且还受到材料类型甚至基因型的限制。在育种过程中，育种家通常需要把获得转基因单株的基因转育到其它的优异材料中以获得更多的转基因优异材料。传统做法是将转基因单株与优异材料杂交，然后再与优异材料回交(至少5代以上)，直至获得具有转基因材料的细胞质和具有优异材料的几乎相同的细胞核遗传物质。这种转育质体转基因方法通常需要4-5年，成本高、需要大面积种植选择单株，过程繁琐、费力，并且在回交中选择单株的效率还受育种家经验影响。
3另外传统的质体转基因材料的转育只能在有性杂交成功的材料间进行，对种间及其以上材料直接的转育效率低甚至会失败。植物细胞与细胞之间的通道为胞间连丝，它有助于每个植物细胞与邻近细胞之间进行分子交换。研究证明植株在幼嫩未成熟组织的状态下，大分子交换的通道更是杂乱无章，植株越嫩，胞间连丝越大，越容易发生大分子甚至细胞器的交换。嫁接杂交能够成为一种简单有效育种的方法(Liu，Wang et al.，2010)，但作为一种基因转移方法很少被应用。 Stegemann 和 Bock (2009 年，Science 324(5927) 649-51)研究表明遗传物质可以在嫁接结合处穿越。研究表明在烟草嫁接时核DNA(Stegemarm and Bock 2009)或者是质体编码基因能够在砧木和接穗细胞之间穿越，并且证明最后融合的细胞中来自两部分的标记基因都会表达，并且遗传物质的传递可以在两个方向上进行；发现74株嫁接小苗有94次事件发生，细胞间基因转移频率与嫁接方向不相关。通过嫁接可以得到可遗传的物质，并且这种方法与有性繁殖没有主要区别(Rusk 2009)。嫁接转移基因可以打破不同物种间基因交流的局限(Stegemarm and Bock 2009)。利用嫁接转育质体转基因植株目前还没有被利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用组培快速转育质体转基因植株的方法，该方法利用组织培养技术对已具有外源质体转基因材料和另一种待转育的材料进行嫁接，两种材料细胞质中的质体进行交换，使基因在两种细胞质间转移，而各自的细胞核物质并未改变，最后在组培条件下成苗，通过选择压筛选得到具有外源基因的转育成功的材料，为育种提供新材料。本发明依次通过下列步骤实现
1)取转基因质体材料与待转育材料的种子浸泡24h后，依次经清水冲洗2次、质量比浓度为95%的乙醇冲洗Imin、无菌水清洗2_3次、质量比浓度为0. 1%的升汞漂洗15min， 其间不时摇动、无菌水清洗4次后，接种于MS培养基上，在培养箱中无菌培养，取培养8-10d 的幼苗备用；
MS培养基配方MS粉4. 4g/L+蔗糖20g/L+冷凝胶2. 6g/L
2)待种子发芽生长到下胚轴伸长大约IOcm左右，将转基因叶绿体材料种子下胚轴切成5mm切段，将待转育材料下胚轴切成15mm切段，然后将两种切段切口处对接，存放于诱导脱分化培养基中；
脱分化培养基配方MS盐4. 41g/L+2，4-D lmg/L+6-BA lmg/L+蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L
3)伤口处出现愈伤组织的分化后，将转基因材料下胚轴和待转育材料下胚轴对接切段转移至分化培养基上；
分化培养基配方MS 盐 4. 41g/L +6-BA4mg/L+ZT 2mg/L+AgN03 5mg/L+ 蔗糖 30g/L + 冷凝胶2. 6g/L
4)待伤口处产生绿色和白色致密的愈伤组织后，再转移到分化芽培养基上，此时两种切段的愈伤组织结合在一起生长，根据质体中的选择性标记在分化芽培养基上加入相对应的筛选物质，淘汰未含有转基因的质体细胞，培养两周；
分化芽培养基配方MS盐4. 41g/L +6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L+筛选压
45)培养基两周更换一次，组织分化出的类似嫩叶的组织Icm左右高时，转移至分化茎
培养基中；
分化茎培养基配方=MS盐4. 41g/L +6-BA 0. 005mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶2. 6g/L+ 筛选压
6)在分化茎培养基上外植体逐渐生长出完整的小植株，待其茎长出2-3片叶、3-4条须根时，打开培养罐，使小植株慢慢适应外界环境，2-3天后，将植株移出，用清水将根部培养基洗净，移栽至盛有营养土的盆钵中常规培养；
7)对长出的幼苗，根据转基因叶绿体材料中的抗性基因，使用对应的物质对培育出的植株进行筛选，如抗性基因为抗草丁磷除草剂基因，则筛选物质为草丁磷，保留抗性单株；
8)取植株叶片提取叶绿体和细胞核DNA，进行分子鉴定，若材料中的细胞质指纹图谱中含有抗性基因片段，并且核遗传物质指纹图谱与待转育的材料指纹图谱相符，即为转育成功的材料，再利用田间鉴定进行进一步确认。上述方法步骤1-6中外植体的培养条件为光照16h和黑暗8h培养；培养基两周换一次；步骤4所述的选择性标记是指抗basta或抗kan。本发明可用于转育以下几类基因的质体转基因植株
(1)在质体中转化的控制人类必须氨基酸、脂肪酸、糖类和蛋白质含量的关键基因； (2)工业用酶或药用蛋白如生长因子、干扰素、抗体等有关的基因；(3)抗逆、抗病、抗虫和抗除草剂等基因。
图1为传统的质体转基因转育过程。将质体转基因单株与优异材料杂交，然后再与优异材料回交(至少5代以上)，直至获得具有转基因材料的细胞质和具有优异材料的几乎相同的细胞核遗传物质。图2为本发明质体转基因材料转育流程。质体转基因材料下胚轴和将待转育材料下胚轴对接，接口处愈伤组织细胞相互交流，质体交换和基因转移。本发明具有以下优点
1、在将质体转基因植株向非转基因植株转育时，可以一次性且在少于一年的时间内， 将非转基因材料变成转基因材料并且未改变待转基因的材料核遗传物质。可克服传统方法的繁琐、周期长(3-5年)、费力和成本高的缺点。2、将质体转基因植株与亲缘关系较远的材料(只要愈伤组织团可以融合在一起均可进行)，进行嫁接和基因转移，打破了物种界限，可克服传统的质体转基因植株转育只能在有性杂交成功的材料之间进行的缺点。
具体实施例方式以油菜作物举例说明
_ 1)取油菜叶绿体中抗Basta材料与待转育材料中双11号的种子浸泡24h，从中踢出干瘪和腐烂的种子一清水冲洗2次(d h20)— 95%乙醇冲洗Imin —无菌水清洗2_3次， —0. 1%升汞漂洗15min(其间不时摇动)一无菌水清洗4次一接种于MS培养基一在培养箱中无菌培养一取培养8-10d的幼苗备用；
5MS培养基配方MS粉4. 4g /L+蔗糖20g/L +冷凝胶2. 6g/L
2)待种子发芽生长到下胚轴伸长大约IOcm左右，将转基因叶绿体材料种子下胚轴切成5mm切段，将待转育材料中双11号下胚轴切成15mm切段，然后将两种切段切口处对接， 存放于诱导脱分化培养基中；
脱分化培养基配方MS盐4. 41g/L+2，4-D lmg/L+6-BA lmg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L
3)大约两个星期后，通过诱导分化及培养，伤口处会有愈伤组织的分化，将转基因材料下胚轴和待转育材料中双11号下胚轴对接切段转移至分化培养基上；
分化培养基配方MS 盐 4. 41g/L +6-BA 4mg/L+ZT 2mg/L+AgN03 5mg/L+蔗糖 30g/L + 冷凝胶2. 6g/L
4)大约两个星期，开始分化且伤口处产生绿色和白色致密的愈伤组织后，再转移到分化芽培养基上，此时两种切段的愈伤组织结合在一起生长，根据质体中的选择性标记在分化芽培养基上加入相对应的筛选物质lOmg/LBasta，淘汰未含有转基因的质体细胞，培养两周；
分化芽培养基配方MS盐4.41g/L +6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L+10mg/LBasta
5)培养基两周更换一次，在分化芽培养基培养时进行观察，组织会分化出类似嫩叶的组织，当出现Icm左右高的嫩叶组织时将组织转移至分化茎培养基中，如果嫩叶没有长出则继续在分化芽培养基上培养；
分化茎培养基MS 盐 4. 41g/L +6-BA 0. 005mg/L + 蔗糖 30g/L + 冷凝胶 2. 6g/L+10mg/ LBasta
6)在分化茎培养基上外植体逐渐生长出完整的小植株；待其茎长出2-3片叶、3-4条须根时，打开培养罐，使小植株慢慢适应外界环境，2-3天后，将植株移出，用清水将根部培养基洗净，移栽至盛有营养土的盆钵中，自然生长，给予充足阳光，定期施肥；
7)对长出的幼苗，用10mg/L浓度的Basta对培育出的植株进行筛选，保留抗性单株；
8)取植株叶片提取叶绿体和细胞核DNA，进行基因检测等分子鉴定，若材料中的细胞质指纹图谱中含有抗性基因片段，并且核遗传物质指纹图谱与待转育的材料指纹图谱相符， 即为转育成功的材料，再利用田间鉴定进行进一步确认。 其中1-6步骤中外植体的培养条件为光照16h和黑暗8h培养；培养基两周换一次，防止有毒物质积累。
权利要求
1. 一种利用组培快速转育质体转基因植株的方法，其特征在于依次通过下列步骤实现1)取转基因质体材料与待转育材料的种子浸泡24h后，依次经清水冲洗2次、质量比浓度为95%的乙醇冲洗Imin、无菌水清洗2_3次、质量比浓度为0. 1%的升汞漂洗15min， 其间不时摇动、无菌水清洗4次后，接种于MS培养基上，在培养箱中无菌培养，取培养8-10d 的幼苗备用；MS培养基配方MS粉4. 4g/L+蔗糖20g/L+冷凝胶2. 6g/L2)待种子发芽生长到下胚轴伸长大约IOcm左右，将转基因叶绿体材料种子下胚轴切成5mm切段，将待转育材料下胚轴切成15mm切段，然后将两种切段切口处对接，存放于诱导脱分化培养基中；脱分化培养基配方MS盐4. 41g/L+2, 4-D lmg/L+6-BA lmg/L+蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L3)伤口处出现愈伤组织的分化后，将转基因材料下胚轴和待转育材料下胚轴对接切段转移至分化培养基上；分化培养基配方MS 盐 4. 41g/L +6-BA4mg/L+ZT 2mg/L+AgN03 5mg/L+ 蔗糖 30g/L + 冷凝胶2. 6g/L4)待伤口处产生绿色和白色致密的愈伤组织后，再转移到分化芽培养基上，此时两种切段的愈伤组织结合在一起生长，根据质体中的选择性标记在分化芽培养基上加入相对应的筛选物质，淘汰未含有转基因的质体细胞，培养两周；分化芽培养基配方MS盐4.41g/L +6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L+筛选压5)培养基两周更换一次，组织分化出的类似嫩叶的组织Icm左右高时，转移至分化茎培养基中；分化茎培养基配方=MS盐4. 41g/L +6-BA 0. 005mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶2. 6g/L+ 筛选压6)在分化茎培养基上外植体逐渐生长出完整的小植株，待其茎长出2-3片叶、3-4条须根时，打开培养罐，使小植株慢慢适应外界环境，2-3天后，将植株移出，用清水将根部培养基洗净，移栽至盛有营养土的盆钵中常规培养；7)对长出的幼苗，根据转基因叶绿体材料中的抗性基因，使用对应的物质对培育出的植株进行筛选，如抗性基因为抗草丁磷除草剂基因，则筛选物质为草丁磷，保留抗性单株；8)取植株叶片提取叶绿体和细胞核DNA，进行分子鉴定，若材料中的细胞质指纹图谱中含有抗性基因片段，并且核遗传物质指纹图谱与待转育的材料指纹图谱相符，即为转育成功的材料，再利用田间鉴定进行进一步确认；上述方法步骤1-6中外植体的培养条件为光照16h和黑暗8h培养；培养基两周换一次；步骤4所述的选择性标记是指抗basta或抗kan。
全文摘要
本发明将转基因单株与待转育的植株在无菌培养条件下切成小段，然后愈伤口处对接，待对接处长出愈伤团，两个材料细胞质中的质体相互转移，通过组织培育和在选择压条件下进行筛选，得到细胞质含有质体转基因成分而细胞核为被转化的材料植株。利用此方法可以快速进行转育。与传统方法相比，可提高效率5倍以上，大大节约成本和人力资源。
文档编号A01H4/00GK102217536SQ20111009911
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者付东辉, 李加纳, 申敏, 肖美丽 申请人:西南大学