专利名称：一种获得芸薹属a基因组蔬菜新种质的方法及应用方法
技术领域：
本发明属于生物技术与单倍体育种技术领域，具体说，涉及一种通过游离小孢子 培养方法快速获得芸薹属A基因组蔬菜新种质并应用于育种的方法。
背景技术：
芸薹属A基因组(2n = h = 20)蔬菜，分为小白菜亚种和大白菜亚种，小白菜亚种 包括奶白菜、乌塌菜、菜心、小菘菜、油菜、矮脚黄、蕾用菜等，此亚种的特点为叶片开张、株 型矮小、具明显的叶柄，多数叶片光滑无毛，无明显叶翼，不形成明显叶球。大白菜亚种分化 为散叶变种半结球变种、花心变种、结球变种，特点为株型较大，有明显的叶柄和叶翼，叶面 多不光滑、除散叶变种外，均可形成叶球。亚种之间和亚种内变种之间蔬菜性状差异很大， 由于染色体条数一样，亚种之间和亚种内变种之间杂交不存在障碍，易获得种子。通过有性 杂交可以将不同亚种、变种蔬菜的优点综合起来，杂交后代在基因型上是高度杂和的，而优 势杂交育种中需要的高度纯和的亲本，用常规方法自交、分离选择再连续自交好几个世代， 费工、费时。随着人们生活水平的提高，传统方法用变种内、品种间杂交，难以满足市场需要 的高产、优质、形状新奇的蔬菜的要求，而对亚种之间和亚种内变种之间杂种进行游离小孢 子培养则可以快速获得双单倍体纯系，且纯系之间差异很大，提供了更大的选择范围，解决 这一问题，满足育种工作的需要。截止目前，在几乎所有芸薹属作物上均有小孢子培养成功的报道，1989年，日本学 者^to等在进行大白菜游离小孢子培养时获得了再生植株，1992年，曹鸣庆等首次报道小 白菜游离小孢子培养获得成功，1996年，李光涛获得了紫菜薹再生植株，此外，乌塌菜等也 有培养成功的报道。基于芸薹属A基因组作物亚种之间和亚种内变种蔬菜间杂交不存在障 碍和在小孢子培养方面取得的进展，本发明以芸薹属‘大白菜亚种X小白菜亚种’、‘小白菜 亚种内变种X变种’杂交种作为小孢子培养的供体植株，对小孢子培养体系进行大量的试 验，获得了很多再生植株，配制了杂交组合。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得芸薹属A基因组蔬菜新种质的方法及应用方法，是 将传统的有性杂交技术和细胞培养技术结合起来，进行亚种之间和亚种内变种之间蔬菜杂 交，通过游离小孢子培养方法对F1或经筛选的符合育种目标的F2培养，从而获得再生植株， 并应用于育种。本发明提供的获得芸薹属A基因组蔬菜新种质的方法如下A、对芸薹属‘大白菜亚种X小白菜亚种’或‘小白菜亚种内变种X变种’蔬菜进 行杂交获得F1种子，种植F1并自交获得F2 ；B、在温室中培养F1和F2, F1和F2的种子经过2 4°C低温处理20 25天，在开 花期对F1和F2代中筛选出的符合育种目标的植株进行游离小孢子培养，接种小孢子后需 33°C暗培养1天，再转至25°C培养箱静置暗培养10 15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到转数为40 60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25°C ；C、将子叶期胚状体转接到MS培养基以获得再生植株；D、将再生植株接种到MS培养基上进行人工诱导生根，待再生植株生根后，移栽到 温室，温室温度白天应为20 25°C，夜间温度应为于5 10°C ；E、经50 70天后，再生植株开始开花，鉴定再生植株倍性，单倍体植株用秋水仙 碱处理，使其加倍，双单倍体植株、高倍体植株保留；F、对双单倍体植株、高倍体植株自交授粉，获得种子，同时测定亲和指数；G、种植双单倍体、高倍体自交种子，根据育种目标，鉴定植株株高、叶长、叶色等外 观性状，钙、镁、维生素C诸营养指标，抗病、抗逆性。在B步骤中，对F1和F2植株进行游离小孢子培养，选取花瓣长度与花药长度比值 为0. 5 0. 75的未开放花蕾，在超净工作台内表面灭菌后，用蒸流水冲洗3遍，倒入蔗糖 浓度为130g/L的B5培养基，挤碎花蕾，使小孢子游离出来，含小孢子的悬浮液用400目孔 径的尼龙网过滤，收集滤液于IOmL离心管中，IOOOrpm离心;3min ；弃去上清液，重复2次； 用NLN培养基稀释小孢子，接种细胞密度1 X IO5 2X IO5个· mL—1，以每皿5mL小孢子悬 浮液分装入60mmX 15mm的无菌玻璃培养皿内，每皿添加100 μ L高温湿热灭菌后的琼脂糖 0. 5g · L—1、活性炭IOg · Γ1混合液；NLN培养基为含130g/L蔗糖，无任何激素的NLN培养 基，或在NLN培养基添加0. 05mg/L 0. 2mg/L的6-BA，或在NLN培养基添加0. 05mg/L 0. 2mg/L 的 6-BA 与 NAA。在C步骤中，诱导再生植株的MS培养基为含蔗糖30g/L，琼脂6. 5g/L 7. 5g/L，pH 值为5. 8 6. 0，无任何激素的MS培养基；D步骤中，生根培养基为MS培养基，含蔗糖30g/ L,琼脂 5. Og/L, ΝΑΑ0. 1 0. 2mg/L, pH 值为 5. 8 6. 0。本发明提供的芸薹属A基因组蔬菜新种质的应用方法将双单倍体品系直接作为 品种应用，或作为亲本与雄性不育系配制杂交组合，或者选两个自交不亲和系配制杂交组合。本发明的有益效果是1、与常规方法品种内杂交相比，采用芸薹属‘大白菜亚 种χ小白菜亚种’或‘小白菜亚种内变种χ变种’杂交，可以获得更多有利用价值的蔬菜 新类型。2、与常规连续多代自交的方法获得纯系比较，游离小孢子培养的方法培育纯系周 期短，效率高，一代就可以获得双单倍体纯系。3、游离小孢子方法获得的纯系间差异较大， 提高了获得符合育种目标纯系的机率。4、本发明获得的纯系，具有广阔的应用前景。
图1是亲本乌塌菜形态照片示意图。图2是亲本大白菜形态照片示意图。图3是‘大白菜与乌塌菜’的杂交种F1 (小孢子培养供体材料)形态照片示意图。图4是‘大白菜与乌塌菜’的杂交种F1小孢子培养获得的再生植株之一形态照片 示意图。图5是‘大白菜与乌塌菜’的杂交种F1小孢子培养获得的再生植株之二的形态照 片示意图。图6是‘大白菜与乌塌菜’的杂交种F1小孢子培养获得的再生植株之三形态照片示意图。
具体实施例方式本发明提供的获得芸薹属A基因组蔬菜新种质并应用于育种的方法包括‘大白 菜亚种X小白菜亚种’、‘小白菜亚种内变种X变种’杂交过程，游离小孢子培养过程，对小 孢子培养获得的再生植株倍性鉴定，对双单倍体、高倍体留种过程，种植再生植株的后代进 行形态鉴定、营养指标鉴定过程，配制杂交组合过程。具体方法步骤如下A、芸薹属‘大白菜亚种X小白菜亚种’或‘小白菜亚种内变种X变种’杂交过程 根据育种目标，确定亲本，开花期杂交，获得F1种子，种植F1,自交获得& ；亲本选定为大白 菜(见图2照片)、乌塌菜(见图1照片)、蕾用菜、矮脚黄。游离小孢子培养材料分别是‘大白菜X乌塌菜’(见图3照片)、‘乌塌菜X蕾用 菜’以及‘乌塌菜χ矮脚黄’，F1代以及F2代植株。B、游离小孢子培养过程从2009年9月初开始，每隔一个月分批对F1和F2种子催芽，萌动后进行2 4°C 低温处理20 25天，然后将萌动种子播于穴盘，5 6片叶时栽植于花盆在温室中培育。在 开花期进行游离小孢子培养，小孢子分离方法选取花瓣长度与花药长度比值为0. 5 0. 75 的未开放花蕾，以30个为一组，流水冲洗30min，经70%乙醇溶液表面消毒30s后，用0. 1 % HgCl2溶液消毒8min，用蒸馏水冲洗3次，每次5min。消毒后的花蕾放入灭过菌的小烧杯内， 加少量蔗糖含量为130g/Lm B5培养基，用无菌研棒碾压花蕾，挤出小孢子。含小孢子的悬 浮液用40 μ m孔径的尼龙网过滤，除出大组织块，收集滤液于IOmL离心管中，IOOOrpm下离 心3min。弃去上清液，沉淀物加5mLB5洗涤培养基，摇勻，IOOOrpm下离心3min。弃去上清 液，重复2次，所得沉淀物即为纯净小孢子。小孢子培养将纯化后的小孢子用NLN培养基稀 释，保持细胞密度IX IO5 2X IO5个以每皿5mL小孢子悬浮液分装入为60mmX15mm 的无菌玻璃培养皿内，每皿添加100 μ L高温湿热灭菌后的琼脂糖0. 5g/L、活性炭10g/L混 合液；用石蜡膜封口，先在33°C恒温箱中暗培养1天，，再转至25°C下静置暗培养。10 15 天后，肉眼可见胚状体出现，转移到40 60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25°C。 NLN培养基为含130g/L蔗糖，无任何激素的NLN培养基，或在NLN培养基添加0. 05mg/L 0. 2mg/L的6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)，或在NLN培养基添加0. 05mg/L 0. 2mg/L的6-BA与 ΝΑΑ(α-萘乙酸)。C、植株再生过程将子叶期胚状体接种到MS培养基上。于25°C，16h/8h光周期下培养。MS培养基 为含蔗糖30g/L，琼脂6. 5g/L 7. 5g/L，pH值为5. 8 6. 0，无任何激素的MS培养基，获得 再生植株。D、再生植株的生根及移栽小孢子胚状体形成的再生植株，自然生根的根系较弱，不易成活，需要进行人工诱 导生根，将其接种到MS培养基上，MS培养基含蔗糖30g/L，琼脂5. Og/L, ΝΑΑ0. 1 0. 2mg/ L, pH 值为 5. 8 6. 0。根系发育较好的植株移栽到温室。此时，温室内温度白天应为20 25°C，晚间温度应为5 10°C ；E、倍性鉴定过程经50 70天后，再生植株开始开花，鉴定再生植株倍性，单倍体植株用秋水仙碱 处理，使其加倍，双单倍体植株、高倍体植株保留；采用植株外部形态观察和花粉育性鉴定 的方法判断再生植株的倍性。花粉活力及花粉粒大小鉴定时，取即将开花的花蕾，剥取花药 置于洁净的载玻片上，加1 2滴TTC (2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染液，用镊子挤出花粉， 去除杂质，搅勻后盖上盖玻片，置于35°C恒温箱中，10 15min后镜检，每片随机取3个视 野，统计各视野中花粉粒总数与染红花粉粒数，计算花粉的染色率。经TTC染液染色变红的 花粉生活力强，为可育花粉；淡黄色及无色的活力较弱或没有活力，为不育花粉。F、对双单倍体植株、高倍体植株自交授粉，获得种子，同时测定亲和指数；G、种植双单倍体、高倍体自交种子，根据育种目标，鉴定植株株高、叶长、叶色等外 观性状，钙、镁、维生素C等营养指标，抗病、抗逆性；应用方法根据市场的需要将双单倍体品系直接作为品种应用，或作为亲本与雄 性不育系配制杂交组合，或者选两个自交不亲和系配制杂交组合。试验结果1、同基因型杂交组合小孢子培养胚诱导结果基因型是影响小孢子胚发生的重要因素，在培养基都是NLN时，供试材料均获得 了胚状体，但不同亲本杂交所得的F1代小孢子胚的诱导率差异很大(表1)，F2代由于各单 株间胚状体诱导率不同，未做统计分析。表1不同供体材料对小孢子胚状体诱导率的影响
权利要求
1.一种获得芸薹属A基因组蔬菜新种质的方法，主要步骤包括A、对芸薹属‘大白菜亚种X小白菜亚种’或‘小白菜亚种内变种X变种’蔬菜进行杂 交获得种子，种植F1并自交获得F2 ；B、在温室中培养F1和F2,F1和F2的种子经过2、°C低温处理2(Γ25天，在开花期对& 和F2代中筛选出的符合育种目标的植株进行游离小孢子培养，接种小孢子后需33°C暗培养 1天，再转至25°C培养箱静置暗培养10 15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到转数 为40 60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25°C ；C、将子叶期胚状体转接到MS培养基以获得再生植株；D、将再生植株接种到MS培养基上进行人工诱导生根，待再生植株生根后，移栽到温 室，温室温度白天应为20 25°C，夜间温度应为于5 10°C ；EJS 50-70天后，再生植株开始开花，鉴定再生植株倍性，单倍体植株用秋水仙碱处 理，使其加倍，双单倍体植株、高倍体植株保留；F、对双单倍体植株、高倍体植株自交授粉，获得种子，同时测定亲和指数；G、种植双单倍体、高倍体自交种子，根据育种目标，鉴定植株株高、叶长、叶色等外观性 状，钙、镁、维生素C诸营养指标，抗病、抗逆性。
2.根据权利要求1所述的获得芸薹属A基因组蔬菜新种质的方法，其特征是在B步 骤中，对F1和F2植株进行游离小孢子培养，选取花瓣长度与花药长度比值为0. 5 0. 75的 未开放花蕾，在超净工作台内表面灭菌后，用蒸流水冲洗3遍，倒入蔗糖浓度为130g/L的 B5培养基，挤碎花蕾，使小孢子游离出来，含小孢子的悬浮液用400目孔径的尼龙网过滤， 收集滤液于10 mL离心管中，1000 rpm离心3 min;弃去上清液，重复2次；用NLN培养基 稀释小孢子，接种细胞密度IX 105 2X IO5个· ml/1，以每皿5 mL小孢子悬浮液分装入60 mmX 15 mm的无菌玻璃培养皿内，每皿添加100 μ L高温湿热灭菌后的琼脂糖0. 5 g/L、活 性炭10 g/L混合液；NLN培养基为含130g/L蔗糖，无任何激素的NLN培养基，或在NLN培 养基添加0. 05 mg/L 0. 2 mg/L的6-BA，或在NLN培养基添加0. 05 mg/L 0. 2 mg/L的6-BA 与 NAA。
3.根据权利要求1所述的获得芸薹属A基因组蔬菜新种质的方法，其特征是在C步 骤中，诱导再生植株的MS培养基为含蔗糖30g/L，琼脂6. 5g/L 7. 5 g/L, pH值为5. 8 6. 0， 无任何激素的MS培养基；D步骤中，生根培养基为MS培养基，含蔗糖30g/L，琼脂5. Og/L, ΝΑΑ0. Γθ. 2mg/L, pH 值为 5. 8 6. 0。
4.一种如权利要求1所述获得芸薹属A基因组蔬菜新种质的应用方法将双单倍体品 系直接作为品种应用，或作为亲本与雄性不育系配制杂交组合，或者选两个自交不亲和系 配制杂交组合。
全文摘要
本发明公开了一种获得芸薹属A基因组蔬菜新种质及应用方法，通过对芸薹属A基因组“大白菜亚种×小白菜亚种”或“小白菜亚种内变种×变种”蔬菜间杂交种进行游离小孢子培养获得再生植株从而创造新种质并应用于育种的方法，主要步骤包括“大白菜亚种×小白菜亚种”、“小白菜亚种内变种×变种”蔬菜杂交过程，游离小孢子培养胚状体诱导过程，胚状体萌发获得再生植株过程，对小孢子培养获得的再生植株倍性鉴定过程，对双单倍体、高倍体留种过程，种植再生植株的后代进行形态鉴定、营养指标鉴定过程，配制杂交组合过程。该方法具有周期短、效率高的优点，为白菜类蔬菜高效育种提供了材料，具有广阔的应用前景。
文档编号A01H5/12GK102144560SQ201110041678
公开日2011年8月10日 申请日期2011年2月22日 优先权日2011年2月22日
发明者冀瑞琴, 冯辉, 刘志勇, 刘洋, 李承彧, 王爱杰, 王玉刚, 章云 申请人:沈阳农业大学