专利名称：RegIII/胰岛素原双基因质粒及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和基因治疗领域，具体涉及将含有RegIII基因和胰岛素原基因的双基因真核共表达质粒直接导入1型糖尿病小鼠体内，使之表达胰岛素原和RegIII蛋白，恢复机体自身免疫耐受状态并促进胰腺β细胞的再生，从而达到综合防治1型糖尿病目的的基因治疗技术。
背景技术：
1型糖尿病(T1DM)，又称胰岛素依赖型糖尿病，是T淋巴细胞介导的以胰腺β细胞进行性损伤和胰岛素分泌绝对不足为主要特征的自身免疫性疾病，易感性遗传背景和自身免疫耐受缺失是其发病的主要原因。
1型糖尿病的发病机制中，T淋巴细胞尤其是辅助性T淋巴细胞(Th)在胰岛炎性细胞募集、β细胞损伤过程中发挥着重要的作用。根据细胞因子的分泌模式，辅助性T淋巴细胞可分为Th1和Th2两个细胞亚群，Th1细胞亚群主要介导致病性免疫过程，其分泌的Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α和TNF-β等)多为炎症性细胞因子，可通过直接促进细胞凋亡和/或上调选择性粘附分子的表达，促进自身反应性T淋巴细胞在胰腺的浸润，导致β细胞的破坏；Th2细胞亚群则主要介导保护性免疫反应，分泌的Th2型细胞因子(IL-4-IL-6、IL-10和IL-13等)多具有抗炎效应。1型糖尿病患者胰腺β细胞损伤主要就是由针对胰岛自身抗原的Th1反应和细胞毒T淋巴细胞反应(CTL)所造成。正常生理状态下，体内Th1/Th2细胞通过自身或其他免疫细胞分泌的细胞因子进行自我调节和相互调节，以维持平衡状态；而在1型糖尿病患者体内，由于自身免疫耐受的缺失，Th1/Th2平衡失调，平衡向Th1方向偏移，即产生Th1漂移，Th1反应占绝对的优势，Th2反应处于弱势状态，从而导致了自身免疫性β细胞损伤，胰岛素分泌绝对不足。
RegIII和胰岛素原基因是1型糖尿病治疗中的两个关键靶点。Narendran等研究发现胰岛素原是1型糖尿病发病过程中唯一的β细胞特异性自身抗原，在驱动自身免疫性β细胞损伤过程中发挥着重要的作用。鼻内接种胰岛素原DNA疫苗可在NOD小鼠体内诱导CD4+调节性T细胞，阻止糖尿病的发生；过继转移编码胰岛素原的Gr-1+髓样前体细胞可在NOD小鼠体内抑制自身免疫性糖尿病。胰岛β细胞再生基因(Reg)是Akiyama T等在筛选再生胰岛来源cDNA文库时发现的新基因，其是促进β细胞再生的关键基因。Unno M.等通过基因靶向破坏RegIII基因观察到成年胰岛细胞数量显著减少，体内胰岛素水平明显下降，1型糖尿病的发病率显著增加。
目前治疗1型糖尿病常采用重建自身免疫耐受、胰岛或干细胞移植促进β细胞再生等方法。但研究表明，仅通过阻断1型糖尿病发病的单一环节而进行治疗的方法在作用效果方面存在着一定的局限性，单一用药难以达到安全有效治疗1型糖尿病的目的，且基于患者治疗期间遗传和病理学的异质性，寻找对所有患者均安全有效的治疗方法极为困难，因此治疗方法的联用，成为改善1型糖尿病治疗的合理设想。
发明内容
本发明的任务是提供一种包含胰岛素原基因(proinsulin)和胰岛β细胞再生III(RegIII)基因的双基因真核共表达质粒(RegIII/胰岛素原双基因质粒)及其构建方法，并提供RegIII/胰岛素原双基因质粒在治疗1型糖尿病中的应用。
实现本发明的技术方案是 本发明提供的包含胰岛素原基因(proinsulin)和胰岛β细胞再生(Reg)III基因的双基因真核共表达质粒，是在pBudCE4.1质粒的EF-1α启动子下游插入胰岛β细胞再生III(RegIII)基因，在CMV启动子下游插入胰岛素原基因构成的双基因真核共表达质粒，所述的胰岛β细胞再生III(RegIII)基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，所述的胰岛素原基因具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。
小鼠胰岛素原(proinsulin)基因序列(包含全部CDS序列)(该基因片段含Genebank NM_008387.3中第36-406个碱基序列) GCCTATCTTCCAGGTTATTGTTTCAACATGGCCCTGTGGATGCGCTTCCTGCCCCTGCTG GCCCTGCTCTTCCTCTGGGAGTCCCACCCCACCCAGGCTTTTGTCAAGCAGCACCTTTG TGGTTCCCACCTGGTGGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACA CACCCATGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGCACAACTGGAGCTGGGTGG AGGCCCGGGAGCAGGTGACCTTCAGACCTTGGCACTGGAGGTGGCCCAGCAGAAGCGT GGCATTGTAGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTG CAACTAG 小鼠胰岛β细胞再生(Reg)III基因序列(来源含小鼠RegIII基因的pCMV6-Kan/Neo质粒，北京Origene公司产品) GGAAGACAGACAAGATGCTGCCTCCAACAGCCTGCTCCGTCATGTCCTGGATGCTGCTC TCCTGCCTGATGCTCTTATCTCAGGTTCAAGGTGAAGACTCCCTGAAGAATATACCCTCC GCACGCATTAGTTGCCCCAAGGGCTCCCAGGCTTATGGCTCCTACTGCTATGCCTTGTTT CAGATACCACAGACCTGGTTTGATGCAGAACTGGCCTGCCAAAAGAGGCCTGGAGGAC ACCTCGTATCTGTGCTCAATAGCGCTGAGGCTTCATTCTTGTCCTCCATGGTGAAGAGAA CAGGAAACAGCTACCAATACACTTGGATTGGGCTCCATGACCCCACTCTGGGTGCAGAA CCCAATGGAGGTGGATGGGAATGGAGTAACAATGACGTGATGAATTACTTTAACTGGGA GAGGAACCCATCTACTGCCTTAGACCGTGCTTTCTGTGGCAGCTTGTCAAGAGCTTCTG GATTTCTAAAATGGAGAGATATGACATGTGAGGTGAAGTTGCCCTATGTCTGCAAATTTA CTGGTTAAACTTATCAGACAGCAAACATCCCGAATTTGTCTTGAAGAGCATCATGGACA AGGGACAAAATGTGAAGACTCACCTAGAAAAAGCATTTTCTATCTACAGTCCACATTAG AGCCTTAATCTGCTCTTTCCATATCTGTCTTTAGTCCTTTTGGTATAAGTTTGGGCTCAATT CTAAAATAAAAATAAGCTTTCTGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAA 本发明提供的这种包含胰岛素原基因(proinsulin)和胰岛β细胞再生III(RegIII)基因的双基因真核共表达质粒的构建方法是采用基因重组的方法，将RegIII基因和胰岛素原基因分别置于pBudCE4.1质粒载体中EF-1α和CMV启动子的调控下，获得RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒。将RegIII基因和胰岛素原基因分别置于pBudCE4.1质粒载体中EF-1α和CMV启动子的调控下的方法是将RegIII基因片段和胰岛素原基因片段分别插入到pBudCE4.1真核表达质粒的Kpn I/XhoI酶切位点之间和BamHI/PstI酶切位点之间。
本发明中，所述的胰岛β细胞再生III(RegIII)基因是按以下方法获取的选用限制性内切酶Kpn I和XhoI双酶切含RegIII基因的pCMV6-Kan/Neo质粒载体(北京Origene公司产品)获得RegIII基因片段。
本发明中，所述的胰岛素原基因是按以下方法获取的取小鼠的胰腺，用Trizol试剂提取总mRNA，逆转录为cDNA，以该cDNA为模板，用胰岛素原基因上游引物5’-3’CATACTGCAGGCCTATCTTCCAGGTTATTGTTTC(划线部分为Pst I酶切位点；下游引物5’-3’CGTCGGATCCCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGC(划线部分为BamHI酶切位点)扩增目的条带，目的片段长度为380bp，PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸50s，共34个循环；再72℃延伸10min。
将RegIII基因片段和胰岛素原基因片段分别插入到pBudCE4.1真核表达质粒的Kpn I/XhoI酶切位点之间和BamHI/PstI酶切位点之间的具体方法是同时用限制性内切酶Kpn I和XhoI双酶切pBudCE4.1空质粒载体(美国Invitrogen公司产品)，再用T4DNA连接酶连接RegIII基因和pBudCE4.1质粒载体，RegIII基因和pBudCE4.1质粒载体的摩尔比为5∶1，构建成含RegIII基因的单基因质粒；用限制性内切酶BamHI和PstI双酶切依上述胰岛素原基因制备方法所获得的PCR产物和含RegIII基因的单基因质粒，再用T4DNA连接酶以3∶1的摩尔比连接胰岛素原基因片段和含RegIII基因的单基因质粒载体，即构建成含RegIII、胰岛素原基因的双基因真核共表达质粒。
本发明提供的含RegIII、胰岛素原基因的双基因真核共表达质粒可用于治疗1型糖尿病。它能够直接肌肉注射治疗1型糖尿病。为寻找更为安全、有效的新型糖尿病治疗药物提供依据。
本发明将与1型糖尿病发病直接相关的两个关键基因——RegIII基因和胰岛素原基因通过基因重组的方法构建在同一个真核质粒表达载体pBudCE4.1上，以基因联合应用的形式，将重建免疫耐受和促进β细胞再生的治疗方法相结合，以期达到良好的治疗效果。通过大量的实验，我们发现RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒能够抑制T淋巴细胞增殖，恢复体内Th1/Th2细胞的平衡，减少胰腺β细胞损伤并促进其再生，恢复体内胰岛素的正常分泌，显著改善1型糖尿病小鼠的高血糖症状。
图1.真核表达质粒pBudCE4.1图谱，PCMV——巨细胞病毒启动子；PEF-1α——延伸因子1α亚基启动子；Zeocin——博来霉素。
图2.含RegIII基因的pCMV6-Kan/Neo质粒图谱。
图3.RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒的构建过程。
图4.RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒的酶切鉴定结果，图中M11kb DNA ladder；M2100bp DNA ladder；1限制性内切酶Kpn I/Xho I双酶切RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒；2RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒；3pBudCE4.1空质粒载体；4.限制性内切酶Bam HI/Pst I双酶切RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒。
图5.RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒在1型糖尿病小鼠肌肉组织中的表达情况，图A.为各组小鼠肌肉组织中RegIII、胰岛素原和β-actin的表达情况，其中1模型组；2pBudCE4.1空质粒载体对照组；3正常对照组；4RegIII/胰岛素原双基因共表达质粒组.n＝3，以两组间T检验进行比较，*P＜0.05，**P＜0.01vs pBudCE4.1空质粒载体组。图B.为各组小鼠肌肉组织中RegIII和胰岛素原蛋白表达相对强度，以β-actin作为内参，用目的蛋白条带的平均光强度值与β-actin条带的平均光强度值的比值表示各目的蛋白表达的相对强度。
图6.RegIII/胰岛素原双基因共表达质粒对T淋巴细胞增殖的影响，n＝6，以两组间T检验进行比较，*P＜0.05，**P＜0.01vs pBudCE4.1空质粒载体组。
图7.RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒对小鼠血清中Th1/Th2型细胞因子分泌的影响。通过测定小鼠血清中Th1、Th2型细胞因子的浓度间接反映体内Th1、Th2细胞的功能状态。其中IL-2、IFN-γ反映了Th1细胞亚群的功能；IL-10反映了Th2细胞亚群的功能。n＝6，以两组间T检验进行进行比较，*P＜0.05，**P＜0.01vs pBudCE4.1空质粒载体组；△△P＜0.01vs正常对照组。
图8.RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒对小鼠胰岛中炎症细胞浸润的影响，图中A.正常对照组；B.模型组；C.pBudCE4.1空质粒对照组；D.RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒组(放大倍数400×)。
图9.RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒对小鼠胰岛细胞凋亡的影响，图中A.正常对照组；B.模型组；C.pBudCE4.1空质粒对照组；D.RegIII/胰岛素原双基因共表达质粒组(放大倍数400×)。
图10.RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒对小鼠胰岛素分泌的影响，n＝6，以两组间T检验进行进行比较，*P＜0.05，**P＜0.01vs pBudCE4.1空质粒载体组；△P＜0.05，△△P＜0.01vs正常对照组。
具体实施方案 实施例1 RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒的构建及鉴定 选用限制性内切酶Kpn I和XhoI双酶切含RegIII基因的pCMV6-Kan/Neo质粒载体(北京Origene公司产品)以获得RegIII基因片段，同时用限制性内切酶Kpn I和XhoI双酶切pBudCE4.1空质粒载体(美国Invitrogen公司产品)，再用T4DNA连接酶以5∶1的摩尔比连接RegIII基因片段和pBudCE4.1质粒载体以构建含RegIII基因的单基因质粒。
取小鼠的胰腺，用Trizol试剂提取总mRNA，逆转录为cDNA后，以其为模板，用胰岛素原基因上下游引物(上游引物5′-3′CATACTGCAGGCCTATCTTCCAGGTTATTGTTTC(划线部分为Pst I酶切位点；下游引物5′-3′CGTCGGATCCCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGC(划线部分为BamHI酶切位点)扩增目的条带，目的片段长度为380bp。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸50s，共34个循环；再72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用限制性内切酶BamHI和PstI双酶切PCR产物和含有RegIII基因的单基因质粒，再用T4DNA连接酶以3∶1的摩尔比连接胰岛素原基因片段和含RegIII基因的单基因质粒载体以构建含RegIII、胰岛素原基因的双基因质粒。
RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒用限制性内切酶Kpn I和XhoI、BamHI和PstI分别于37℃双酶切，1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果发现所获得的酶切片段大小与预期结果相符，见图4，且Invitrogen(上海)生物技术有限公司DNA序列测定结果也表明所插入的基因确为RegIII和胰岛素原基因，从而证实含小鼠RegIII和胰岛素原基因的双基因真核共表达质粒(RegIII-proinsulin-pBudCE4.1)构建成功。
实施例2 1型糖尿病小鼠模型的建立及基因治疗方法 选择体重16-20g，6-8周龄的雄性SPF级Balb/c小鼠，采用小剂量STZ(40mg/Kg)连续5天腹腔注射的方法建立1型糖尿病小鼠模型，以小鼠餐后血糖大于16.7mmol/L为模型成功建立的判断标准。
成功建立1型糖尿病小鼠模型后，按照随机化分配原则将糖尿病小鼠随机分为模型组、pBudCE4.1空载体对照组(pBudCE4.1)和RegIII/胰岛素原双基因质粒组(RegIII-proinsulin-pBudCE4.1)，每组10只；另取10只未造模的Balb/c小鼠作为正常对照组。
在分组当天，RegIII/胰岛素原双基因组小鼠左后肢肌肉注射给予RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒100μg/只；pBudCE4.1空质粒对照组小鼠肌肉注射给予同等剂量的pBudCE4.1空质粒载体；模型组和正常对照组肌肉注射给予等体积的生理盐水。每周给药1次，连续给药4周，动态监测各组小鼠血糖的变化。
实施例3 RegIII/胰岛素原双基因共表达质粒对1型糖尿病小鼠血糖的影响 造模成功后，隔天测定各组小鼠的血糖，使用北京怡成生物电子科技有限公司生产的JPS-III型血糖测定仪进行测量。结果见表1，治疗4周后，pBudCE4.1空质粒对照组和模型组小鼠血糖均明显高于16.7mmol/L，且随着时间的演变而升高；给予RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒治疗1周后，糖尿病小鼠的高血糖症状得到了明显的改善(P＜0.01)，且继续给药3次后小鼠血糖呈持续下降并逐渐稳定的趋势。说明RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒能明显改善1型糖尿病小鼠的高血糖症状。
表1 RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒对1型糖尿病小鼠血糖的影响
n＝10，x±s.**P＜0.01vs pBudCE4.1空质粒对照组；△P＜0.05vs治疗前血糖水平. 实施例4 RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒在肌肉组织中表达产物的测定 取各组小鼠肌肉组织加入蛋白裂解液匀浆后离心取上清，每份样品经蛋白定量后加入SDS上样缓冲液沸水煮沸10min。以同等的蛋白上样量经SDS-PAGE电泳后半干法转NC膜，5％脱脂牛奶37℃封闭2小时，加入相应的一抗(RegIII一抗1∶250；胰岛素原一抗1∶1000；β-actin一抗1∶1000)4℃孵育12小时，1×TBST洗膜3次，每次10min，再加入相应的二抗(1∶1000)室温孵育2小时，1×TBST洗膜3次，每次10min，用ECL发光法(ECL试剂盒为Pierce公司产品)检测不同组小鼠肌肉中RegIII和胰岛素原蛋白的表达情况。凝胶图像分析系统对胶片进行扫描分析，并用目的蛋白条带的平均光强度值与β-actin条带的平均光强度值的比值表示该蛋白表达的相对强度。
结果显示，RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒组小鼠肌肉组织中RegIII蛋白和胰岛素原的表达显著强于注射给予pBudCE4.1空质粒治疗的小鼠(P＜0.01)，其中胰岛素原的表达量与正常对照组小鼠相仿，而RegIII蛋白的表达量甚至略高于正常对照组小鼠；空质粒对照组与模型组小鼠肌肉组织中RegIII和胰岛素原蛋白表达量差异不大，说明肌肉注射给予RegIII/胰岛素原双基因质粒可在小鼠肌肉组织中高表达相应的RegIII和胰岛素原蛋白。
实施例5 RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒对T淋巴细胞增殖的影响 各组小鼠处死后无菌取脾，研磨后无菌mesh网滤过，Ficoll液分层，以含10％胎牛血清的RPMI1640培养基制成淋巴细胞悬液，台盼蓝计数后，调整细胞浓度至1×107/mL。向96孔板每孔中加入100μl的脾淋巴细胞悬液，同时加入终浓度为5μg/ml的ConA溶液100μl，混匀后，于37℃，5％CO2浓度的培养箱中培养48小时，再向每孔中加入5mg/ml的MTT溶液20μl，于相同条件下继续培养4小时。再将96孔板离心后，去上清，加入150μlDMSO，充分振荡后用酶标仪测定其492nm波长处的吸光度值。结果显示，RegIII/胰岛素原双基因质粒组小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖效应明显低于pBudCE4.1空质粒载体组(n＝6，P＜0.01)，仅略高于正常对照组；而空质粒对照组与模型组相比并无明显差异。说明RegIII/胰岛素原双基因共表达质粒可抑制小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖反应。
实施例6 RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒对小鼠血清中Th1/Th2型细胞因子的影响 取各组小鼠的血液，5000rpm/min离心10min，取上清液即血清，按照ELISA试剂盒说明书检测血清中Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-10)的含量。结果显示，1型糖尿病小鼠由于体内自身免疫耐受的缺失，Th1/Th2反应的平衡状态被打破，血清中Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)的浓度明显高于正常对照组(P＜0.01)，而Th2型细胞因子IL-10的水平则显著低于正常对照小鼠(P＜0.01)。给予RegIII/胰岛素原双基因质粒治疗的1型糖尿病小鼠血清中IL-2、IFN-γ的浓度明显低于pBudCE4.1空质粒对照组(P＜0.01)；而IL-10(P＜0.05)的表达量则显著高于空质粒对照组，与正常对照组小鼠水平相似。pBudCE4.1空质粒对照组与模型组小鼠相比，血清中上述细胞因子的水平均无显著差异。说明RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒能够恢复1型糖尿病小鼠体内Th1/Th2反应的平衡，诱导自身免疫耐受状态的形成。
实施例7 RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒对小鼠胰岛中炎症细胞浸润的影响 取各组小鼠胰腺，中性甲醛固定后，用梯度酒精(由低浓度到高浓度)和二甲苯脱水透明后浸蜡包埋，将包埋好的蜡块切成4μm厚的薄片，贴片后制成切片。切片用二甲苯和梯度酒精(由高浓度到低浓度)脱蜡后浸入苏木精水溶液中染色数分钟，再放至酸水及氨水中分色数秒后用流水冲洗1小时，70％和90％酒精脱水各10分钟后，放入酒精伊红染色液中染色2-3分钟，切片用梯度酒精和二甲苯脱水透明后用树脂封片，于显微镜下观察各组小鼠胰腺胰岛中淋巴细胞的浸润情况。结果发现1型糖尿病模型组小鼠和pBudCE4.1空质粒对照组小鼠胰腺中均可见明显的淋巴细胞浸润，胰岛结构遭到破坏，与正常对照组相比有明显的不同；而RegIII/胰岛素原双基因治疗组胰腺中淋巴细胞的浸润情况则明显好于空质粒对照组，与正常对照组较为相似，说明RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒能够减少胰岛中炎性细胞的浸润，从而减少其对β细胞的损伤。
实施例8. RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒对小鼠胰岛细胞凋亡的影响 将制备的未染色切片于70℃恒温箱中烤片1小时，用二甲苯和梯度酒精(由高浓度到低浓度)脱蜡后，用蒸馏水洗片5分钟，加入蛋白酶K于37℃恒温箱中孵育20分钟，PBS洗片3次，每次5分钟；用滤纸吸去载玻片上组织周围多余液体，向组织上加入TdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应75分钟后用PBS于暗处洗片3次，每次5分钟；于荧光显微镜下观察凋亡细胞后，向切片上加入10％H2O2的甲醇溶液室温反应5分钟，PBS漂洗后，向组织上滴加辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体后于室温反应30分钟；用PBS漂洗后加入DAB反应10分钟，水洗，梯度酒精和二甲苯脱水透明后用树脂封片，于显微镜下观察各组小鼠胰岛中细胞的凋亡情况。结果显示pBudCE4.1空质粒对照组与模型组小鼠胰腺中可见很多典型的阳性凋亡细胞，被染成深棕色；而双基因质粒组小鼠胰腺中仅有少量凋亡细胞出现，明显少于空质粒对照组，仅略多于正常对照组。说明RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒能够减少自身β细胞的损伤，减少胰岛细胞的凋亡。
实施例9. RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒对血清中胰岛素水平的影响 取各组小鼠的血清，按照ELISA试剂盒说明书检测血清中胰岛素的水平。结果显示，给予RegIII/胰岛素原双基因质粒治疗后小鼠血清中胰岛素水平明显高于pBudCE4.1空质粒对照组(P＜0.05)，仅略低于正常对照组小鼠。而空质粒对照组与模型组小鼠血清胰中岛素水平相比，无明显差异，但均明显低于正常对照组(P＜0.01)。提示RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒可增加体内胰岛素的分泌，恢复β细胞的功能。
序列表
<110>华中科技大学
<120>RegIII/胰岛素原双基因质粒及其构建方法和应用
<130>/
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>360
<212>DNA
<213>小鼠
<400>1
gcctatcttc caggttattg tttcaacatg gccctgtgga tgcgcttcct gcccctgctg 60
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gtagatcagt gctgcaccag catctgctcc ctctaccagc tggagaacta ctgcaactag360
<210>2
<211>776
<212>DNA
<213>小鼠
<400>2
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<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<400>3
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<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<400>4
cgtcggatcc ctagttgcag tagttctcca gc 3权利要求
1.一种包含胰岛素原基因(proinsulin)和胰岛β细胞再生III(RegIII)基因的双基因真核共表达质粒。
2.根据权利要求1所述的包含胰岛素原基因(proinsulin)和胰岛β细胞再生(Reg)III基因的双基因真核共表达质粒，其特征在于，它是在pBudCE4.1质粒的EF-1α启动子下游插入胰岛β细胞再生III(RegIII)基因，在CMV启动子下游插入胰岛素原基因构成的双基因真核共表达质粒。
3.根据权利要求1或2所述的真核共表达质粒，其特征在于，所述的胰岛β细胞再生III(RegIII)基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的真核共表达质粒，其特征在于，所述的胰岛素原基因具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。
5.一种包含胰岛素原基因(proinsulin)和胰岛β细胞再生(Reg)III基因的双基因真核共表达质粒的构建方法，其特征是采用基因重组的方法，将RegIII基因和胰岛素原基因分别置于pBudCE4.1质粒载体中EF-1α和CMV启动子的调控下，获得RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的胰岛β细胞再生III(RegIII)基因是按以下方法获取的选用限制性内切酶Kpn I和XhoI双酶切含RegIII基因的pCMV6-Kan/Neo质粒载体(北京Origene公司产品)获得RegIII基因片段。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的胰岛素原基因是按以下方法获取的取小鼠的胰腺，用Trizol试剂提取总mRNA，逆转录为cDNA，以该cDNA为模板，用胰岛素原基因上游引物5’-3’CATACTGCAGGCCTATCTTCCAGGTTATTGTTTC(划线部分为Pst I酶切位点；下游引物5’-3’CGTCGGATCCCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGC(划线部分为BamHI酶切位点)扩增目的条带，目的片段长度为380bp，PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸50s，共34个循环；再72℃延伸10min。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，将RegIII基因和胰岛素原基因分别置于pBudCE4.1质粒载体中EF-1α和CMV启动子的调控下的方法是将RegIII基因片段和胰岛素原基因片段分别插入到pBudCE4.1真核表达质粒的Kpn I/XhoI酶切位点之间和BamHI/PstI酶切位点之间。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，将RegIII基因片段和胰岛素原基因片段分别插入到pBudCE4.1真核表达质粒的Kpn I/XhoI酶切位点之间和BamHI/PstI酶切位点之间的方法是同时用限制性内切酶Kpn I和XhoI双酶切pBudCE4.1空质粒载体(美国Invitrogen公司产品)，再用T4DNA连接酶连接RegIII基因和pBudCE4.1质粒载体，RegIII基因和pBudCE4.1质粒载体的摩尔比为5∶1，构建成含RegIII基因的单基因质粒；用限制性内切酶BamHI和PstI双酶切权利要求7所述方法获得的PCR产物和含RegIII基因的单基因质粒，再用T4DNA连接酶以3∶1的摩尔比连接胰岛素原基因片段和含RegIII基因的单基因质粒载体。(构建成含RegIII、胰岛素原基因的双基因真核共表达质粒。)
10.权利要求1至4中任一项所述的双基因真核共表达质粒在制备用于治疗1型糖尿病药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于1型糖尿病治疗的质粒，该质粒是通过基因重组方法构建的含有胰岛β细胞再生(Reg)III基因和胰岛素原基因的双基因真核共表达质粒，其中RegIII基因和胰岛素原基因可分别在pBudCE4.1质粒载体中EF-1α和CMV启动子的引导下进行表达。RegIII/胰岛素原双基因真核共表达质粒可通过恢复1型糖尿病患者体内自身免疫耐受状态和促进β细胞的再生而发挥降糖作用。
文档编号C12N15/10GK101768600SQ201010129180
公开日2010年7月7日 申请日期2010年3月22日 优先权日2010年3月22日
发明者向明, 侯文睿 申请人:华中科技大学