一种新型筛选标记玉米丝氨酸消旋酶基因应用于烟草转化技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织培养技术和植物基因工程领域，提供了一种玉米丝氨酸消旋酶基 因作为筛选标记在烟草遗传转化中的应用。
【背景技术】
[0002] 植物的遗传转化研宄主要是通过将具有优良性状的外源目的基因导入到植物基 因组中，用标记基因筛选出真正含有目的基因片段的转化体，并使其完整再生，通过这种方 式获得遗传性状改良的转化植株。其中标记基因可以在遗传转化中筛选和鉴定出转化的植 物细胞、植物组织和转基因植株，起到区分转化和非转化细胞的关键作用。依据筛选方法不 同可分为选择标记（selectivegene)和报告基因（reportergene)。选择标记基因通常是 指抗生素和除草剂抗性基因，而报告基因有葡萄糖苷酸酶基因（GUS)、荧光素酶基因（LUC) 和绿色荧光蛋白基因（GFP)等。出于对生态环境以及转基因食品的生物安全性等方面的考 虑，标记基因又可分为传统的选择标记基因（traditionalselectivemarkergene)和生 物安全性标记基因（biosafetymarkergene)。
[0003] 目前传统的选择标记基因分为抗生素类标记基因以及抗除草剂类标记基因。其 作用原理是通过在选择压力下筛选出来转化体。前者可以使抗生素失去活性，从而解除抗 生素对转化细胞在转录和翻译过程中的抑制作用，使转化细胞可以继续生长。其中卡那霉 素抗性（Kanamycin，Kan)基因是转基因植物中被广泛使用的一类标记基因，但由于卡那 霉素选择剂对一些植物的生长发育存在着严重的副作用，且选择效率低下。而抗除草剂类 标记基因能通过抵抗除草剂的杀灭作用，使得转化子从野生背景中富集出来，例如草丁膦 乙酰转移酶（phosphinothricinacetyltransferase，PAT)基因、2,4_D单氧化酶（2,4_D monooxygenase，tfdA)基因和5_稀醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS)基因等。但有些报道表示，释放转入抗除草剂 类标记基因的植物，很有可能会导致环境中除草剂施用量达到选择浓度，从而发生一系列 生物安全性问题，诸如基因漂流、生态平衡破坏和自然生物种群发生改变等。因此，这两类 标记基因对于环境均存在着潜在的生物安全性问题。
[0004] 丝氨酸消旋酶（SerineRacemase，SR)被发现存在于多种生物体中，是一种双 功能酶，同时具有消旋酶和脱水酶两种活性。基于丝氨酸消旋酶的起源和功能，可以将 丝氨酸消旋酶分为两类，第一类是细菌中的丝氨酸消旋酶，如鹤鸡肠球菌（Enterococcus Gallinarum，EG)和链霉菌属（StreptomycesGaryphalus，SG)。第二类是真核生物中的丝 氨酸消旋酶，如水稻、人类、小鼠、裂殖酵母、细胞粘菌等。这些真核生物中的丝氨酸消旋酶 属于II型5'-磷酸吡卩多酸酶（5'_pyridoxalphosphateenzyme，PLP)系，对PLP酶具有高 度的特异性。
[0005]由于体外添加的D-丝氨酸对植物有毒害作用，植物体内能够去除D-丝氨酸毒性 的酶如D-丝氨酸消旋酶，对植物具有解毒的功能，因此D-丝氨酸消旋酶可以作为植物核基 因组转化的筛选标记。玉米丝氨酸消旋酶（maizeserineracemase，SR)是一类依赖PLP型 酶，同时具有消旋酶和脱水酶的两种活性。目前发现D-丝氨酸消旋酶能够介导植物开花。 因此它更适合作为杨树的转基因筛选标记。可以将ZmSR作为一种新型的无抗性筛选标记 基因，D-丝氨酸作为筛选试剂来筛选转基因植株，具有潜在的生产应用价值，为ZmSR作为 筛选标记的可行性提供依据。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种玉米丝氨酸消旋酶基因及其表达载体，以及该基因作为 筛选标记应用于烟草遗传转化。
[0007] 本发明所涉及的设计方案为一种玉米丝氨酸消旋酶基因，ZmSR通过B73自交系三 叶期cDNA为模板克隆获得，经过测序其为1014bp，与NCBI网站公布的玉米丝氨酸消旋酶基 因（NM_001143〇28. 1)序列一致。
[0008] 本发明还提供了一种玉米丝氨酸消旋酶基因表达的载体，其特征在于能作为筛选 标记在烟草遗传转化中的应用。利用前述的玉米丝氨酸消旋酶基因将替换双元表达载体 PCAMBIA1301上的⑶S标记基因，将该载体命名为pBI1301-ZmSR。本研宄利用玉米丝氨酸 消旋酶基因，通过农杆菌介导法将pBI1301-ZmSR和含有⑶S基因的pBI121载体分别转入 烟草叶片及愈伤组织。通过对烟草培养基条件的筛选，优化了烟草叶片最佳诱导愈伤的培 养基为：MS+6-BA0. 5mg/L+NAA2.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6g/L。该培养基的诱导愈伤的 诱导率为100%，并且速度最快，愈伤增殖的效果最好。以ZmSR为目的基因，以GUS作为对 照基因，分别用D-丝氨酸和Kan作为筛选试剂，对未转化植株进行Kan和D-丝氨酸抗性临 界浓度的筛选。对烟草叶片进行Kan及D-丝氨酸的抗性敏感性试验，分别确定临界浓度为 50mg/L和12mM。对烟草愈伤组织进行Kan及D-丝氨酸的抗性敏感性试验，分别确定烟草 愈伤组织的临界浓度为30mg/L和6mM。经分子检测由叶片筛选获得的pBI1301-ZmSR抗性 苗有3株为阳性植株，由愈伤组织获得的抗性苗有6株为阳性植株。
[0009] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种玉米丝氨酸消旋酶基因。
[0010] 在另一个实施方案中，本发明提供了所述基因作为筛选标记在烟草遗传转化中的 应用。
[0011] 在其他实施方案中，本发明提供了包含所述玉米丝氨酸消旋酶基因的植物表达载 体。在一个实施方案中，所述载体是用所述玉米丝氨酸消旋酶基因取代植物双元表达载体 PCAMBIA1301上的⑶S基因，从而构建得到的植物表达载体。在另一实施方案中，所述植物 表达载体能作为一种筛选标记基因在烟草遗传转化应用。
[0012] 有益效果：本发明提供的一个玉米丝氨酸消旋酶能作为一种筛选标记基因在烟草 遗传转化应用，第一次应用于烟草的遗传转化体系中，较卡那霉素作为筛选标记的转化体 系，不仅能筛选得到阳性抗性苗，具有低污染率、高分化率，由于该基因有降解植株体内的 D-丝氨酸毒素功能，对植物生长和环境又具有安全无危害。因此，该基因作为一种无抗性筛 选标记基因筛选转基因植株，具有潜在的生产应用价值。
【附图说明】
[0013] 图1烟草叶片分化对Kan及D-丝氨酸敏感性试验
[0014]A，卡那霉素叶片分化抗性筛选结果；B，D-丝氨酸叶片分化抗性筛选结果
[0015] 图2含有⑶S基因的pBI121和pBI1301-ZmSR载体分别转化烟草叶片及愈伤组织 的对比性试验
[0016]A，转化烟草叶片对比性试验的结果；B，转化烟草愈伤组织对比性试验结果
[0017] 图3转基因植株PCR检测结果
[0018] A基因组特异引物扩增电泳图谱（叶片筛选）
[0019] M，DL2000 ;1，为未转化植株叶片基因组（阴性对照）；2,为重组质粒（阳性对照）； 3-7,为D-丝氨酸抗性植株叶片基因组；
[0020] B叶片基因组特异引物扩增电泳图谱（愈伤筛选）
[0021]M，DL2000;1:为重组质粒（阳性对照）；2,为未转化植株叶片基因组（阴性对照）； 3-10:为D-丝氨酸抗性植株叶片基因组
[0022] 图4转基因烟草的表型形状的观察
[0023]A，转基因烟草一个月表型；B，转基因烟草三个月表型
[0024]ZmSR，pBI1301-ZmSR载体烟草；CK，未转基因植株；⑶S，转含有⑶S基因的pBI121 载体烟草
[0025] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
【具体实施方式】
[0026] 所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上海生工公司测序；Taq酶、 Trans5a感受态及相关的试剂盒购置北京全式金公司；限制性内切酶NcoI和BstpI，T4 连接酶购自TaKaRa公司；相应的抗生素来自上海生工和SIGMA公司；其余试剂均为国产分 析纯。本研宄所用的含有GUS基因的pBI121载体以及根癌农杆菌LBA4404由本实验室保 存，双元表达载体PCAMBIA1301由生命科学学院作物生物重点实验室惠赠。下述实施例中 所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0027] 实施例1.载体构建与转化
[0028] 以玉米B73自交系三叶期