用于hbv治疗反应的生物标记物的制作方法

用于hbv治疗反应的生物标记物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及预测乙型肝炎病毒(HBV)感染患者对药物治疗的反应的有用的方法。
【专利说明】用于HBV治疗反应的生物标记物
[0001] 本发明涉及用于预测乙型肝炎病毒(HBV)感染患者对药物治疗反应的方法。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒(HBV)感染全世界3.5-4亿人;每年记录一百万人死于归因于感染的 肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌。感染剂（乙型肝炎病毒(HBV))是可以经皮肤、性和围产期 传播的DNA病毒。在亚洲的感染患病率（彡8%)大幅高于欧洲和北美（〈2%) (Dienstag J.L.，!fepatitis B Virus Infection.，N.Engl.J.Med.2008;359:1486-1500)。在亚洲围产 期从受感染的母亲获得HBV的发病率更高，在那些暴露的人中>90 %导致慢性感染(WHO资料 单204号；2008年8月修订）。此外，在儿童期间成为慢性感染的成年人中25 %死于HBV相关的 肝癌或肝硬化(WHO资料单204号；2008年8月修订）。干扰素 a(IFNa)是抗病毒途径有力的活 化剂，另外介导许多免疫调节功能(Muller U. ,Steinhoff U. ,Reis L.F.等人,Functional role of type I and type II interferons in antiviral defense,Science 1994；264: 1918-21)。
[0003] 在两个大规模关键性研究中证实了剂量isoyg/周的PEGASYS?(聚乙二醇化 INFa2a 40KD，Peg-IFN)在治疗HBV中的效力。一个研究在HBeAg阴性患者(WV16241)中、另一 个在HBeAg阳性患者中（WV16240)。
[0004] WV16241是在2001年6月和2003年8月之间进行的；552例HBeAg阴性CHB患者被随机 分至丨」3个治疗组之一:PEG-IFN单一疗法、PEG-IFN联合拉米夫定或仅拉米夫定，持续48周。治 疗停止后24周评估的病毒学应答(定义为HBV DNA〈20,000拷贝/mL)在接受PEG-IFN的组中 是可比较的（43%和44%)，两组均优于拉米夫定组（29%)(Marcellin P.，Lau G.K., Bonino F·等人，Peginterferon alfa-2a alone , lamivudine alone ,and the two in combination in patients with HBeAg-negative chronic hepatitis B, N.Engl.J.Med.2004;351:1206-17)。
[0005] 研究WV16240在2002年I月和2004年I月之间进行。在这项研究中，814例HBeAg阳性 CHB患者被随机分配到与WV16241相同的治疗组，即PEG-IFN单一疗法、PEG-IFN联合拉米夫 定或仅拉米夫定，持续48周。治疗停止后24周评估的应答显示，PEG-IFN单一疗法组中HBeAg 血清学转换为32%，相比之下，PEG-IFN+拉米夫定和拉米夫定单一疗法分别为27%和19% (Lau G.K. ,Piratvisuth T, .Luo K·X.等人，Peginterferon Alfa-2a,Lamivudine ,and the Combination for HBeAg-Positive Chronic Hepatitis B,N.Engl.J.Med.2005；352: 2682-95)。受控的HBV临床研究的Meta分析表明，含有PEG-IFN的治疗在CHB患者中促进显著 的HBsAg清除或血清学转换，超过拉米夫定方案（Li W.C.，Wang M.R.，Kong L.B.等人， Peginterferon alpha-based therapy for chronic hepatitis B focusing on HBsAg clearance or seroconversion:a meta-analysis of controlled clinical trials,BMC Infect.Dis.2011；11:165-177)〇
[0006] 最近，Neptune研究(WV19432)在2007年5月和2010年4月之间进行，其比较了HBeAg 阳性患者中以90或180yg/周施用、施用24周或48周的PEG-IFN(Liaw Y.F.，Jia J.D. ,Chan H. L ·等人，Shorter durations and lower doses of peginterf eron alfa~2a are associated with inferior hepatitis B e antigen seroconversion rates in hepatitis B virus genotypes B or C,Hepatology 2011 ;54:1591-9) 〇在治疗结束后24 周确定功效。这项研究证明了较低剂量和较短的治疗持续时间两者劣于之前在WV16240研 究中使用的批准的剂量和持续时间，从而确认了批准的治疗方案，即ISOyg/周、持续48周对 HBeAg阳性CHB患者最有益。
[0007] 然而，虽然PEG-IFN已经成功用于CHB治疗的事实，但是宿主因素(遗传性的和非遗 传性的)和病毒因素对治疗反应的影响知之甚少。
[0008] 虽然病毒和环境因素在HBV发病中起重要作用，遗传影响明显存在。在小的遗传学 研究表明宿主免疫/炎症因素 (如HLA，细胞因子，抑制分子)可能在HBV感染的结果中产生影 响的同时，全基因组关联研究(GWAS)清楚地证明，在日本和泰国HBV人群中，跨越人类白细 胞抗原(HLA)-DP基因区的11个单核苷酸多态性(SNP)与持续性慢性乙肝病毒携带者的发展 显著相关（Kamatani Y. ,ffattanapokayakit S . ,Ochi H.等人，A genome-wide association study identifies variants in the HLA-DP locus associated with chronic hepatitis B in Asians.Nat.Genet.2009;41:591_595)。随后这个发现也在使用 基于TaqMan的基因分型测定法的单独的中国人群研究中被证实(Guo X. ,Zhang Y. ,Li J. 等人，Strong influence of human leukocyte anti gen (HLA)-DP gene variants on development of persistent chronic hepatitis B virus carriers in the Han Chinese population ,Hepatology 2011; 53:422-8)。此外，单独的GWAS和复制分析得出相 似结果的结论，在日本和韩国人群中HLA-DP基因座与抗持续HBV感染的保护作用有显著的 相关性（Nishida N. ,Sawai H. ,Matsuura K ·等人，Genome-wide association study confirming association of HLA-DP with protection against chronic hepatitis B and viral clearance in Japanese and Korean.PLos One 2012;7:e39175) 〇最后，发现 HLA-DQ基因座内的两个其他的SNP(rs2856718和rs7453920)对CHB易感性有独立于HLA-DQ 变体的作用（Mbarek H.，0chi H. ,Urabe Y.等人，A genome-wide association study of chronic hepatitis B identified novel risk locus in a Japanese population, Hum.Mol.Genet. 2011; 20:3884-92)。总之，稳定的遗传学证据表明，在亚洲人群，HLA区的多 态性变异显著影响急性感染后慢性乙型肝炎的进展。
[0009] 受控的HBV临床试验的Meta分析表明，传统的含IFNa-或聚乙二醇化IFNa(2a或2b) 的治疗在CHB患者中促进显著的HBsAg清除或血清学转换，超过拉米夫定方案（Li W.C.， Wang M. R. , Kong L · B ·等人，Peginterferon alpha-based therapy for chronic hepatitis B focusing on HBsAg clearance or seroconversion:a meta-analysis of controlled clinical trials,BMC Infect.Dis.2011;ll:165_177)。然而，尽管Peg-IFN已 经成功用于CHB治疗中的事实，关于治疗反应和单核苷酸多态性(SNP)水平上的宿主因素的 影响之间的关系还知之甚少。聚乙二醇化干扰素 α，与利巴韦林组合(RBV)已成功用于慢性 丙型肝炎病毒（HCV)感染的治疗。通过全基因组关联研究（GWAS)，在HCV患者如何对Peg-IFN/RBV治疗反应中的一个重大科学发现是，围绕19号染色体上基因 IL28B的遗传多态性与 治疗结果密切相关(Ge D. ,Fellay J. ,Thompson A.J.等人,Genetic variation in IL28B predicts hepatitis Ctreatment-induced viral clearance,Nature 2009；461:399- 401;Tanaka Y. ,Nishida N. ,Sugiyama Μ·等人，Genome-wide association of IL28Bwith response to pegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C，Nat.Genet.2009;41:1105_9;Suppiah V.,Moldovan M.,Ahlenstiel G.等 人，IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy，Nat. Genet .2009; 41:1100-4) 〇IL28B编码的蛋白质是111型IFN (IFN-X3)，其与在相同染色体区的IL28A和IL29形成细胞因子基因簇JL28B可以由病毒感 染引起，并具有抗病毒活性。然而，在用Peg-IFN治疗的CHB患者中，围绕IL28B区的特定SNP (例如rsl2989760， rs8099917，rsl2980275)与治疗反应的相关性的数据有限，有些相互矛 盾（Lampertico P . ,Vigano M. , Cheroni C.等人，Genetic variation in IL28B polymorphism may predict HBsAg clearance in genotype D,HBeAg negative patients treated with interferon alfa，AASLD 2010;Mangia A.，Santoro R.,Mottola 等人，Lack of association between IL28B variants and HBsAg clearance after interferon treatment ,EASL 2011 ；de Niet A. ,Takkenberg R.B. ,Benayed R.等人， Genetic variation in IL28B and treatment outcome in HBeAg-positive and- negative chronic hepatitis Bpatients treated with Peg interferon alfa_2a and adefovir,Scand.J.Gastroenterol.2012,47:475-81；Sonneveld M.J.,Wong V.ff., Woltman A.M. ,Polymorphisms near IL28B and serologic response to peginterferon in HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B， Gastroenterology 2012；142:513-520)〇
[0010] IL28B基因型预测慢性丙型肝炎中对基于聚乙二醇化干扰素 (Peg-IFN)的疗法的 反应Aolmes等人调查了在主要的亚洲CHB人群中IL28B基因型是否与Peg-IFN治疗结果相 关。确定了96例患者的IL28B基因型（Holmes等人，IL28B genotype is not useful for predicting treatment outcome in Asian chronic hepatitis B patients treated with pegylated interferon_alpha，J.Gastroenterol.Hepatol·，2013,28(5):861-6)〇 88%是亚洲人，62%为HBeAg阳性，13%为METAVIR F3-4期。随访时间中值为39.3个月。大多 数患者携带CC IL28B基因型（84%hIL28B基因型没有根据HBeAg状态而不同。在27%的 HBeAg阳性和61 %的HBeAg阴性患者获得主要终点（primary endpoint)。IL28B基因型与任 一组的主要终点之间没有相关性。此外，在仅HBeAg消失、HBsAg消失、ALT正常化或治疗的 HBV DNA水平上没有根据IL28B基因型而不同。
[0011]使用在CHB患者(Peg-IFN治疗的且有明确临床结果的患者)采集的全血样本，非常 有道理的是，对宿主遗传因素如何影响治疗反应和HBV疾病生物学的理论理解，将极其有益 于鉴别可能对Peg-IFN治疗反应的患者的未来临床实践，以及极其有益于开发新的HBV药 物。

【发明内容】

[0012] 本发明提供了用于鉴别对使用抗HBV试剂（如干扰素）的抗HBV治疗反应的患者的 方法。
[0013] 本发明的一个实施方案提供了鉴别可以从包含干扰素的抗HBV疗法的治疗中受益 的患者的方法，该方法包括:确定从患者获得的样品中21号染色体上SON基因中单核苷酸多 态性的存在，其中在rsl3047599上至少一个G等位基因的存在表明患者可以受益于使用抗 HBV治疗的治疗。
[0014] 本发明进一步的实施方案提供了预测HBV感染患者对使用包含干扰素的抗HBV疗 法的治疗的反应性的方法，该方法包括:确定从患者获得的样品中21号染色体上SON基因中 单核苷酸多态性的存在，其中在rsl3047599上至少一个G等位基因的存在表明患者更可能 对使用抗HBV治疗的治疗反应。
[0015] 仍然，本发明另一个实施方案提供了用于确定HBV感染患者将从包含干扰素的抗 HBV治疗中显示受益的可能性的方法，该方法包括:确定从患者获得的样品中21号染色体上 SON基因中单核苷酸多态性的存在，其中在rsl3047599上至少一个G等位基因的存在表明患 者具有增加的从抗HBV治疗受益的可能性。
[0016] 甚至本发明的另一个实施方案提供了用于优化包含干扰素的抗HBV治疗的疗效的 方法，该方法包括:确定从患者获得的样品中21号染色体上SON基因中单核苷酸多态性的存 在，其中在rsl3047599上至少一个G等位基因的存在表明患者具有增加的从抗HBV治疗受益 的可能性。
[0017] 本发明进一步的实施方案提供了用于在患者中治疗HBV感染的方法，该方法包括： (i)确定从患者获得的样品中21号染色体上SON基因中在rsl3047599上至少一个G等位基因 的存在，（ii)向所述患者施用有效量的包含干扰素的抗HBV治疗，由此治疗HBV感染。
[0018] 仍然，本发明另一个实施方案提供了用于预测感染HBV的HBe阳性患者在治疗随访 的> =24周，对干扰素治疗的HBeAg血清学转换和HBV DNA〈2000IU/ml (反应者vs.无反应者） 的方法，该方法包括：（i)提供来自所述人类受试者的样品，检测21号染色体上SON基因中单 核苷酸多态性的存在，和（ii)如果在rsl3047599上存在至少一个G等位基因，确定所述患者 对干扰素治疗具有高的反应率，测定为在治疗随访的> = 24周HBeAg血清学转换和HBV DNA〈 2000IU/ml (反应者vs.无反应者）。
[0019]在一些实施方案中，干扰素选自聚乙二醇化干扰素 a-2a、聚乙二醇化干扰素 a-2b、 干扰素 a_2a和干扰素 a-2b。
[0020] 在一些实施方案中，干扰素是具有下式的聚乙二醇化干扰素 a-2a缀合物：
[0021]
[0022] 其中R和R'是甲基，X是NH，n和η'独立地或二者是420或520。
【附图说明】
[0023]图1:GWAS标记物集合中按染色体的标记物数目的条形图。由于不知道基因组位 置，另外1095个标记物没有绘制。
[0024]图2:祖先分析的陡坡图。很明显，大多数信息（最高特征值)从祖先的前两个主成 分得到，在第五主成分后有很少量信息获得。
[0025]图3:仅HapMap项目个体的祖先的前3个主成分。人口编码如表2所列。图3示出了仅 用于HapMap项目参照数据的PCA的结果。可见五个聚类，对应五大生物地理的祖先来源。从 左上方顺时针方向阅读，它们分别是:非洲裔(蓝/橙/粉红色/栗色）、南亚裔(灰色）、东南亚 (黄/蓝/绿）、墨西哥(深绿色)和北欧和西欧(蓝/红色）。
[0026]图4:HapMap项目个体的祖先的前三个主成分;根据人群组着色(表2)。重叠的是自 报为"东方"（黑色十字）或其他种族组(灰色十字）的患者，仅HapMap项目个体的祖先的前3 个主成分。人群代码如表2所列。
[0027] 图5:终点（endpoint)l的曼哈顿图（Manhattan Plots)
[0028] 图6:终点2的曼哈顿图 [0029]图7:终点4的曼哈顿图
[0030]图8:优势模式下rsl3047599的反应率(终点1)的条形图。
[0031]图9:优势模式下rsl2000的反应率(终点4)的条形图。
[0032]图10:优势模式下r s 1913228的反应率(终点4)的条形图。
[0033]图11:优势模式下rsl2636581的反应率(终点4)的条形图。
[0034] 本发明的详细描述
[0035] 定义
[0036] 为了便于本发明的理解，许多术语如下定义。本文所定义的术语具有如本发明相 关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语如"一个(a)"、"一个(an)"和"该(the)"不意 图仅指单数的实体，而是包括通用的一类，其中具体的实例可用于说明。本文的术语用于描 述本发明的具体实施方案，但它们的使用并不限定本发明，除非在权利要求中指出。
[0037] 术语"样品"或"生物样品"是指从个体分离的组织或流体样品，包括但不限于，例 如，组织活检，血浆，血清，全血，脊髓液，淋巴液，皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外区 段，泪液，唾液，乳汁，血细胞，肿瘤，器官。此外，还包括体外细胞培养成分的样品（包括但不 限于，从在培养基中生长的细胞得到的条件培养基、推定的病毒感染的细胞、重组细胞和细 胞组分）。
[0038] 术语"干扰素 "和"干扰素 α"在本文中可互换使用，是指高度同源的物种特异性蛋 白质的家族，其抑制病毒复制和细胞增殖及调节免疫反应。典型的合适的干扰素包括但不 限于：重组干扰素 a_2b，如从Schering Corporation ,Kenilworth ,N.J.可获得的 111(1*011@14干扰素，重组干扰素 (：1-23，如从!1€^11^1111-]^11?〇(3116，_1:167，1]\可获得的 R〇fer〇n?-A·干扰素，重组干扰素 a-2C，如从Boehringer Ingelheim Pharmaceutical， 1]1(3.，1^(^;^61(1，(：〇1111.可获得的；86.1<_0&1"<逸) (：12干扰素，干扰素 (1-111，一种纯化的天然€[干 扰素的混合物，如从 Sumitomo ,Japan 可获得的 Slimiferon? 或从 Glaxo-Wel lcome Ltd.， London，Great Britain可获得的WeUferotI⑧T1扰素 a-nl(INS)，或共有α干扰素，如在美 国专利号4，897，471和4，695，623 (特别是实施例7，8或9)中描述的那些和从Amgen，Inc .， Newbury Park,Calif可获得的特定产品，或干扰素 α-η3,一种由Interferon Sciences生产 的并从Purdue Frederick Co. ,Norwalk, Conn.可获得的天然α干扰素的混合物，商品名 Alferon。优选使用干扰素 a_2a或a_2b。干扰素可以包括如下所定义的聚乙二醇化干扰素。
[0039] 术语"聚乙二醇化的干扰素"、"聚乙二醇化干扰素 α"和"聚乙二醇化干扰素"在本 文中可互换使用，是指干扰素 α(优选干扰素 a_2a和a-2b)的聚乙二醇修饰的缀合物。典型的 合适的聚乙二醇化干扰素 a包括但不限于，Pegasys?和Peg-Intron:?。
[0040] 如本文所用，术语"等位基因"和"等位基因变体"是指基因的替代形式，包括与基 因或其部分相关的内含子、外显子、内含子/外显子接头和3'和/或5'非翻译区。一般地，等 位基因在同源染色体上占据相同的基因座或位置。当客体具有基因的两个相同等位基因 时，客体被认为是该基因或等位基因的纯合子。当客体具有基因的两个不同等位基因时，客 体被认为是该基因的杂合子。特定基因的等位基因可以在单核苷酸、若干个核苷酸上彼此 不同，且可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。
[0041] 如本文所用的术语"多态性"是指核酸(包括外显子和内含子）的多于一种形式的 共存，或其部分(例如，等位基因变体）。有至少两种不同形式（即，两种不同的核苷酸序列） 的基因的部分，称为该基因的多态性区。多态性区可以是单核苷酸，即，"单核苷酸多态性" 或"SNP"，其标识（identity)在不同的等位基因中不同。多态性区也可以是几个核苷酸长。 [0042]用于检测多态性的多种方法是已知的，并且可以结合本发明使用。通常，这些方法 包括可直接(例如，原位杂交)或间接(识别对第二分子，例如，蛋白质序列或蛋白质的结合 的变化)鉴别以根本核酸序列的一个或多个突变。
[0043]用于检测多态性的一个公知的方法是使用探针的等位基因特异性杂交，所述探针 与突变或多态性位点重叠、并在突变或多态性区周围具有约5,10，20,25或30个核苷酸。对 于试剂盒中的使用，例如，提供了用于用户的能够特异性杂交等位基因变体(如单核苷酸多 态性)的几种探针，或者甚至附着于固相支持物，例如珠或芯片。
[0044] 单核苷酸多态性，"rs13047599"是指通过SNP数据库（dbSNP， www. ncbi . nlm.nih. gov/SNP/)中由其登录号识别的SNP，其位于人21号染色体SON DNA结合 蛋白质基因上。
[0045] 缩略语
实施例
[0048] 目的和终点
[0049] 目的是确定慢性乙型肝炎患者中与对含派罗欣的方案治疗的反应相关的遗传变 体。
[0050] 考察了患者组中以下的终点。
[0051 ] HBe阳性患者:
[0052] 1 .> = 24周随访的HBeAg血清学转换(反应者VS无反应者）
[0053] 2.> = 24周随访的耶6六8血清学转换以及耶￥0嫩〈200011]/1111(反应者￥8无反应者）
[0054] 3 .> = 24周随访的HBsAg损失或血清学转换(反应者VS无反应者）
[0055] 以上终点的列表在下文中将分别被称为终点1-3。
[0056] HBe阴性患者:
[0057] 4·> = 24周随访的HBV DNA〈2000IU/ml(反应者vs无反应者）
[0058] 后者应被称为终点4。
[0059] 还分析了 HBe阳性和HBe阴性患者组合组中的终点3和4。
[0060]对于所有终点和所有标记物，针对相关性存在的双面替代方案测试了基因型和终 点之间无关联的零假设。
[0061 ] 研究设计
[0062]进行了来自公司赞助的临床试验数据以及来自全科护理的患者的数据的累积 meta分析。在最后的分析中组合的数据将包括至多1500名患者，其接受了至少24周的派罗 欣治疗，有或没有核苷酸/核苷类似物，并可获得24周的随访数据。
[0063]考虑包含下面的试验/患者来源：
[0064] · RGT(ML22266)
[0065] · S-Collate(MV22009)
[0066] * S〇N(MV22430)
[0067] · Switch(ML22265)
[0068] ?Combo
[0069] · New Switch(ML27928)
[0070] . NEED
[0071] ?意大利人群 PEG .Be .Liver
[0072] · Teerha教授(泰国）：临床实践患者和一些遗留Ph3患者
[0073] ?张鸿飞教授（中国北京）：临床实践患者和一些遗留Ph3患者
[0074] ?谢瑶教授(中国北京）：临床实践患者
[0075] ?陈新悦教授(中国北京）：临床实践患者
[0076]患慢性乙型肝炎的成年患者（男性或女性患者彡18岁）必须满足下列研究入门条 件：
[0077] ?以前参加罗氏研究，并用Peg-IFN土核苷酸类似物（拉米夫定或恩替卡韦 (entacavir))或Peg-IFN土核苷酸类似物(adefovir (阿德福韦））治疗慢性乙型肝炎至少24 周，具有多24周的治疗后随访，或；
[0078] ?按照护理标准在用Peg-IFN的慢性乙型肝炎的一般实践中治疗，并符合当前的 产品特性简介(SPC)/本地标签，根据本地标签没有Peg-IFN疗法的禁忌症，并已用Peg-IFN 治疗至少24周，具有在血液采集的时间点可获得的多24周的治疗后反应。
[0079] ?患者未感染过HAV、HCV或HIV。
[0080] ?患者应提供以下医疗记录(或者来自历史/正在进行的研究数据库，或者来自医 疗实践笔记）：
[0081 ] ?人□统计(例如年龄、性别、种族来源）
[0082] ?治疗前HBeAg状态，已知或未知的HBV基因型
[0083] ?随时间通过PCR试验定量HBV DNA(IlVml)(例如基线，治疗中：12和24周，治疗 后:24周）
[0084] ?随时间定量检测HBsAg(如果不可获得，则定性检测HBsAg)和抗-HBs(例如基线， 治疗中：12和24周，治疗后:24周）
[0085] ?随时间的血清ALT(例如基线，治疗中：12和24周，治疗后:24周）
[0086] 值得注意的是，所有患者会收到积极的方案。
[0087] 分析人群
[0088] 多数患者将来自中国。用于统计分析的目的，四个分析群体如下定义。
[0089] · PGx-FAS是具有至少一个基因型的所有患者
[0090] · PGx-GT是PGx-FAS的亚群，其遗传数据通过质量检查
[0091] · PGx-CN是PGx-GT的亚群，其享有共同的遗传背景，在这个意义上，其与来自 HapMap项目版本3的CHB和CHD参照受试者聚类共同的（见下文）
[0092] · PGx-非-CN是其余的PGx-GT，其不落入PGx-CN内
[0093] 另外的补充（suff ice)追加为分别为HBe阳性和HBe阴性亚群的HBePos或HBeNeg， 并根据分析的阶段，作为中期1，...中期3和最后。
[0094] 遗传标记物
[0095] GWAS标记物组是Illumina OmniExpress外显子组微阵列（www. illumina.com)，其 由超过750,000个的SNP标记物和超过250，000个的外显子标记物组成。通过质量检查的标 记物组被称为GWAS标记物集合。 _6] 数据分析的一般注意事项
[0097] 该GWAS是无假设的(hypothesis-free)。具有未调整的P〈5xl0-8的标记物被认为是 全基因组显著的。为了统计功效，对多个终点或多个回合的分析不做调整。
[0098] 第一次中期分析的结果
[0099] 下面的段落描述来自第一次中期分析得到的结果。将对积累数据的多达三个进一 步批次进行类似的分析，患者集合适当地补充以下标记：中期2、中期3和最后。
[0100] 数据说明
[0101]以名称为demoext. CSV的逗号分隔的平面文件形式接收临床数据。该文件有20列 和218行，包括标题行，每个患者一行。
[0102]以名称为 24_luoshi_FinalReport.txt，25_FinalReport.txt，32_ FinalReport · txt和56_FinalReport · txt ·的四个11 lumina格式的文件接收基因数据。这些 文件的组合包含137例患者的基因型和951，117个SNP。
[0103]下面的表1示出了具有至少一个基因型的137例患者的基线和人口统计特征。所有 患者均根据协议MV22430进行研究。受试者集合是PGx-FAS-中期1。
[0104] 表1:PGx-FAS-中期1的基线和人口统计特征
[0107] *自报的种族如下:太平洋岛民；毛利；印度;緬甸；黑人
[0108] 按患者的质量检查
[0109] 在任何自报种族的所有137例患者中（PGx-FAS-中期1 )，基于未过滤的GWAS数据， 评价了以下标准。
[0110] ·〈5%缺失的基因型数据
[0111] ·〈30%全基因组杂合性
[0112] ·〈30%与其他样本的基因型一致性
[0113] ?报道的性别与X染色体数据一致
[0114] 所有患者有〈5%缺失的基因型，全基因组杂合性〈30%，X染色体数据与自报的性 别一致。但是检测了一对一级亲属。患者标识(ANONID)为8734(女性高加索人，年龄55岁）和 8760 (男性高加索人，年龄25岁）。二者中，患者8734有稍多的缺失数据(0.2% vs.0.1%)，因 此将在进一步分析中排除。
[0115] 剩余的136例患者被纳入PGx-GT-中期1集合中。
[0116] 按标记物的质量检查
[0117] 评估了导出用于GWAS和候选基因研究的标记物的缺失数据。共1712个标记物(〈总 数的0.2%)具有大于5%的缺失数据，被从进一步的分析排除。因此，GWAS标记物集合由 949，405个标记物组成。图1示出了在GWAS标记物集合中按染色体的标记物的数目。如在常 染色体中所预期的，标记物的数目大约根据染色体大小而变化。
[0118] 祖先的多元分析
[0119] 主成分分析(PCA)是用于减小数据集合的维数的技术。其线性地将变量组转化为 更小的一组代表原始集合中大多数信息的不相关变量，（Dunteman，1989)。在目前的研究 中，标记变量被转化为与自报种族群进行比较的主成分。在准备相关性检测中，其目的是确 定共享同质遗传背景的个体的聚类。
[0120] 如下，采用PGx-GT-中期1得到一组合适的用于祖先分析的GWAS标记物。如果其具 有低于5%的频率，或者如果其对应于已知的高连锁不平衡(LD)或反转(Chr5,44-51.5Mb; Chr6，24-36Mb; Chr8，8-12Mb; Chr 11，42-58Mb; Chr 17，40-43Mb)区，则标记物被排除在外。为 了便于合并，也除去了编码互补碱基变化的标记物。剩余的标记物变少，使得在大小1000的 窗口内的所有SNP具有r 2〈0.25。
[0121] HapMap项目第3版数据下载用于所产生的标记物集合（国际HapMap协会，2003; 2005 ;2007)。表2示出了HapMap受试者的组成，其被用作参照集合与来自PGx-GT-中期1的数 据比较。HapMap项目数据与PGx-GT-中期1数据合并，同时注意解决两个来源之间的任何链 差异。从合并的文件排除任何HapMap项目受试者不能获得的标记物。
[0122]使用134，575个标记物进行PCA，如上所述选择标记物，并基因分型覆盖136例研究 的个体和988例HapMap项目参照个体。
[0123]表2 = HapMap项目第3版参照受试者的详细信息

[0126] 图4示出了具有覆盖研究参与者的相同数据。自报为"东方人"的患者给出黑色十 字；自报为其他种族群体的患者给出灰色十字。注意到两点。首先，可以清楚地看出，尽管那 些自报为"东方人"的患者与中国人和日本人HapMap项目的参照个体聚类或与之接近，但是 其形成更宽的聚类。这样，研究参与者代表比参照集合遗传上更多样化的个体组。该研究参 与者很可能来自东南亚不同的国家。其次，在黑色十字聚类中，观察到一些灰色十字-这代 表没有自报为"东方人"的个体，但其遗传背景无法从"东方人"组的成员中区分开来。
[0127] 为了遗传分析的目的，PGx-CN-中期1由128例落入自报为"东方人"聚类边界内的 患者组成。其绘制的祖先明显偏离该聚类的八例患者，组成PGx-非CN-中期1:其自报为高加 索人(n = 6)、毛利人(n = l)和印度人(11 = 1)。7。
[0128] 协变量评估
[0129] 为了确定将进行的全基因组相关性分析的协变量，采用向后逐步回归(backwards stepwise regression)测试了一系列变量与每个终点的相关性。与计划的分析一致，终点 1-3的受试者集合是PGx-GT-HBePos-中期l(n = 134);终点4的受试者集合是PGx-GT-中期1 (n = 136)的所有成员。基于赤池信息准则(AIC)取向后步骤。
[0130] 整个模型的协变量如下:年龄、性别、基线HBV DNA、基线ALT、HBV基因型和核苷酸/ 核苷酸类似物的合并使用。基线HBV和基线ALT都是为了提高对称性的对数变换。由于几乎 所有患者共享均质遗传背景的事实，其祖先的主成分不包括在向后逐步回归中。表3-5示出 了选择用于各个终点的协变量。
[0131] 可以看出，在所有五个实例中选择了基线HBV DNA和基线ALT;在五个中的三个中 选择了核苷酸/核苷酸类似物的合并；终点4选择了HBV基因型，虽然该变量的编码(含三个 低频率类别）意味着个体效应的大小并没有很好地估计。
[0132] 表3:由向后逐步回归为终点1选择的协变量

[0136] 表5:由向后逐步回归为终点4选择的协变量
[0139] 单点相关性分析
[0140] 越
[0141] 由于第一次中期分析适度的样本大小(n = 136)，如果标记物具有低于5%的频率， 则从单点相关性分析中排除。其余571832个标记物如下以两种方式编码。首先，其按照加性 模型编码，由次要等位基因数量的计数编码。其次，其按照遗传的优势模型、基于次要等位 基因的运输(carriage)编码。
[0142] 在遗传的两种模型中对两个患者组和五个终点进行相关性分析。
[0143] 下面的模型使用多元逻辑回归拟合：
[0144] 终点=截距+[协变量]+标记物
[0145]如以上选择应用协变量(7.5节）。不考虑最初的意图，在PGx-GT分析中不进行祖先 主成分的校正，原因在于在该主要是均质的组中的过度拟合的问题。对祖先主成分的调整 将在未来的中期分析中尝试。也没有使用对研究的调整，因为在当前的中期分析中所有患 者来自相同的方法。
[0146] 使用t检验测定各标记物的显著性。针对每个GWAS分析计算基因组对照lambda并 检查了QQ-绘图，但没有发现检验统计夸大的明显证据(Devlin和Roeder 1999)。
[0147] 使用卡方检验对所有标记物进行了偏离哈迪-温伯格平衡(HffE)的检验。对在PGx-CN-中期1组的患者进行计算，结果被用来帮助相关性分析输出的解释。
[0148] 为感兴趣的标记物制作了条形图，以显示按基因型的反应率。
[0149] 莖里



[0178] 全基因组相关性扫描应用到571832个标记物，这些标记物在PGx-CN(n = 128)中的 估算频率大于5 %。
[0179] 四个相关性超越p〈 HT5的水平：
[0180] ?在CADPS中的内含子标记物(终点4; PGx-GT;优势）
[0181] CADPS是钙依赖性分泌活化物。该基因编码钙调节的分泌囊泡胞吐作用所需要的 神经/内分泌特异性胞质和外周膜蛋白质。与CADPS相关的疾病包括成松果体细胞瘤和儿童 成神经管细胞瘤。
[0182]两个非同义变化具有ρ〈1〇Λ
[0183] · S0N(S0N DNA结合蛋白质）上的rsl3047599
[0184] · NKAPL(NFKB激活蛋白质-样)上的rsl2000
[0185] 在遗传优势模式下而非加性模型中，在PGx-CN-HBePos和PGx-GT-HBePos二者中， 终点1观察到这些中的第一个。编码的蛋白质结合RNA并促进前mRNA剪接，特别是差的剪接 位点的转录。该蛋白质还识别在人类乙型肝炎病毒(HBV)中发现的特定DNA序列，并抑制HBV 核心启动子活性。与SON相关的疾病包括乙型肝炎。针对rsl3047599和终点1，在下面的图9 中给出了显示优势模式下按基因型的反应率的条形图。
[0186] 终点4观察到PGx-GT中的第二非同义变化。其位于NKAPL，一种与精神分裂症有关 的蛋白质编码基因。针对rs 12000和终点4，在下面的图10中给出了显示按基因型的反应率 的条形图。
[0187] 正如预期的那样，在每个终点内观察到大量结果的一致性;CN和GT组之间的差别 仅是小群患者的问题。共有33个基因列于上述表中。其中，至少有两个先前已经包含于乙型 肝炎病风险或进展中：
[0188] · PTPN3(蛋白质酪氨酸磷酸酶;Hsu等人，2007)
[0189] · TREM1(髓样细胞上表达的触发受体I;Liao等人，2012)
[0190]
[0191] 自定义编写的Perl脚本(Wall等人，1996)被用来格式化数据，选择标记物用于祖 先分析和生成表格。PLINK 1.07版本(Purcell等人，2007)被用来进行遗传 QC分析，合并研 究数据与HapMap项目数据，用于相关性分析。EIGENS0FT 4 · 0(Patterson等人，2006;Price 等人，2006)用于PCAc3R版本2.15.2(R Core Team，2012)用于制图。
[0192] 所有本发明公开和要求保护的组合物和/方法可根据本公开制成并执行而无需过 多实验。虽然本发明的组合物和方法已在优选的实施方案进行了描述，但对于本领域的技 术人员很明显，可以对所述组合物和/或方法，以及对本文所述方法的步骤或步骤顺序进行 各种变化，而不偏离本发明的概念、精神和范围。所有对于本领域技术人员是明显的这些类 似的替代和修改被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
【主权项】
1. 一种鉴别可以从包含干扰素的抗HBV疗法的治疗中受益的患者的方法，所述方法包 括： 确定从患者获得的样品中21号染色体上SON基因中单核苷酸多态性的存在，其中在 rsl3047599上至少一个G等位基因的存在表明患者可以受益于使用抗HBV治疗的治疗。2. -种预测HBV感染患者对使用包含干扰素的抗HBV治疗的治疗的反应性的方法，所述 方法包括:确定从患者获得的样品中21号染色体上SON基因中单核苷酸多态性的存在，其中 在rsl3047599上至少一个G等位基因的存在表明患者更可能对使用抗HBV治疗的治疗反应。3. -种用于确定HBV感染患者将从包含干扰素的抗HBV治疗中显示受益的可能性的方 法，所述方法包括:确定从患者获得的样品中21号染色体上SON基因中单核苷酸多态性的存 在，其中在rsl3047599上至少一个G等位基因的存在表明患者具有增加的从抗HBV治疗受益 的可能性。4. 一种用于优化包含干扰素的抗HBV治疗的疗效的方法，所述方法包括:确定从患者获 得的样品中21号染色体上SON基因中单核苷酸多态性的存在，其中在rsl3047599上至少一 个G等位基因的存在表明患者具有增加的从抗HBV治疗受益的可能性。5. -种用于在患者中治疗HBV感染的方法，所述方法包括： (i)确定从患者获得的样品中21号染色体上SON基因中在rsl3047599上至少一个G等位 基因的存在，和 (? )向所述患者施用有效量的包含干扰素的抗HBV治疗，由此治疗HBV感染。6. -种用于预测感染Η Β V的Η B e阳性患者在治疗后随访的> =2 4周，对干扰素治疗的 HBeAg血清学转换和HBV DNA〈2000IU/ml (反应者vs.无反应者）的方法，所述方法包括:提供 来自所述人类受试者的样品，检测21号染色体上SON基因中单核苷酸多态性的存在，和如果 在rsl3047599上存在至少一个G等位基因，确定所述患者对干扰素治疗具有高的反应率，测 定为在治疗随访的> = 24周HBeAg血清学转换和HBV DNA〈2000IU/ml(反应者vs.无反应者）。7. 根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述干扰素选自聚乙二醇化干扰素 a_2a、 聚乙二醇化干扰素 a-2b、干扰素 a-2a和干扰素 a-2b。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述干扰素是具有下式的聚乙二醇化干扰素 a_2a 缀合物：其中R和R'是甲基，X是NH，n和η'独立地或二者是420或520。
【文档编号】C12Q1/68GK105829548SQ201480068549
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年12月15日
【发明人】H·赫, C·沃特
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司