丝瓜抗蔓枯病基因片段或基因标记及应用
【技术领域】
[0001] 本发明是利用抗病基因同源序列方法，克隆丝瓜抗蔓枯病基因片段或者将其转化 为分子标记等，主要涉及丝瓜常规杂交育种，分子标记辅助育种，抗蔓枯病基因的定位和分 子作图，抗蔓枯病基因的克隆以及抗病基因的调控机理分析等方面，属于植物生物技术科 学领域。
【背景技术】
[0002] 蔓枯病是丝瓜生产上最重要的病害之一。为害茎蔓，也可为害叶片和果实。茎蔓 病斑椭圆形至梭形，边缘褐色，中部灰褐色。有时患部溢出琥珀色树脂状胶质物，终至茎蔓 枯死。叶斑近圆形，直径10?20毫米不等，褐色或黑褐色，微具轮纹。果实被害生近圆形 或不定形病斑，边缘褐色，中部灰白，斑下面的果肉多呈"黑腐"。蔓枯病严重影响了丝瓜植 株的正常的生长发育过程，给生产带来极大的经济损失。抗病基因的利用及抗病育种是丝 瓜病害防治最有效的方法。
[0003] 二十世纪四十年代，Flor提出了经典的"基因对基因"理论学说，即植物和病原 菌体内各自存在一个显性基因，植物抗病基因或病菌无毒性（Avr)基因的缺失或改变都能 引起病害的产生。这个模型适用于大多数活体营养型病原菌，包括病毒、细菌、真菌和线虫 类。"基因对基因"抗病性一般是受体被作为模型：植物抗病蛋白能够直接或间接的识别源 自病菌的Avr产物。一旦这种识别发生，就会引起防御反应。大多数抗病基因 （Resistance gene ;R)触发的抗性与快速防御反应相关，称为过敏性反应（hypersensitive response ; HR)。而目前，大多数抗病基因的产物都含有蛋白识别的结构域，如富含亮氨酸的重复单位 (LRR)的结构域或卷曲螺旋（CC)的结构域；信号转导结构域，如核苷酸结合部位（NBS)或 蛋白激酶（PK)结构域。一些抗病基因产物被预测为细胞质蛋白，而另一些通过一个跨膜结 构域（TM)贯穿细胞膜。这些结构域组合能够产生不同类型的R蛋白。根据结构的特性已 经鉴定出至少六种不同类型的 R 基因：I) NBS-LRR，2) LRR-TM-PK，3) LRR-TM，4) CC-TM，5) PK， 6)PK-PK。其中，NBS-LRR类抗病基因是植物体内存在的最大一类抗病基因；这些抗病基因 在结构上的保守性为我们利用抗病基因同源序列法克隆其他作物的抗病基因带来了潜在 可能。在已知分离获得的抗病基因中，小麦抗叶锈病基因 LrlO和马铃薯抗马铃薯X病毒基 因 Rx2就是利用抗病基因同源序列法克隆抗病基因的经典例子，说明利用该法克隆抗病基 因是可行的。
【发明内容】
[0004] 技术问题
[0005] 本发明的目的是利用抗病基因同源序列法快速鉴定丝瓜蔓枯病基因片段或者将 其转化为分子标记。结果一方面可用于丝瓜抗蔓枯病分子标记辅助选择育种，另一方面也 为抗曼枯病基因的克隆提供参考依据。
[0006] 技术方案
[0007] 本发明前期对大量丝瓜种质资源进行抗病性筛选，在获得高抗丝瓜蔓枯病抗病种 质的基础上，应用抗病基因同源序列法克隆抗蔓枯病基因片段，通过与已知抗病基因同源 性及序列比对分析等方法确认；为开发相应的分子标记和利用cDNA末端快速扩增技术获 得抗病基因的全长奠定基础。
[0008] 为了实现上述目标，本发明采用抗病基因同源序列法对丝瓜抗蔓枯病基因进行克 隆，获得了抗蔓枯病基因片段或者基因标记3个，片段大小分别为504bp、504bp和504bp。 以该基因片段序列为基础，开发相应的分子标记，可以进行丝瓜抗蔓枯病分子标记辅助选 择育种；同时利用基因片段或者基因标记进行新的种质资源的创新；结合已有的分子标记 可以实现丝瓜抗蔓枯病基因的分子作图；利用这些基因片段，通过设计基因特异引物，采用 cDNA末端快速扩增技术分离丝瓜抗蔓枯病基因，为通过基因工程改良丝瓜的抗病性奠定基 础；也为最终解析丝瓜抗蔓枯病基因的分子机理提供了基因资源。
[0009] 本发明的积极效果：
[0010] 1)有利于快速开发与抗病基因紧密连锁的分子标记。通过鉴定的丝瓜蔓枯病基 因，开发相应的共分离功能性标记（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子标记辅 助选择，准确性高。
[0011] 2)缩短了丝瓜抗蔓枯病基因的挖掘周期，有利于蔓枯病基因的快速鉴定。采用常 规方法（图位克隆、转座子标签等）挖掘抗白粉病基因不仅耗时耗力、效率低，且难以成功。 本发明基于抗病基因同源序列方法快速挖掘丝瓜抗蔓枯病基因，不仅可以缩短时间，还可 以提商曼枯病基因鉴定效率。
[0012] 3)有利于多抗性育种材料的创制。基于新鉴定的蔓枯病基因开发的功能性分子标 记，结合已经定位的其他抗病基因的分子标记，进行多抗性育种材料的创制，可以缩短育种 年限，提1?育种效率。
[0013] 4)为阐述丝瓜抗蔓枯病分子机制奠定了基础。鉴定的丝瓜抗蔓枯病基因，通过转 基因技术、RNAi、病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技术等研究 抗蔓枯病的分子机制提供了基因资源，有利于快速阐述丝瓜抗病毒的作用机理。
【附图说明】
[0014] 图1是丝瓜L75抗曼枯病基因序列；
[0015] 图2是丝瓜L02抗蔓枯病基因序列；
[0016] 图3是丝瓜L15抗曼枯病基因序列；
【具体实施方式】
[0017] 抗病基因的鉴定在作物抗病遗传理论研究和抗病品种选育中具有重要的作用。本 方法可以快速鉴定出丝瓜抗蔓枯病基因。具体实施过程如下：
[0018] 1、DNA的提取：取适量的丝瓜的幼嫩叶片硅胶干燥后研磨成粉状，用CTAB法提取 总基因组DNA。提取的DNA用紫外分光光度计检测，选取0D260 / 0D280值在1. 8?2. 0的 样品于-20°C保存备用。
[0019] 2、抗病基因同源片段的扩增和克隆：根据已知的NBS-LRR型抗病基因的保守区的 氨基酸序列GG(L / I / V / M / S)GKTT和G(L / N)PL(A / T / S) (L / V)，设计了 1 对简并 引物：NBS15，-GKTT GGIGGIffSIGGIAARACIACG-S'和 NBS25，-GCIGCIIARIGGRTTKXHV。 取丝瓜基因组DNA50ng为模板，按下列程序进行PCR扩增反应：94°C预变性3min ;94°C 30s， 55 °C 30s，72 °C 30s，共30个循环；最后72 °C延伸5min。PCR产物经琼脂糖胶电泳检测，切 下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块，用天根生物公司的胶回收试剂盒，按操作说明回收 纯化目的DNA片段，回收产物用pMD-18T CloningKit (TAKARA公司）连接。将连接产物转 至DH5 α感受态细胞，涂于含IPTG和X-Gal的LB固体培养基上（含IOOm妙L AMP)，37°C 培养过夜，挑取白色单菌落，通过PCR检测确定含有目的片段。筛选后随机选取10个克隆 进行测序（上海生工生物工程技术服务有限公司）。
[0020] 3、序列分析将测序结果去除PMD18-T载体序列，得到插入片段的DNA序列。用 ORFfinder分析这些序列的开放阅读框，然后通过互联网用BLAST软件（网址：http : / / www. n cbi. nlm. nih. gov)与GenBank中登记的序列进行同源性比较，继而推断这些扩增产 物是否与已知的抗病基因相关。：
[0021] 以下是发明人给出的实施范例，但不局限于这些范例。
[0022] 实施范例1 :
[0023] 我们和国外农业高校、科研院所合作，以优良亲本构建了丝瓜的F2群体，含有118 个单株；以这些单株为试验材料提取DNA，根据获得的抗蔓枯病基因序列设计特异引物，进 行PCR扩增，根据特异DNA片段在群体单株中分离情况，依据丝瓜蔓枯病抗病性鉴定结果， 获得与丝瓜抗蔓枯病紧密连锁的DNA片段。
[0024] 实施范例2 :
[0025] 在种质资源创制过程中，以感病亲本和抗病亲本杂交获得的后代个体为对象，提 取各自的基因组DNA，根据实施范例1获得的与蔓枯病基因紧密连锁的DNA片段设计引物， 对上述获得的丝瓜基因组DNA进行PCR扩增，凡是扩增产物出现DNA特异片段的杂种材料， 抗蔓枯病杂种植株，或者是抗蔓枯病基因的携带者，这些材料科研进一步用于抗病品种培 育的亲本和育种种质，实现了分子标记辅助选择。
[0026] 实施范例3 :
[0027] 我们采用人工接种和田间接种鉴定相结合的方法，对上述的重组自交系群体进行 接种鉴定，根据实施范例1获得的与蔓枯病紧密连锁的DNA片段，设计特异引物，对上述单 株个体进行PCR扩增；结合广泛的分子标记如AFLP、SRAP等，分析这些标记在单株群体中的 分离情况，结合人工接种和田间接种鉴定结果，利用MAPMARKER软件进行丝瓜抗蔓枯病基 因的分子作图，获得蔓枯病抗病区段的遗传图谱，为后续克隆抗病基因奠定基础。
[0028] 实施范例4 :
[0029] 应用北京天根公司RNA提取试剂盒提取抗蔓枯病亲本叶片总RNA，利用cDNA合 成试剂盒合成cDNA第一链；将实施范例1获得的丝瓜抗蔓枯病基因片段DNA序列，设计 特异引物，结合cDNA末端快速扩增技术（RACE技术）试剂盒所带的引物相结合，分别进行 5' RACE和3' RACE PCR扩增，PCR产物分别在1 %的琼脂糖凝胶电泳获得5' RACE和3' RACE 全长序列。分别回收PCR产物，进行T克隆，获得全长序列后进行基因全长的连接；从而克 隆了丝瓜抗蔓枯病基因全长，为通过基因工程改良丝瓜品种的抗病性提供了基因资源。
【主权项】
1. 丝瓜抗蔓枯病基因片段或者基因标记，其特征在于选自下列基因片段或者基因标记 之一：
2. 权利要求1所述快速鉴定丝瓜蔓枯病的应用，包括： 1) 携带有上述3个基因的育种材料的创制或者新品种创制：利用权利1所给出的基因 源为亲本材料，在杂交、回交后代中，可以获得转育有蔓枯病抗性基因的育种材料。 2) 抗曼枯病基础理论研究：对权利1的3个曼枯病基因进行分子标记分析；对该基因 进行分子作图或者基因定位；对该基因进行克隆以及基因间互作分析。 3) 抗蔓枯病转基因研究：利用权利要求1所给出的3个基因进行转基因研究。
【专利摘要】本发明主要涉及丝瓜抗蔓枯病基因片段或基因标记及应用；主要是采用抗病基因同源序列法，快速分离丝瓜抗蔓枯病基因片段或基因标记3个，通过测序，这些基因片段或基因标记的核苷酸长度分别为504bp、504bp和504bp。该发明有效的缩短了丝瓜抗蔓枯病基因挖掘周期，有利于蔓枯病基因的快速鉴定；通过鉴定的蔓枯病基因开发相应的共分离功能性标记(SNP、SCAR等)，还可以快速的用于抗蔓枯病基因的分子标记辅助选择，准确性高；结合其它抗病基因分子标记可进行多抗性育种材料的创制，缩短育种年限，提高育种效率；为阐述丝瓜抗蔓枯病基因分子机制奠定了基础。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104560966
【申请号】CN201310524814
【发明人】戴新, 钱孝英, 钱春桃
【申请人】常熟市智林蔬果专业合作社
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月28日