化学合成肺炎链球菌表面粘附素a的基因片段及表达、应用的制作方法
【专利摘要】本发明化学化学合成肺炎链球菌表面粘附素A的基因片段及表达、应用涉及基因工程技术和诊断试剂领域。本发明是通过计算机分析，筛选出肺炎链球菌粘附素A内的强抗原表位，第84个氨基酸至第280个氨基酸，共197个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备肺炎链球菌粘附素A的强抗原表位片段。表达的蛋白可用于疫苗研发、肺炎链球菌感染抗体的检测及单抗和多抗的制备。
【专利说明】化学合成肺炎链球菌表面粘附素A的基因片段及表达、应用
【技术领域】
[0001]本发明化学合成肺炎链球菌表面粘附素A的基因片段及表达、应用涉及的是一种通过化学合成肺炎链球菌表面粘附素A(PsaA蛋白)的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位肺炎链球菌PsaA蛋白的片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于肺炎链球菌感染抗体的检测及单克隆抗体的制备等，本发明涉及基因工程技术和检测试剂领域。
【背景技术】
[0002]肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)简称肺炎球菌(pneumococcus)。为革兰染色阳性菌。肺炎链球菌会导致不同种类的疾病，包括有急性鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心囊炎、蜂窝组织炎及脑脓肿。
[0003]目前针对肺炎链球菌感染的主要检测方法有:细菌学分离法，酶联免疫法(ELISA)，DNA探针及PCR技术等。但这些方法或多或少都存在着实验时间长，不适合现场快速检测等缺点。近年来，免疫金标层析技术在生物医学各领域得到了广泛的应用，为肺炎链球菌的检测提供了新的思路。筛选肺炎链球菌外膜特异性抗原，并制备高纯度的特异性抗原，是建立该技术的重要前提。
[0004]肺炎链球菌表面粘附素A (PsaA)是各型Sp共有的一种遗传保守，种特异性的表面结合脂蛋白，与细菌的侵袭性和毒力有关。PsaA蛋白位于细胞膜表面，被紧密的荚膜层包裹着。PsaA在基因序列和所编码蛋白序列上具有闻度的保守性。PsaA抗原决定族全部或部分暴露于细胞表面，具有很好的抗原性，机体感染Sp后会产生抗PsaA特异性抗体。因此，该蛋白有可能作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗的抗原，同时还有可能用于检测患者血清中相应的抗体，为肺炎链球菌感染的快速诊断提供依据。PsaA编码开放阅读框为930bp，分子量约为37kDa。
【发明内容】
[0005]本发明通过化学合成的截短的PsaA蛋白的全新基因片段，利用基因工程技术，制备PsaA蛋白高表达片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的PsaA蛋白胞外区片段，第84个氨基酸-第280个氨基酸，共197个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于肺炎链球菌感染抗体的检测或单克隆细胞株的制备。
[0006]化学合成肺炎链球菌表面粘附素A的基因片段及表达、应用是采取以下步骤实现的:
1.PsaA蛋白抗原表 位的筛选及其基因片段的化学合成:
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析的氨基酸序列，发现PsaA蛋白含有较强的抗原决定簇，选择第84个氨基酸一第280个氨基酸作为研究对象。选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了^_!11酶切位点(下划线部分)，在3’端增加了终止密码子(TAA)和及^RI酶切位点(下划线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的Bamm和及^RI酶切位点内。
[0007] 筛选的PsaA蛋白片段氨基酸序列(第84个aa —第280个aa):
【权利要求】
1.一种化学合成肺炎链球菌表面粘附素A (PsaA)的基因片段，该基因片段编码含强抗原表位肺炎链球菌PsaA蛋白胞外区基因片段，即第84个氨基酸至第280个氨基酸，共197个氨基酸，在该基因片段的5’端增加了酶切位点(下划线部分)，在3’端增加了终止密码子TGA和&0RI酶切位点(下划线部分)，化学合成的基因序列全长606bp，序列如下:
GGATCC CTG ATC TTC TAC AAT GGT ATC AAT CTG GAA ACG GGT GGT AAC GCC TGG TTCACG AM CTG GTC GM AAT GCC AAG AM ACG GM AAC AM GAC TAT TTT GCA GTC AGC GATGGC GTG GAC GTT ATT TAC CTG GM GGC CAG AAC GM AM GGC MG GAA GAT CCG CAT GCATGG CTG MC CTG GAA MT GGT ATT ATC TTT GCG MG MC ATC GCC AM CM CTG TCT GCTMG GAC CCG MC MC MG GAA TTC TAC GAA MG MC CTG MG GM TAC ACC GAT AM CTGGAC MG CTG GAT MG GAA TCA MG GAT MG TTC MC MG ATT CCG GCG GM AAG AM CTGATC GTG ACG TCG GAA GGC GCC TTT MG TAT TTC AGT MA GCA TAC GGT GTT CCG TCC GCTTAT ATT TGG GAA ATC MT ACC GAA GAA GAA GGC ACG CCG GAA CAG ATT AM ACC CTG GTTGAA MA CTG CGT CAA ACG MA GTC CCG TCC CTG TTC GTC GAA AGC TCT GTG GAT GAC CGCCCG ATG MG ACC GTG TCA CAG GAT ACC MC ATT CCG ATT TAT GCC CAG ATT TTT ACC GACTGA CTCGAG 。
2.权利要求1所述的化学合成的基因片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的肺炎链球菌PsaA蛋白胞外区基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下: 表达肺炎链球菌PsaA蛋白胞外区基因片段重组质粒的构建: 用Bern HI和I双酶切质粒pGEX4T_2和化学合成的肺炎链球菌PsaA蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA连接酶连接，使肺炎链球菌PsaA蛋白胞外区基因片段插入到载体PGEX4T-2内的及I和I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长423个氨基酸，该融合蛋白N端融合了载体上的226个氨基酸，C端包含肺炎链球菌PsaA蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA连接酶连接，使肺炎链球菌PsaA蛋白内的第84个氨基酸至第280个氨基酸链接到载体质粒，全长氨基酸序列如下:
3.权利要求1所述的化学合成的肺炎链球菌PsaA蛋白胞外区的基因片段序列，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。
4.权利要求2或权利要求3所述方法制备的肺炎链球菌PsaA蛋白胞外区片段，用于肺炎链球菌感染抗体的检测及单抗和`多抗的制备。
【文档编号】C07K14/315GK103773779SQ201310752891
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】李越希, 蔡冉, 徐悦玥, 许桂丽, 周洁, 李素芹, 潘英, 李丙军, 陈乐如, 张素芬, 马颖, 袁敬宇 申请人:李越希