一种检测pik3ca基因突变的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明设及一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒。
【背景技术】
[0002] PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的，编码I类憐脂酷肌 醇-3-激酶(911〇3911日1:1(171;[]1〇-3；[1:013-4;[]1日36 3，？131(3)的9110催化亚单位。第9外显子和 第20外显子的突变不仅可W减少细胞的调亡还可W促进肿瘤的浸润、提高其下游激酶 PI3KS的活性。其突变提高其下游激酶PI3KS的活性，可W减少细胞的调亡还可W促进肿瘤 的浸润。目前，临床上的检测方法需要先进行基因片段扩增，然后利用测序的方法检测基因 突变。该方法成本较高，检测费用昂贵。而且，由于在基因片段扩增过程中，对突变基因和野 生基因都进行了同等程度的扩增，因此在测序检测时灵敏度不高，仅有10%左右，且操作比 较繁琐，耗时较长。此外，对于血液标本，由于灵敏度低，所W很难从中检测到突变。
【发明内容】
[0003] 针对上述现有技术，本发明提供了一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其具有灵 敏度高、检测结果准确可靠等优点。
[0004] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0005] -种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，包括W下序列的肤核酸和特异性引物：
[0006] (1)针对PIK3CA基因第9外显子的肤核酸和特异性引物：
[0007] 所述肤核酸的序列为:5'-1'口'64441'〔4口'646〔46-3'；如沈9 10備.1所示；
[000引所述特异性引物的序列为：
[0009] 正向引物:5'-GAGACAATGAATTAAGGGAAAATGA-3' ；如沈Q ID NO.2所示；
[0010] 反向引物：5'-口'〇：414644441'口'1'1'口'(：口'6口'-3'；如沈9 10備.3所示；
[0011] (2)针对PIK3CA基因第20外显子的肤核酸和特异性引物： [001^所述肤核酸的序列为:5'-16416〔4〔41'〔416616-3'；如沈9 10^).4所示；
[0013] 所述特异性引物的序列为：
[0014] 正向引物：5'-16〔414〔47^644464〔(：口'46-3'；如沈9 10備.5所示；
[0015] 反向引物：5'-441〇：41'1'1'1761761〇：46〇：4-3'；如沈9 10備.6所示；。
[0016] 进一步地，所述试剂盒中还包括PCR反应所必需的反应原料和试剂。
[0017]所述PCR反应所必需的反应原料和试剂包括:PCR缓冲液，Mg2+和dNTPs的反应混合 物，Taq酶，SuperGreen染料，超纯水。
[0018] -种利用上述试剂盒检测PIK3CA基因突变的方法，包括W下步骤：
[0019] (1)提取待检测样本(包括各种临床标本，尤其适用于血液标本）的DNA(按照常规 的DNA提取试剂盒说明书进行操作即可）；
[0020] (2) W上述提取的DNA为模板，利用上述检测PIK3CA基因突变的试剂盒进行定量 PCR扩增，检测A Ct值（A Ct = Sample+pNA-Sample-pNA)，设立质控对照（质控品必须添加，阳性 质控品为经测序证实PIK3CA基因突变阳性的细胞株DNA;阴性质控品为经测序证实PIK3CA 基因突变阴性的细胞株DNA);
[0021] 所述PCR扩增程序为:95 °C 5分钟;95 °C 10秒，70 °C 20秒，58 °C 20秒，70 °C 20秒，重复 45个循环；
[0022] (3)判断:若ACt>8,则待检测样本的PIK3CA基因的基因型为野生型;若ACt<8， 则待检测样本的PIK3CA基因的基因型为突变型。
[0023] 本发明的试剂盒是利用肤核酸(peptide nucleic acids，PNA)的特性设计而成。 PM是一种人工合成的核酸类似物，它可结合单一 DNA模板，而不能作为引物诱导DNA的合 成。与普通核酸的相比，退火溫度高出50%。我们设计的PNA序列与野生型基因完全互补，所 W，当PM与DNA模版有一个碱基不匹配时(模板存在突变），它们之间的结合力将迅速下降， 带有突变的基因得到扩增从而被富集，而野生基因的扩增被抑制。最终，根据A Ct值来评价 检测结果，具体标准为：ACt >別寸，标本为野生型；ACt <別寸，标本为PIK3CA基因突变型 (A Ct = Samp le+PNA-SampIe-PNA)。
[0024] 本发明用于检测PIK3CA基因突变的试剂盒及检测方法，操作简便，耗时短，灵敏度 高，检测结果准确可靠，具有W下优点：
[0025] 1.该试剂盒成本较低，降低了基因突变的检测费用。
[0026] 2.在检测过程中，通过对野生型的抑制及突变型的扩增，最终达到富集突变型基 因片段的目的，大大提升突变检出的灵敏度。
[0027] 3.由于技术灵敏度高，所W对血液样本基因突变检出率很好，为临床上难W得到 组织标本的患者提供检测新途径。
[00巧]4.结果呈现简单，操作方便。
[0029] 5.可用于大规模肿瘤高危人群筛查、肿瘤的早期诊断及疗效预后的动态观察。
【附图说明】
[0030] 图1:突变基因占模板总量比率为50%时，加入PNA与不加入PNA的巧光扩增曲线 (加入PM的扩增曲线在前）。
[0031] 图2:突变基因占模板总量比率为25 %时，加入PNA与不加入PNA的巧光扩增曲线 (加入PM的扩增曲线在前）。
[0032] 图3:突变基因占模板总量比率为12.5%时，加入PNA与不加入PNA的巧光扩增曲线 (加入PM的扩增曲线在前）。
[0033] 图4:突变基因占模板总量比率为6.25 %时，加入PNA与不加入PNA的巧光扩增曲线 (加入PM的扩增曲线在前）。
[0034] 图5:突变基因占模板总量比率为3.1 %时，加入PNA与不加入PNA的巧光扩增曲线 (加入PM的扩增曲线在前）。
[0035] 图6:突变基因占模板总量比率为1.5 %时，加入PNA与不加入PNA的巧光扩增曲线 (加入PM的扩增曲线在前）。
[0036] 图7:突变基因占模板总量比率为0.75 %时，加入PNA与不加入PNA的巧光扩增曲线 (加入PM的扩增曲线在前）。
[0037] 图8:突变基因占模板总量比率为0.38%时，加入PNA与不加入PNA的巧光扩增曲线 (加入PM的扩增曲线在前）。
[0038] 图9:突变基因占模板总量比率为0.19%时，加入PNA与不加入PNA的巧光扩增曲线 (加入PM的扩增曲线在前）。
[0039] 图10:突变基因占模板总量比率为0%时，加入PNA与不加入PNA的巧光扩增曲线 (加入PM的扩增曲线在前）。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0041] 下述实施例中所设及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有 的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所设及的实验方法，检 测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0042] 实施例1
[0043] 一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒
[0044] 利用上述试剂盒进行检测，步骤如下：
[0045] (1)培养PIK3CA基因阳性的细胞系（第9外显子c.l633G>A;p.E545K突变细胞系： 化D-1;第20外显子c.3140A>G;p.化047R突变细胞系：肥T116)及阴性细胞系A549【均购买 自美国模式培养物研究所(American Type Qilture Collection)(Manassas,VA，USA)】。提 取其DM,定量。将最终浓度稀释到25ng/ul。
[0046] (2)将阴性细胞系DNA按不同比例渗入阳性细胞系DNA中，最终制备出阳性DNA比率 不同的样品（50% ,25% ,12.5% ,6.25% ,3.125% ,1.5% ,0.75% ,0.38% ,0.19%，0%)。
[0047] (3)分别取化1不同阳性比率的DNA直接进行加与不力昨NA的定量PCR扩增，PCR体系 共20ul，包括化 1 10XPNA;正反向引物各0.加 l;lu]_Taq酶；Iul SuperGreen染料；IOul PCR 反应液;4ul出0或6ul出0(不加 PNA)。使用ROCHE Li曲t切cler480定量PCR仪。95°C5分钟；95 °C 10秒，70 °C 20秒，58 °C 20秒，72 °C 20秒，重复45个循环。
[004引结果如图l~10，W及表l所示。若WACt>別寸，标本为野生型；ACt<別寸，标本为 PIK3CA基因突变型的标准来判定，则本试剂盒的检测灵敏度为1 %。
[0049]表 1 [(K)加 ]
[00引]*:Act = Sample+pNA-Sample-pNA此表为将图l~10的扩增曲线进行计算后的统计 表。
[0化2] 随着模板DNA中突变DNA比率降低，野生型DNA比率相应提高，贝化NA的效果愈加显 著，体现在A Ct值逐渐增大。
[0053]上述虽然结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围W内。
【主权项】
1. 一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于:包括以下序列的肽核酸和特异性 引物： (1) 针对PIK3CA基因第9外显子的肽核酸和特异性引物： 所述肽核酸的序列为:5 '-TCTGAAATCACTGAGCAG-3 ' ； 所述特异性引物的序列为： 正向引物:5 ' -GAGACAATGAATTAAGGGAAAATGA-3 ' ； 反向引物：5'-CTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCT-3' ； (2) 针对PIK3CA基因第20外显子的肽核酸和特异性引物： 所述肽核酸的序列为:5 ' -TGATGCACATCATGGTG-3 ' ； 所述特异性引物的序列为： 正向引物：5 ' -TGCATACATTCGAAAGACCCTAG-3 ' ； 反向引物：5'-AATCCATTTTTGTTGTCCAGCCA-3'。2. 根据权利要求1所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还 包括PCR反应所必需的反应原料和试剂。3. 根据权利要求2所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于:所述PCR反应所 必需的反应原料和试剂包括:PCR缓冲液，Mg 2+和dNTPs的反应混合物，Taq酶，SuperGreen染 料，超纯水。4. 一种利用权利要求1~3中任一项所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒检测PIK3CA 基因突变的方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 提取待检测样本的DNA; (2) 以上述提取的DNA为模板，利用检测PIK3CA基因突变的试剂盒进行定量PCR扩增，检 测ACt值，设立质控对照； (3) 判断:若Δ Ct > 8，则待检测样本的PIK3CA基因的基因型为野生型;若Δ Ct <8，则待 检测样本的PIK3CA基因的基因型为突变型。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述所述PCR扩增程序为:95 °C 5分钟;95 °C 10秒，70 °C 20秒，58 °C 20秒，70 °C 20秒，重复45个循环。
【专利摘要】本发明公开了一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，包括以下序列的肽核酸和特异性引物：(1)针对PIK3CA基因第9外显子的肽核酸和特异性引物：如SEQ ID NO.1～3所示；(2)针对PIK3CA基因第20外显子的肽核酸和特异性引物：如SEQ ID NO.4～6所示。利用上述试剂盒检测PIK3CA基因突变的方法，包括以下步骤：(1)提取待检测样本的DNA；(2)以上述提取的DNA为模板，利用上述检测PIK3CA基因突变的试剂盒进行定量PCR扩增，检测ΔCt值；(3)判断：若ΔCt＞8，则待检测样本的PIK3CA基因的基因型为野生型；若ΔCt＜8，则待检测样本的PIK3CA基因的基因型为突变型，具有操作简便，耗时短，灵敏度高，检测结果准确可靠等优点。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105713965
【申请号】CN201510836702
【发明人】宋现让, 曾倩
【申请人】宋现让