专利名称：两片段连接法进行hbv全基因组克隆的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用两片段连接法进行乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法。
背景技术：
从患者血清中扩增并克隆HBV全基因组序列，将有助于体外实验评价抗病毒药物或免疫压力下低病毒含量的HBV复制力、基因突变特征和频率及体外感染力，对于监控抗病毒疗效及深入阐明HBV生物学活性具有重要意义。以往对于患者血清中低病毒含量HBV全基因组研究大多限于某一基因片段的研究，通过PCR扩增个体内HBV基因群中的某些亚基因片段，然后直接测序，可在模板量较低的条件下得到亚基因片段扩增产物，但由于HBV基因内部有调控基因，基因片段间又相互重叠，很可能形成HBV不同基因群片段构成一个可供分析的HBV基因片段，使出现在单个基因分子上的突变复杂性及致病和传播的关系无法精确和全面分析。有研究发现，由于病毒体内存在不同变异株，这种直接测部分序列的方法不能准确地提示完整病毒基因结构与病因及传播的关系。采取普通的PCR方法扩增两个片段，对于低病毒含量HBV DNA的扩增效果并不理想，特异性不强，且其采用两次克隆步骤，增加了实验的复杂程度和成本预算。因此，建立一种灵敏度高、特异性强、简单方便的低病毒含量HBV全基因组克隆的方法，很有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种可对低病毒含量血清样本中的HBV进行全基因组克隆的有效方法。本发明的技术方案是一种采用两片段连接法进行HBV全基因组克隆的方法，先将HBV DNA进行巢式PCR 反应，然后分别对扩增出的HBV核心区至S区(即CS区)和前S区至X区(即pSX区)两个片段进行酶切，并将两个酶切片段连接，以此连接产物为模板用PCR方法扩增该全基因组后进行克隆；其特征为所述CS区为HBV基因组的nt 1821 nt 272，pSX区为nt 3194 nt 1825 ；且进行巢式PCR反应时所用特异性引物的序列如下SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3是CS区的外引物序列；SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 4 是 pSX 区的外引物序列；SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :7是CS区的内引物序列；SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :8 是 pSX 的内引物序列。调整巢式PCR时的内外引物的浓度，可提高反应的灵敏度，使其能够进行一管式巢式PCR扩增。最佳的引物浓度为外引物终浓度为lOnmol/L ；内引物终浓度为200nmol/ L0所述酶切，是扩增两个片段后，将产物纯化后分别使用内切酶进行酶切；内切酶优选使用)(bal。所述连接，是使用连接酶进行，优选使用T4DNA连接酶。本方法还可采用以下一种或几种手段进行优化，可使发明效果更好或达到最佳在引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :8序列中加入BspQ I酶切位点，扩增全长以后便于从载体上获得完全不含外源序列的HBV全长基因组。若在PCR反应体系中以1 10混合加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶， 既能提高扩增的特异性，又可显著降低成本。便于在实验室开展。所述用PCR方法扩增出两个片段时，采用一管式巢式PCR技术，可减少污染，提高产量；且只需经过一次克隆，简化了操作步骤。本发明的有益效果是1、可对血清样本中低含量的HBV进行全基因组克隆，扩增的HBV基因组具有生物学活性；2、不仅可获得全长HBV DNA，在体外还检测到较强的病毒复制力(见实施例2)；3、操作方法简便可行。
图1是HBV DNA CS区的扩增结果1666bp ；图2是HBV DNA pSX区的扩增结果1846bp ；图3是两片段连接后HBV全基因组扩增结果3215bp ；
具体实施例方式以下所用的主要实验材料来源如下Pfu和Taq DNA聚合酶及病毒DNA提取试剂盒为北京天恩泽基因科技有限公司产品。内切酶)(ba I，T4 DNA连接酶为NEB公司产品。实施例1 HBV全基因组克隆扩增引物设计从GenBank中选取7 条HBV全长基因组序列，其中中国人特有的 B和C基因型序列209条，用NTI软件进行比对分析HBV CS区和pSX区保守区设计引物，全长引物参考文献设计，并加入酶切位点，有助于下一步的复制力的分析。表1 PCR反应使用的引物序列
权利要求
1.一种采用两片段连接法进行HBV全基因组克隆的方法，先将HBV的DNA进行巢式PCR 反应，然后分别对扩增出的HBV CS区和pSX区两个片段进行酶切，并将两个酶切片段连接， 以此连接产物为模板用PCR方法扩增该全基因组后进行克隆；其特征为所述CS区为HBV基因组的nt 1821 nt 272，pSX区为nt 3194 nt 1825 ；且进行巢式PCR反应时所用特异性引物的序列如下SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :3是CS区的外引物序列；SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :4是pSX区的外引物序列；SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 7是CS区的内引物序列；SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 8是pSX的内引物序列。
2.权利要求1所述的方法，在引物SEQID NO 5和SEQ ID NO 8序列中加入BspQ I 酶切位点。
3.权利要求1或2所述的方法，所述连接，是使用T4DNA连接酶进行。
4.权利要求1或2所述的方法，进行巢式PCR反应时，调整内外引物的浓度至外引物终浓度为lOnmol/L，内引物终浓度为200nmol/L。
5.权利要求1或2所述的方法，用PCR方法扩增出两个片段时，采用一管式巢式PCR方
全文摘要
采用两片段连接法进行HBV全基因组克隆的方法，先将HBV DNA进行巢式PCR反应，然后分别对扩增出的HBV CS区和pSX区两个片段进行酶切，并将两个酶切片段连接，以此连接产物为模板用PCR方法扩增该全基因组后进行克隆。所述CS区为HBV基因组的nt 1821～nt 272，pSX区为nt 3194～nt 1825。
文档编号C12N15/10GK102559657SQ20111035338
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者刘研, 徐东平, 戴久增, 李晓东, 王琳, 王耀, 许智慧, 钟彦伟 申请人:中国人民解放军第三〇二医院