一种edrf基因片段及其应用的制作方法

专利名称：一种edrf基因片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和基因治疗学领域，具体涉及一种治疗(3地中海贫血的EDRF基因片段及其相关的表达载体和科研、临床上的应用。
背景技术：
地中海贫血是由于某种或某些蛋白链合成速率降低造成一些肽链缺乏、另一些肽链相对增多，出现肽链数量的不平衡，导致的溶血性贫血。其中P地中海贫血(简称卩地贫)，由于(3链合成减缺，a链相对过多，多余的a链形成a包涵体。在未分化成熟的红细胞内，a链包涵体可以使细胞膜受到损伤，其中很大一部分在骨髓内被破坏。部分红细胞虽然能成熟并释放至外周血内，但由于a链包涵体附着在红细胞膜上，使红细胞变的僵硬，这种红细胞通过微循环使，易被撕裂，摘除包涵体，形成泪滴状红细胞，且这种红细胞寿命短，易被破坏，产生贫血、铁沉积、脾大等症状，严重危害着患者的身心健康。因此，减少a珠蛋白的沉积造成的危害，对红细胞生理功能的恢复和疾病的治疗具有重要作用。
红系分化相关因子(EDRF)，又名a血红蛋白稳定蛋白，是一种在红细胞系高表达的蛋白质，与红细胞系的发生密切相关。近年来研究进一步证实，EDRF是a血红蛋白分子伴侣，它能与a血红蛋白结合，但不能与P珠蛋白或血红蛋白四聚体结合。EDRF能维持a血红蛋白的稳定性，保持a血红蛋白可溶性，减弱a珠蛋白沉积对细胞膜的破坏作用。可见EDRF能稳定a血红蛋白，减少过多a血红蛋白造成的危害，当EDRF与a血红蛋白结合后，可使血红素上的铁离子与远端及近端的组氨酸结合，引起a血红蛋白的a螺旋等结构发生一定的改变，这种结构上的改变可有效地抑制活性的氧离子ROS的生成及血红素与a珠蛋白的分离。上述过程是EDRF稳定a血红蛋白、保护细胞损伤作用的机理。在本发明之前，P地贫的治疗主要有药物治疗，如羟基脲、丁酸等诱导胎儿
型血红蛋白增多以取代P珠蛋白基因合成不足；骨髓移植疗法(但缺乏有效的供体)；转基因治疗(如p-珠蛋白基因)；反义基因治疗异常P链的方法等。但是上述的方法都有缺陷，不能达到满意的治疗效果。而本发明意在创立一种新的治疗方法，应用EDRF稳定过多的oc珠蛋白肽链，降低其沉积，目的是减轻多余的a链形成a包涵体的危害，证明EDRF基因表达在红细胞系和疾病治疗中的价值，为地中海贫血的治疗提供新的思路。应用这一新的载体进行P地贫治疗的方法未见报道。

发明内容
本发明的目的是克服现有治疗方法中的不足，提供一种治疗P地中海贫血的EDRF基因片段及其相关的表达载体。本发明的技术方案是(一)有效长度EDRF启动子的筛选
1、 不同长度EDRF启动子的克隆
设计不同长度的启动子的序列，用以扩增EDRF启动子。扩增条件如下变性94'C45s、退火45s、延伸72'C60s，共32个循环。引物序列及退火温度见表l，扩增区域见图l。 PCR产物用2c/。琼脂糖凝胶进行电泳，分析结果。
2、 构建不同的GFP载体分析启动子的作用效果
用上述不同长度的启动子用于驱动GFP的表达，并构建相应的载体。首先，通过EcoR I和Not I两酶切位点从pGEP-Nl载体(Invitrogen)上获得GFP基因，并用同样的酶切位点将GFP连接至pcDNA(3.1+)/ZEO (Invitrogen)载体上，构建pcDNA-GFP载体。然后，将上述启动子经PCR扩增后克隆至pUCm-T载体上(Takara)，构建pUCm-promoter载体。通过EcoR V和HindIII酶切pUCm-T载体获得启动子，并应用Nru I和HindIII酶切位点克隆至pcDNA-GFP载体上，最终获得pcDNA-Pro-GFP载体。
3、 细胞培养和转染
NIH3T3细胞用含10%胎牛血清的DMEM (GIBICO)培养基培养，小鼠的
4MEL细胞用含15。/。胎牛血清的DMEM培养，并用1.5。/。的DMSO (Sigma)诱导分化成熟。所有细胞购自上海中科院细胞所，用37'C5。/。C02培养。4、 GFP的检测和分析
荧光检测转染后72小时收集细胞，用荧光显微镜(Leica,DMRXA2)观察结果，其中NIH3T3细胞，用0.25%的胰酶消化。
流式细胞仪分析(FACS):细胞收集后，用PBS洗2次，然后用流式细胞仪分析结果(Becton Dichinson FACS caliber),通过GFP的表达反应EDRF启动子的效率。
(二) pcDNA-EDRF表达载体的构建及其治疗作用
1、 用有效的启动子驱动EDRF表达载体的构建
通过上述实验构建的GFP表达载体，转染细胞后确定最有效的启动子长度为372bp，由此为依据重新设计引物扩增EDRF基因，引物序列为-
F4: 5，誦GGCCTTGTTATCTTTCTACCT國3，(与弓l物F3基本一致，画112bp);R3: 5'画TTCT TGTTTCTGCCACCC國3' (+1168bp)。
PCR反应条件为变性94-C60s，退火54。C60s，延伸72°C90s;共30个循环。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行鉴定，并测序。'
将扩增的EDRF基因及其启动子连接至pUCm-T (Takara)载体上，构建了 pUCm- EDRF载体，然后，通过EcoRV和Bamffl酶切pUCm-EDRF载体获得EDRF基因及其启动子，并应用Nrul和BamHI酶切位点克隆至pcDNA(3.1+)/ZEO载体(Invitrogen)上，最终获得pcDNA-EDRF表达载体。
2、 人EDRF在小鼠体内的表达及pcDNA-EDRF载体对P地中海贫血小鼠的治疗作用
为了研究EDRF基因的治疗作用，处理小鼠后发现，该载体能在正常小鼠体内有效的表达人的EDRF因子，而且该蛋白表达能改善|3654-地贫小鼠的贫血症状，本研究结果对卩654-地贫贫血的治疗具有重要价值。
本发明的有益效果本发明筛选了有效的EDRF启动子，用有效的启动子驱动EDRF表达，构建有效的EDRF表达载体，并通过实验证明，该载体能够
5稳定过多的a珠蛋白肽链，降低其沉积，减轻多余的a链形成ot包涵体的危害， 证明EDRF基因表达在红细胞系和疾病治疗中的价值，为地中海贫血的治疗提 供了新的思路。
下面结合附图及实施例对本发明做详细地说明。


图h不同引物扩增EDRF基因及启动子示意其中F1画F4:正向引物；Rl-R3:反向引物；
CAC:外显子l起始点；ATG:翻译起始点； 图2:不同长度启动子驱动GFP表达载体构建示意图3: pcDNA-EDRF构建示意图4:不同长度启动子及载体构建鉴定其中A、 PCR扩增不同长度启动子结果
M: 100bp marker标记物；
泳道lanel-5:五个不同长度启动子
697bp, 496bp， 484p， 372bp， 283bp;
B、 一种pcDNA-Pro-GFP载体和pcDNA-EDRF载体酶切鉴定图
泳道Lanel-2: pcDNA-Pro-GFP载体(启动子长度为372bp);
Lanel: Not I酶切分析产物长度为4800bp，1152bp;
Lane2: Nw I +^'^/111酶切分析产物长度为4800bp， 772bp， 380bp;
泳道Lane3-4: pcDNA-EDRF载体；
Lane3: HzV^III酶切分析产物长度为5410bp, 669bp;
Lane4: No/I酶切分析产物长度为4800bp, 1280bp; 图5:荧光显微镜观测GFP在细胞中的表达(100X); 其中A: GFP在NIH3T3细胞中表达；
B: GFP在MEL细胞中表达；
I ,II,in，IV，V，VI:分别为GFP在对照组、496bp启动子组、283bp 启动子组、697bp启动子组、484bp启动子组、372bp启动子组；图6:检测人的EDRF基因在小鼠Md细胞中表达；
其中泳道Lanel、 3:用pcDNA(3.1+)/ZEO对照载体处理Mel结果； Lane2、 4:用pcDNA-EDRF对照载体处理Mel结果；
图7:人EDRF基因在小鼠体内的表达分析(RT-PCR);
其中泳道Lanel:用pcDNA(3.1+)/ZEO对照载体处理正常小鼠； Lane2:用pcDNA-EDRF载体处理正常小鼠； Lane3:用pcDNA(3.1+)/ZEO对照载体处理P-地中海贫血小鼠； Lane4、 5:用pcDNA-EDRF载体处理p-地中海贫血小鼠；
图8:用ELISA分析EDRF/AHSP的表达情况；
其中A:正常小鼠组
正常小鼠(healthymice， n=5):用pcDNA(3.1+)/ZEO对照载体处
理正常小鼠；
Exp-l、 Exp-2、 Exp-3:三只用pcDNA-EDRF载体处理正常小鼠； B:P-地中海贫血小鼠组
正常小鼠(healthymice， n=5):用pcDNA(3.1+)/ZEO对照载体处
理正常小鼠；
卩-地中海贫血小鼠(654- mice):用pcDNA(3.1+)/ZEO对照载体处
理p-地中海贫血小鼠； Exp-l-654、 Exp-2-654、 Exp-3-654:三只用pcDNA-EDRF载体
处理P-地中海贫血小鼠； 图9: P地中海贫血小鼠血液涂片分析血细胞形态的改变； 其中A: (3-地中海贫血小鼠用pcDNA-EDRF对照载体处理p-地中海贫
血小鼠；
B: (3-地中海贫血小鼠用pcDNA(3.1+)/ZEO对照载体处理P-地中
海贫血小鼠；
C:正常小鼠；
图10: P地中海贫血小鼠治疗后Hb和RBC的改变分析；其中A: Hb血红蛋白的改变(『5);
B: RBC红细胞数目的改变(n-5)。
具体实施例方式
以下以有效长度EDRF启动子的筛选、pcDNA-EDRF表达载体的构建及其 治疗作用为例，为本发明作进一步的阐述。这些实例是针对于本发明所作的说 明，而不是对本发明的限制。
本发明中，.以上所述和以下的实施例中，所使用的技术，包括基因测序、 PCR扩增与检测、细胞转染、载体构建等分子生物学技术，以及细胞培养、检 测技术等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用 的仪器设备、试剂、质粒和载体、细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为 一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例l，有效长度EDRF启动子的筛选
1、 不同长度EDRF启动子的克隆
设计不同长度的启动子的序列，从人基因组DNA克隆EDRF基因启动子， 引物序列见表l，具体扩增的基因区域见图1。扩增条件如下变性94"C45s、 退火45s(具体退火温度见表1)、延伸72°C60s，共32个循环。PCR产物用2% 琼脂糖凝胶进行电泳，分析结果。
设计不同长度的启动子的序列，用以扩增EDRF启动子。扩增条件如下 变性94"C45s、退火45s、延伸72"C60s，共32个循环。PCR产物用2%琼脂糖 凝胶进行电泳，分析结果，分别获得了长度为697bp、 496bp、 484bp、 372bp 和283bp的启动子，见图4A。测序正确(上海博尚生物技术有限公司)，结果 正确(略)。
2、 构建不同的GFP载体分析启动子的作用效果
用上述不同长度的启动子用于驱动GFP的表达，并构建相应的载体。首先， 通过EcoR I和Not I两酶切位点从pGEP-Nl载体(Invitrogen)上获得GFP基 因，并用同样的酶切位点将GFP连接至pcDNA(3.1+)/ZEO (Invitrogen)载体 上，构建pcDNA-GFP载体。然后，将上述启动子经PCR扩增后克隆至pUCm-T
8载体上(Takara)，构建pUCm-promoter载体。通过EcoRV和HindIII酶切 pUCm-T载体获得启动子，并应用Nru I和HindIII酶切位点克隆至pcDNA-GFP 载体上，最终获得pcDNA-Pro-GFP载体用于研究(图2)。进一步克隆了 pcDNA-Pro-GFP载体。通过两组酶切(Nod , No/I+H/^/)进行了鉴定，结果 正确，见图4B。
3、细胞培养和转染及GFP的检测和分析
NIH3T3细胞用含10%胎牛血清的DMEM (GIBICO)培养基培养，小鼠的 MEL细胞用含15。/。胎牛血清的DMEM培养，并用1.5。/。的DMSO (Sigma)诱 导分化成熟。所有细胞购自上海中科院细胞所，用37'C5。/。C02培养。
荧光检测转染后72小时收集细胞，用荧光显微镜(Leica，DMRXA2)观察 结果，其中NIH3T3细胞，用0.25%的胰酶消化。
流式细胞仪分析(FACS):细胞收集后，用PBS洗2次，然后用流式细胞 仪分析结果(Becton Dichinson FACS caliber)，通过GFP的表达反应EDRF启 动子的效率。
结果发现在NIH3T3细胞和Md细胞中，372bp长的启动子(EDRF基因的 -116~+256区)驱动GFP表达的效果最好，荧光强度最亮、阳性细胞最多(图5A, B)。 FACS进一步分析发现，在MEL细胞中，372bp长的启动子组，GFP细胞的 阳性率(11.2±0.6)%明显高于其他长度启动子驱动组；但在非红细胞NIH3T3细 胞中，372bp长的启动子组，GFP细胞的阳性率MEL细胞中为(31.0士0.7。/。)，与其 他组相比差别不是很大，上述差别说明该启动子驱动基因的表达有一定的组织 特异性(表2)。
实施例2:: pcDNA-EDRF表达载体的构建及其治疗作用
1、用上述有效启动子驱动EDRF的表达载体构建
通过上述实验构建的GFP表达载体，转染细胞后确定最有效的启动子长度 为372bp，由此为依据重新设计引物扩增EDRF基因，引物序列为
F4: 5，國GGCCTTGTTATCTTTCTACCT國3，(与引物F3基本一致，-112bp); R3: 5 ，-TTCT TGTTTCTGCCACCC-3 '(+1168bp);
9PCR反应条件为变性94。C60s,退火54。C60s，延伸72°C 90s;共30个 循环。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行鉴定，并测序。
将扩增的EDRF基因及其启动子连接至pUCm-T (Takara)载体上，构建 了 pUCm- EDRF载体，然后，通过EcoRV和BamHI酶切pUCm-EDRF载体获 得EDRF基因及其启动子，并应用Nrul和BamHI酶切位点克隆至 pcDNA(3.1+)/ZEO载体(Invitrogen)上，最终获得pcDNA-EDRF表达载体用 于研究(图3)，用H/m/m和Notl两种酶切鉴定，结果正确(图4B)，测序结果 见序列表。
2、 检测EDRF表达的方法
RT-PCR:总RNA的提取根据试剂盒说明进行(Gentra公司，总RNA提取 试剂盒)，cDNA合成体系如下1.5吗的总RNA、 4|ul dNTP(10mmol/L)、 0.5^il oligo-dT(0.5mg/ml)、 逆转录酶(RT, New England)、 DEPC H20至20W。于 70。C10min;冰上2min; 37°C lh合成cDNA。
EDRF基因扩增引物为
正向5'画CGCAGGATTGAAGGAGTTC-3，；
反向5，-GTGTCAGGGTAGAGTGGC-3，。
(3-actincDNAs引物(参照基因)为
正向5 ，-CTACAATGAGCTGCGTG TGGC画3 ，；
反向5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC國3'。
反应条件为变性94。C45s、退火57。C45s、延伸72°C45s,共28个循环。 酶联免疫吸附试验(ELISA)检观"具体过程简述如下将MEL细胞和小 鼠的血细胞裂解，于包被抗鼠的酶标板内包被，然后分别加山羊抗人EDRF的 单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology), 二抗(兔抗山羊的IgG, Abeam)及 底物等。用酶标仪(ELx800)于OD45。nm波长检测。
3、 人EDRF在小鼠体内的表达
为了研究pcDNA-EDRF表达载体能否在小鼠体内有效的表达，我们纯化了 pcDNA-EDRF质粒(方法见Promega Kit说明)，首先我们在细胞水平验证了载体的表达效果，RT-PCR分析发现EDRF在小鼠的MEL中能高效的表达(图6)。 接着对5只正常小鼠进行实验，将30-35ug pcDNA-EDRF质粒溶于800ul生理盐液 中，尾静脉注射小鼠，7天后检测小鼠外周血，观察基因表达的结果。RT-PCR 发现人的EDRF基因能在小鼠血液细胞中表达(图7.1ane2) 。 ELISA分析发现， pcDNA-EDRF处理的小鼠体内，EDRF表达量约4 mg/ml (图8)。
4、 pcDNA-EDRF载体对p地中海贫血小鼠的治疗作用
为了观察pcDNA-EDRF载体对p地中海贫血的治疗作用，我们又对5只p654-地贫小鼠进行实验，注射剂量和方法同上。其中P^-地贫小鼠购自美国Jackson Laboratory(JAX)。该小鼠模型利用基因打耙技术，敲入人的致病基因(异常剪 接的P珠蛋白基因)，代替了小鼠的p珠蛋白基因。这种模型的杂合子小鼠细胞中 有一条编码人的异常剪接(3珠蛋白肽链和一条编码小鼠的P珠蛋白肽链基因，能 表达人的异常剪接I3珠蛋白肽链，表现出典型(3地贫病人的贫血症状，是一种很 好地研究(3地贫的模型工具。
当J3^-地贫小鼠用pcDNA-EDRF载体处理后，血涂片分析发现，|3654-地贫小 鼠的靶形细胞和异性细胞总数明显减低，从原来的50%降低为约38.4±2.3% (p<0.05，图9);血红蛋白的量，从原来的7.1士0.3 g/dL上升到7.93士0.2g/dL;由于 治疗作用，机体代偿造血，红细胞数目RBC从原来的5.5xl()S/nl上升到6.4xl06/^ (图IO)。而对照组|3654-地贫小鼠，用对照载体pcDNA(3.1+)/ZEO处理，异性细胞 和靶型细胞总数、血液学指标没有明显的变化。这一治疗效果，可能与EDRF 在|3654-地贫小鼠体内表达有关系，证明了载体的治疗作用。RT-PCR(图7， lane 4,5) 和ELISA (图8)检测结果支持这一治疗效果。表格-
表l:用引物扩增不同长度的启动子
引物扩增长度(bp)序列及退火温度(Tm)F1-R1512F1: 5' -gtggcttatctgcaaaat-3';Rl:5 ， -tgagggtgcgtgaatctc-3 ，；
Tm(50。C)
F2陽R1310F2: 5'陽catttcgagcctggatac-3';Rl:5 ， -tgagggtgcgtgaatctc-3,;
Tm(54。C)
Fl-R2712F1: 5 ， -gtggcttatctgcaaaat-3 ，；R2:5 ， -aagggtagaatttacatatc-3';
Tm(50。C)
F2陽R2504F2: 5'-catttcgagcctggata-3，；R2:5'-aagggtagaatttaeatatc隱3，；
Tm(52。C)
F3-R2378F3: 5，-ttttggccttgttatctt隱3，；R2:5 ， -aagggtagaatttacatatc-3 ，；
Tm(48。C)
表2:流式细胞仪检测GFP阳性细胞的表达
启动子启动子的长度(bp)GFP阳性细胞比例(％)NIH3T3细胞Mel细胞
F1陽R149620.1±1.04.3±0.5
F2-R128325.3±0.64.5±0.4
Fl-R269727.1±1.17.8±0.6
F2-R248427.2±0.98.5±0.4
F3-R237231.0±0.711.2±0.6
阴性Blank-对照—0.2±0.10.6±0.2
12SEQ ID NO: 1序列表一测序表
<〉plasmid <> (1500) 〈〉1
gcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttUgcgctgcttcgat60
cccatgggcggcgcctgcagaccaggtctggccttgttatctttctaccttc鄉g33gc120
ctctcccttcttctcctccctsgaatga cctatcaccctccttcaggacct卿tgc鄉180
gcgtttctatcttaggctgacacttgactccttgcctacatctatagcttggcacag卿240
gattcacgcaccctc犯gagtgtgggtgag3C￡Lt￡lt3C3gcctgttagacctg犯ggtga300
gcccaacctgggaa犯tcgtgacctcagagc鄉gcaggatgtga犯ggttttggaa鄉360
agatagccctgc鄉gc郷sgggattttt gggttgggggaaatacc420
ggaa^ca^tatgtaaattctacccttttctctacccaggcagatggctc480
ttctt犯ggccaataaggatctcatttccgC3ggElttg￡L6Lggagttcagcgttctgctga540
atcagcaggtg3gtcca3gctttccatttc犯鄉ELCtggcctggsgactggggggtgcc600
gggg鄉tgg3gga卿ggataattggagctggtgaagta3tggtgg3gttgatggaaac660
aacgsiga^c3tgC卿gg3g卿gttggtgctgtggcac720
tattctagtsttcccgaatcccattgctggiccacattctcccttgccaactgcctctccg780
CaBCCCCCC￡Lggtcttcaatgatcctctcgtctctgaaga卿catggtgactgtggtgg840
gaacttctacatcaactattacaggcagcaggtg3C3ggggagccccaag900
ggctctgcaggagcttcggc肌gagctg犯cactctggccaaccctttcc960
tggccaagtacagggacttcctgaagtctcatgagctcccgagtcacccaccgccctcct1020
cctagctcagggacccagcccctcctctctgaga犯ctctgaccttcatgtccttaggct1080
gtgctcctgccactctaccctgacacctcaataaagaccagtgctggttttgttggactt1140
cctggcttctctttcatggtctgtcctgacatgtggaggcactcggtccctttccttccg1200
ccctccttcttagatatgctcttggaagctt犯ttccttacagc卿ggttagcagcctt1260
gagtg￡LCC￡LCcgggcsgcgattctaaacta3￡L￡lC3ggCtg犯cgagggcc鄉犯ggcgg1320
gactag卿gagtgc卿gctgcaggggagggggtggcsg卿ctgg卿1380
tctggatccactagtccagtgtggtggaattctgcagatatccagcacagtggcggccgc1440
tcgagtctagagggcccgtttsaacccgctgatcagcctcgactgtgccttcta1500
权利要求
1、一种EDRF基因片段，其序列如SEQ ID NO1所示。
2、 一种EDRF基因片段的表达载体，其特征是，该表达载体具有权利要求1所述基因片段。
3、 一种EDRF基因片段在治疗(3地中海贫血中的应用。
4、 根据权利要求3所述的一种EDRF基因片段在治疗j3地中海贫血中的应用，其特征是，应用EDRF稳定过多的oc珠蛋白肽链，降低其沉积，缓解(3地中海贫血症状。
全文摘要
本发明公开了一种EDRF基因片段及其表达载体，并通过实验证明，该载体能够稳定过多的α珠蛋白肽链，降低其沉积，减轻多余的α链形成α包涵体的危害，缓解了β⁶⁵⁴-地贫小鼠的贫血症状，证明EDRF基因表达在红细胞系和疾病治疗中的价值，为地中海贫血的治疗提供了新的思路。
文档编号C12N15/12GK101475936SQ20081015777
公开日2009年7月8日 申请日期2008年10月17日 优先权日2008年10月17日
发明者真 岳, 强 李, 李尊岭, 李有杰, 飞 焦, 王萍玉, 谢书阳 申请人:滨州医学院