转基因水稻pa110-15外源插入片段旁侧序列及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了转基因水稻PA110-15外源插入片段旁侧序列及应用。本发明首先提供了转基因水稻PA110-15品系外源插入基因的5’端序列以及3’侧翼序列，其核苷酸序列分别为SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。本发明以所述侧翼序列为靶基因提供了转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR检测引物以及品系特异性定性检测方法。特异性实验表明，本发明建立的转基因水稻PA110-15品系特异性定性PCR检测方法具有高度的特异性。灵敏度测试结果表明，本发明建立的检测方法灵敏度达到0.1%。
【专利说明】转基因水稻PA110-15外源插入片段旁侧序列及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转基因水稻品系的外源插入片段旁侧序列，尤其涉及转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15外源片段和侧翼水稻序列的连接区序列，本发明进一步涉及转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR检测引物、定性检测方法及检测试剂盒，属于转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性检测领域。
【背景技术】
[0002]随着转基因植物的广泛种植，转基因食品的安全性问题也引起人们极大的关注，已有50多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度，其中也包括中国。转基因标识制度的实施依赖于对转基因植物及其加工产品的成分检测。PCR技术是目前国内外检测转基因产品中应用最广泛的方法。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，和前三种方法比较，品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。
[0003]目前，已有部分专利和文献报道了转基因植物的品系特异性检测方法。例如:张大兵等人于2006年建立了转基因M0N863玉米的品系特异性检测方法；谢家建等人建立了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号等一系列品系特异性检测方法；卢长明等人于2007年建立了一系列转基因油菜的品系特异性检测方法。
[0004]PA110-15是以两系温敏不育系培矮64S (PA64S)为受体，通过农杆菌介导获得的转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻。迄今为止，缺乏一种特异性强、灵敏度高的转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PAl 10-15品系特异性PCR检测方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15外源片段和侧翼水稻序列的连接区序列；
[0006]本发明的目的之二是提供转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR检测引物；
[0007]本发明的目的之三是建立转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR定性检测方法；
[0008]本发明的目的之四是提供转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR定性检测试剂盒。
[0009]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0010]本发明根据转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系中插入的目的基因为LRP基因(SEQ ID N0.19)通过H1-TAIL PCR获得外源插入基因和5’端水稻侧翼序列的连接区序列(SEQ ID N0.1)，该连接区序列的长度为1451bp，其中，第1-1144位为水稻基因组序列(位于水稻第4染色体的1063000 - 1064144位，GenBank登记号:NC_008397)，第1146-1336位为质粒pSBLRP584骨架序列，第1337-1451位为水稻谷蛋白基因Gtl的启动子序列。
[0011]本发明进一步获得了外源插入基因和3’端水稻侧翼序列的连接区序列(SEQ IDN0.2)，该连接区序列的长度为783bp，其中，第1-262位为NOS终止子序列，为263-569位为质粒pSBLRP584骨架序列，第570-783位为水稻基因组序列(位于水稻第4染色体的第1064179-1064392 位，GenBank 登记号:NC_008397)。
[0012]本发明根据SEQ ID N0.1所示的5’端旁侧序列为靶基因设计了 4对检测引物，4 对引物分别为:引物对 1:PA110-5_F1/R1 (SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4);引物对 2:PA110-5-F2/R2CSEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6);引物对 3:PA110-5_F3/R3(SEQ ID N0.7 和SEQ ID N0.8);引物对 4:PA110-5-F4/R4(SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10);本发明分别以上述4对引物建立PCR扩增体系对PAl 10-15进行扩增检测，扩增结果发现引物PA110-5-F1/Rl (SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4)和 PA110-5-F2/R2 (SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6)特异性好、扩增条带清晰；本发明进一步通过体系优化，设计引物终浓度和退火温度的正交实验，最终发现引物组合PA110-5-F1/R1作为5’端转化体特异性检测引物特异性最好，扩增效率最闻，引物二聚体也最少。
[0013]本发明进一步以SEQ ID N0.2所示的3’端旁侧序列为靶基因设计了 4对检测引物，4对引物分别为:引物对5:PA110-3_F1/R1 (SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12);引物对
6:PA110-3-F2/R2 (SEQ ID N0.13 和 SEQ ID N0.14);引物对 7:PA110-3_F3/R3 (SEQ IDN0.15 和 SEQ ID N0.16);引物对 8:PA110-3_F4/R4 (SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.18);本发明分别以上述四对引物建立PCR扩增体系对PA110-15进行扩增检测，扩增结果发现引物PA110-3-F1/R1和PA110-3-F3/R3特异性好、扩增条带清晰；本发明进一步通过体系优化，设计引物终浓度和退火温度的正交实验，最终发现引物组合PA110-3-F3/R3作为3’端转化体特异性检测引物具有最佳的检测效果。
[0014]本发明的目的之二是提供一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR检测方法，该方法包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ; (2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.1所示的5’端旁侧序列为靶基因设计特异性引物对，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品不是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系。
[0015]其中，所述的特异性引物对选自以下4对引物中的任意一对:核苷酸序列为SEQID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物对I ;核苷酸序列为SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物对2 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示引物对3 ;核苷酸序列为SEQID N0.9和SEQ ID N0.10所示的引物对4。
[0016]优选的，一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PAl 10-15品系特异性的PCR定性检测方法，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；(2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物对建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出262bp的目的条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果从待检测的样品中未能扩增出262bp的目的条带，则待检测的水稻样品不是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系。
[0017]本发明还提供另一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR检测方法，该方法包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ; (2)以提取的DNA为模板，以SEQ IDN0.2所示的3’端旁侧序列为靶基因设计特异性引物对，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品不是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系。
[0018]其中，所述的特异性引物对选自以下4对引物中的任意一对:核苷酸序列为SEQID N0.11和SEQ ID N0.12所示的引物对5 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物对6 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示引物对7 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物对8。
[0019]优选的，一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR检测方法，该方法包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；(2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的引物对建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出376bp的条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果从待检测的样品中未能扩增出376bp的条带，则待检测的水稻样品不是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PAl 10-15品系。
[0020]其中，所述的 从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。
[0021]PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测结果的特异性和灵敏度均有一定的影响；本发明考察了 PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测的特异性和灵敏度的影响，实验结果发现在引物终浓度为0.2 μ M、退火温度为58°C时，检测结果的特异性最强，灵敏度最高。
[0022]本发明中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立:反应体系的总体积为25.0 μ L，其中，10XPCR 缓冲液 2.5 μ L, 25mmol/L 氯化镁溶液 1.5 μ L，IOmmoI/L dNTPs 混合溶液(各 2.5mmol/L)2 μ L，10 μ mol/L 上游引物 0.5 μ L, 10 μ mol/L 下游引物 0.5 μ L, 5U/μ L Taq 酶 0.125yL，25mg/L DNA 模板 2.0 μ L，余量为双蒸水。
[0023]所述的PCR扩增条件优选为:95°C变性5min ;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共进行35次循环；72°C延伸7min。
[0024]本发明进一步的目的是提供一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR定性检测试剂盒，包括:10 XPCR缓冲液，氯化镁溶液，dNTPs混合溶液，PCR定性检测引物对，Taq酶和双蒸水；其中，所述PCR定性检测引物对优选自以下8对引物中的任意一对:核苷酸序列为SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物对I ;核苷酸序列为SEQID N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物对2 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示引物对3 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的引物对4 ;核苷酸序列为SEQID N0.11和SEQ ID N0.12所示的引物对5 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物对6 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的引物对7 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物对8。
[0025]采用本发明建立的品系特异性PCR定性检测方法对转基因水稻科丰6号、科丰8号、克螟稻、M12、TT51-1以及其它的转基因植物和非转基因植物材料进行了定性检测，定性PCR扩增结果表明，仅在转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15阳性材料基因组中扩增得到了预期大小的目的片段条带，在其它转基因水稻和其它转基因植物以及常规水稻PA64S等基因组中没有扩增得到预期目的片段；
[0026]本发明分别用5 ’特异性检测引物(PAl 10-5-F1/R1)和3，特异性检测引物(PA110-3-F3/R3)对转基因水稻PA110-15、其他转基因水稻材料(M12、TT51-1、科丰6号、科丰8号和克螟稻)以及非转基因水稻PA64S进行PCR扩增，结果显示，这2对引物能特异性区分转基因水稻PA110-15，而在其他转基因水稻和非转基因水稻中没有任何扩增，实验结果表明，本发明所建立的转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性定性PCR检测方法特异性强。
[0027]灵敏度测试结果表明，本发明的5’端检测引物PA110-5-F1/R1或3’端检测引物PA110-3-F3/R3都能从0.05%含量的PA110-15转基因样品中得到有效扩增，本发明检测灵敏度可以稳定达到0.1%。
【专利附图】
【附图说明】[0028]图1H1-TAIL PCR 扩增结果。
[0029]图25’端转化体特异性检测引物筛选结果；M:100bp Marker; 1-3:PA110-15;4:受体材料-CK; 5:空白对照。
[0030]图3 引物体系优化；M:100bp Marker; 1-6:PA110_15; 7:受体材料 _CK;8:空白对照。
[0031]图43’端转化体特异性检测引物筛选;M:100bp Marker; 1-3:PA110-15;4:受体材料-CK; 5:空白对照。
[0032]图5 引物体系优化；M:100bp Marker; 1-6:PA110_15; 7:受体材料 _CK;8:空白对照。
[0033]图6转化体5 ’端检测方法特异性测试；M: IOObp Marker; 1-3:PA110-15; 4:M12;5:TT51-1;6:科丰6号；7:科丰8号；8:克螟稻；9:转基因玉米混合样；10:转基因油菜混合样；11:转基因大豆混合样；12:转基因棉花混合样；13，14:非转基因水稻PA64S;15:空白对照。
[0034]图7转化体3 ’端检测方法特异性测试；M: IOObp Marker; 1-3:PA110-15; 4:M12;5:TT51-1;6:科丰6号；7:科丰8号；8:克螟稻；9:转基因玉米混合样；10:转基因油菜混合样；11:转基因大豆混合样；12:转基因棉花混合样；13，14:非转基因水稻PA64S;15:空白对照
[0035]图8PA110-5-F1/R1 检测灵敏度；M:100bp Marker; 1，2:PA110-15 质量分数为10%; 3, 4:PA110-15 质量分数为 1%;5，6:PA110-15 质量分数为 0.5%; 7, 8:PA110-15 质量分数为 0.1%;9，10:PA110-15 质量分数为 0.05%; 11, 12:PA110_15 质量分数为 0.01%; 13, 14:受体材料-CK; 15，16:空白对照。
[0036]图9PA110-3-F3/R3 检测灵敏度；M:100bp Marker; 1，2:PA110-15 质量分数为10%; 3, 4:PA110-15 质量分数为 1%;5，6:PA110-15 质量分数为 0.5%; 7, 8:PA110-15 质量分数为 0.1%;9，10:PA110-15 质量分数为 0.05%; 11, 12:PA110_15 质量分数为 0.01%; 13, 14:受体材料-CK; 15，16:空白对照。
[0037]实施例1转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15外源插入基因的侧翼序列的获取
[0038]转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15外源插入目的基因为LRP基因，其碱基序列为SEQ ID N0.19所示。
[0039]通过H1-TAIL PCR获得外源插入基因和5’端水稻侧翼序列的连接区序列(SEQ IDN0.1)以及外源插入基因和3’端水稻侧翼序列的连接区序列(SEQ ID N0.2)。
[0040]TAIL-PCR技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(special prime,简称spl, sp2, sp3,约20bp),用它们分别和I个具有低T值的短的(14bp)随机简并引物(Arbitrary degenerate primes,简称AD)相组合，以基因组DNA作为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物；TAIL-PCR分为3次反应。第1次PCR反应由5次高特异性反应、I次低特异性反应、10次较低特异性反应和12次热不对称的超级循环构成。通过5次高特异性的反应，使spl与载体上LRP的序列退火并延伸，提高目标序列的浓度。I次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上，10次较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火，随后进行12次TAIL循环。经过上述反应得到了不同浓度的3种类型的产物:特异性产物(I型)和非特异性产物(II型和III型)。第2次反应则将第一级反应的产物稀释40倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性的产物被选择性地扩增，而非特异性的产物被压制到极低的含量。第3次反应又将第2次反应的产物稀释40倍作为模板，设置为普通的热不对称PCR超级循环。通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。挑取比较理想的条带直接用PCR产物测序，最后由SP3和ADl获得了 LRP基因启动子一边的旁侧序列，对获得的目标序列 进行DNA测序，并将测序结果在NCBI上进行Blast比对，则可得知LRP基因插入的具体位置。
[0041]终止子一边旁侧序列的验证:一条引物设在NOS (终止子)序列上，一条设在已测出的左侧旁侧序列上，预期长度为777bp，引物为6F/6R。引物都扩增到了预期长度的产物(图1)，将这片段的PCR产物进行测序，测序结果证明本发明获得的旁侧序列是正确的。具体PCR引物序列见表1。
[0042]表1PCR引物序列
[0043]
【权利要求】
1.转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系外源插入基因和5’端水稻侧翼序列的连接区序列，其特征在于:其为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系外源插入基因和3’端水稻侧翼序列的连接区序列，其特征在于:其为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的连接区核苷酸作为检测转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系靶基因中的应用。
4.权利要求2所述的连接区核苷酸作为检测转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系靶基因中的应用。
5.转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR检测引物，其特征在于，选自以下8对引物中的任意一对:核苷酸序列为SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物对I;核苷酸序列为SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物对2 ;核苷酸序列为SEQ IDN0.7和SEQ ID N0.8所示引物对3 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的引物对4 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的引物对5 ;核苷酸序列为SEQID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物对6 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的引物对? ;核苷酸序列为SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物对8。
6.一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR定性检测方法，其特征在于，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；(2)以提取的DNA为模板，以权利要求5所述PCR检测引物对建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出预期的目的条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系或其衍生系；相同条件下，如 果从待检测的样品中未能扩增出预期的目的条带，则待检测的水稻样品不是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系或其衍生系。
7.一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR定性检测方法，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；(2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示的引物对建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出262bp的目的条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系或其衍生系；相同条件下，如果从待检测的样品中未能扩增出262bp的目的条带，则待检测的水稻样品不是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系或其衍生系。
8.一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR检测方法，该方法包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；(2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.15和SEQ IDN0.16所示的引物对建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出376bp的条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系或其衍生系；相同条件下，如果从待检测的样品中未能扩增出376bp的条带，则待检测的水稻样品不是转闻赖氣酸储减蛋白基因水稻PAl 10_15品系或其衍生系。
9.按照权利要求6-8任何一项所述的PCR定性检测方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为:反应体系的总体积为25.0 μ L，其中，10XPCR缓冲液2.5 μ L, 25mmol/L氯化镁溶液 1.5 μ L，IOmmoI/L dNTPs 混合溶液(各 2.5mmol/L)2 μ L，10 μ mol/L 上游引物 0.5 μ L,1(^11101/1下游引物0.5 4 1^，5~4 1^ Taq 酶 0.125μ L,25mg/L DNA 模板 2.0 μ L，余量为双蒸水； 所述的PCR扩增条件为:95°C变性5min ;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共进行35次循环；72°C延伸7min。
10.一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15的品系特异性PCR定性检测试剂盒，包括=IOXPCR缓冲液，氯化镁溶液，dNTPs混合溶液，检测上下游引物对，Taq酶和双蒸水；其特征在于:所述 检测上下游引物为权利要求5所述的PCR检测引物。
【文档编号】C12N15/11GK103966208SQ201410081893
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】杨剑波, 马卉, 李莉, 凃巨民, 沈平, 汪秀峰, 宋贵文, 倪大虎, 魏鹏程, 段武德, 陆徐忠, 宋丰顺, 李 浩, 王淑云 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所