用于检测慢性乙型肝炎及肝癌t细胞受体库的引物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于检测慢性乙型肝炎及肝癌T细胞受体库的引物及检测试剂盒，所述试剂盒中包括的特异性引物序列分别如SeqIDNo.1-8所示。本发明的试剂盒产品具有高通量，多指标并行检测，检测快速、准确等优点。实验表明，采用本发明的试剂盒可以实现对从慢性HBV感染到肿瘤发生进程中T细胞应答的规律检测，以及抗HBV及肝癌特异性T细胞应答的分子特征判定。
【专利说明】用于检测慢性乙型肝炎及肝癌T细胞受体库的引物及试剂 合 Sl
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学检测领域，具体地说，涉及用于检测慢性乙型肝炎及肝癌T 细胞受体库的引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 我国属于乙型肝炎的高发区，而HBV持续感染也是导致我国肝癌发病的主要原 因，我国70-90%的HCC患者合并HBV持续感染。随着近年来对慢性乙型肝炎以及肝癌发病 机制的深入研究发现，由于HBV感染所导致的肝脏非可控性炎症的发生以及长期进展是乙 肝相关肝癌发生、发展的主要原因。HBV的慢性感染，伴随着病毒持续地复制，可进一步发 展为肝硬化，部分患者最终导致肝癌。而抗病毒免疫应答功能缺陷是慢性乙型肝炎最重要 的特征之一，具体表现为：1)固有免疫损伤；2)特异性免疫损伤；3)增强的肝脏免疫抑制。 进一步研究证实，HBV感染后疾病的临床转归与个体的T细胞的免疫应答强度、宽度和持续 的时间密切关联，故在影响慢性乙型肝炎疗效的诸多因素中，宿主的免疫状态以及T细胞 抗病毒免疫应答在很大程度上决定了感染的临床转归和进展。
[0003] 在HBV持续感染所导致的肝脏肿瘤发生的进程中，研究证实：1)肝癌患者体内虽 存在多克隆、多特异性的肿瘤抗原特异的细胞毒T细胞，但是仅有少部分肝癌患者可诱发 出显著的肿瘤抗原特异的T细胞免疫应答；2)慢性HBV感染者中具有非特异性免疫抑制的 细胞亚群(如⑶4+⑶25+调节性T细胞)增多及活化可对患者发生的HCC特异性⑶8+T细胞 的应答产生交叉抑制，抑制针对HCC的抗肿瘤免疫应答，导致肿瘤细胞逃避机体免疫监视， 促进HCC发生和进展。
[0004] 慢性HBV感染以及肝癌的发生发展过程是机体免疫系统与病毒及肿瘤细胞相互 作用的过程。无论是对于在慢性乙型肝炎阶段机体产生抗HBV的特异性免疫应答以及肝细 胞癌肿瘤发生和进展过程中产生的特异性抗肿瘤免疫应答，T细胞在清除HBV感染的肝细 胞及肿瘤排斥中均起到核心作用，对T细胞受体库（T cell receptor repertoire)表达的 分析可反映抗原激发的T细胞免疫反应状况。从慢性HBV感染进展到肿瘤的发生，不仅伴 随着机体抗原谱学的改变(从大量的HBV抗原表达转换至大量肿瘤抗原表达)，同时还伴随 着宿主T细胞克隆扩增的动态变化。机体能否产生足够的抗HBV特异性T细胞免疫应答、 抗肿瘤T细胞免疫应答影响着HBV慢性化进程及肿瘤的进展、预后。
[0005] T细胞应答的特异性是通过其受体（TCR)与MHC分子结合的特异性多肽的识别来 实现的，一方面病原微生物蛋白在体内降解，经过抗原加工后产生的特异性多肽与MHC分 子结合并提呈至细胞表面。另一方面，T细胞发育和分化过程中TCR基因经过重排进而表 达抗原受体，形成庞大的TCR库（repertoire)。经典的克隆选择学说认为：TCR是在胚系基 因的基础上，于胸腺中进行V、D、J、C基因片段重排(组合、插入、剪接）而形成多样性的抗原 互补决定区（⑶R1、⑶R2、⑶R3)，其中"⑶R3区"（又称超变区）组成最具有多样性的⑶R3 受体库。TCR是由a、P链或y、S链构成的异源性二聚体，据数学估计一个人的T细胞 受体库多样性的理论值为IO14至1〇15,即使经过正选择和负选择之后的实际值在IXIO 9左 右，其中CDR3区对于整个TCR库的多样性共享非常大。不同T细胞克隆具有不同序列或不 同长度的TCR CDR3基因，从而决定其特异性。CDR3基因序列出现的频率可以反映相应T细 胞克隆扩增的程度，从而反映T细胞功能状态。在多种情况下，个体TCR CDR3库的综合基 因表达分析对评价免疫应答很有意义，通过研究TCR CDR3的表达频率，筛选克隆性增殖的 T细胞和感染、肿瘤、自身免疫病、器官移植等的关系，可为这些疾病的诊断和治疗提供基 础和手段。
[0006] 鉴于T细胞在限制病毒感染、肿瘤发生进展等过程中起到关键作用，TCR⑶R3受 体库的多样性可能影响了 CTL的杀伤能力并调控着免疫自稳状态，通过研究慢性HBV感染 者向肝癌恶性转化中，不同TCR V、D、J、C重排及TCR⑶R3受体库的产生和维持，及与其关 联的抗原谱学变化，追踪不同的T细胞亚群，对于明确从慢性HBV感染到肿瘤发生进程中T 细胞应答的规律，寻找并分析抗肿瘤T细胞的分子特征，为患者个体化T细胞的过继治疗 和肿瘤疫苗的研制等提供基础。
[0007] 由于T细胞受体库的高度多样性，理论上，对于单个个体的TCR库的测序量应该大 于20GB (200亿碱基对)，而读长在IOObp左右或更长。虽然，TCR的检测方法多样，每种方 法都有其利弊，如何建立一种特异、敏感且能进行大量筛选的方法成为各个实验室期望突 破的关键。近年来随着测序技术的快速发展及测序成本的明显降低，使系统地研究个体的 TCR库多样性成为可能。2011年，Warren RL等首次报道采用高通量测序技术研究人外周 血!'□^库P链全基因的多样性，将研究范围扩展到了 V、J重排规律及不同核苷酸/氨基酸 的使用频率。后续研究进一步证实这种大规模平行测序不仅增加了检测的深度(能够检出 TCR库中极低含量的克隆)，而且提高了检测的精确度（能够分辨仅存在少量核苷酸差异的 克隆)，是一种研究TCR库多样性的强有力方法。
[0008] 关于T细胞受体库的高通量测序分析研究最近两年才见报道，Freeman等通过 Illumina的Solexa测序对多个人外周血组合的样本T细胞⑶R3受体库的多样性的研 究，为直接对CDR3区碱基/氨基酸序列分析提供了一种有效方法，洞察针对未知抗原免 疫应答过程中T细胞受体库的动力学改变。进而他们通过对1例健康的捐赠者外周血 TCRP OTR3受体库，在相距7天两个时间点的动态分析初步揭示了 TCRP OTR3受体库中V、 J重排规律和氨基酸的使用频率，这种大规模平行测序提供一个强有力的方法来描述T细 胞受体的多样性。而对于T细胞不同亚群的高通量测序为同时对比不同亚群之间的CDR3 受体库，明确各亚群之间存在相同的基因序列以及不同亚群T细胞应答机制的研究提供了 新的思路和手段。在疾病研究领域，最近研究报道TCR受体库定量分析也用于对于骨髓移 植患者术后免疫重建评价。而在急性移植物抗宿主病（aGVHD)中利用TCR受体库追踪同种 异体反应性T细胞也作为一种具有潜在应用价值的个性化的指导诊断和治疗的方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供用于检测慢性乙型肝炎及肝癌T细胞受体库的引物。
[0010] 本发明的另一目的是提供含有上述引物的检测试剂盒。
[0011] 为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测慢性乙型肝炎及肝癌T细胞受体库 的引物，包括如下引物组合：
[0012] I)特异性逆转录引物TCR-RTl-alpha和TCR-RTl-beta，序列分别如Seq ID No. 1-2 所示；
[0013] 2 ) TCR 第一轮特异性 PCR 扩增引物：TCR-IstPCR-5' primer、TCR-IstPCR-alpha 和 TCR-lstPCR-beta，序列分别如 Seq ID No. 3-5 所示；
[0014] 3)TCR 第二轮特异性 PCR 扩增引物：TCR-2ndPCR-5' primer、TCR-2ndPCR-alpha 和 1'〇?-211(^〇^^七3，序列分别如569 10吣.6-8所示。
[0015] 本发明还提供含有上述引物的用于检测慢性乙型肝炎及肝癌T细胞受体库的试 剂盒。
[0016] 优选地，所述试剂盒中还包括引物Oligo-dG、DTT (1，4-二硫代苏糖醇)、dNTP混 合物、Superscript? III RT、第一链缓冲液、PCR缓冲液、DNA聚合酶及MgSO4等中的一种或 多种。其中，引物01ig〇-dG的序列如Seq ID No. 9所示。
[0017] 更优选地，所述试剂盒中还包括慢性乙型肝炎及肝癌特异性T细胞受体库标准 品。
[0018] 本发明进一步提供上述引物或试剂盒在检测慢性乙型肝炎及肝癌T细胞受体库 中的应用。
[0019] 所述应用包括以下步骤：
[0020] 1)提取样品总RNA ;
[0021] 2)以步骤1)中提取的RNA为模板，利用特异性逆转录引物TCR-RTl-alpha和 TCR-RTl-beta，进行TCRa和0链特异性逆转录反应；
[0022] 3)第一轮PCR扩增：以步骤2)的反应产物为模板，利用TCR第一轮特异性PCR扩 增引物，采用5' RACE法扩增TCRa和0链；
[0023] 4)第二轮PCR扩增：以步骤3)的扩增产物为模板，利用TCR第二轮特异性PCR扩 增引物，采用5' RACE法扩增TCRa和0链；
[0024] 5 )分析PCR扩增产物。
[0025] 其中，步骤2)中逆转录反应条件为：42°C，90min ;72°C，7min ;4°C，m。
[0026] 步骤3)中第一轮PCR扩增反应条件为：
[0027] TCR-alpha :94 °C，2min ;94 °C，30s ;55 °C，30s ;68 °C，45s，共 30 个循环；68 °C， 5min ；4°C 00 ；
[0028] TCR-beta :94°C，2min ;94°C，30s ;59°C，30s ;68°C，45s，共 30 个循环；68°C，5min ; 4°C 00。
[0029] 步骤4)中第二轮PCR扩增反应条件为：
[0030] TCR-alpha :94°C，2min ;94°C，30s ;68°C，75s，共 20 个循环；68°C，5min ;4°C ⑴；
[0031] TCR-beta :94°C，2min ;94°C，30s ;68°C，75s，共 20 个循环；68°C，5min ;4°C ⑴。
[0032] 利用上述试剂盒进行检测的具体步骤如下：
[0033] (I)TCRa和0链特异性逆转录
[0034] A.根据表 1 配好以下 RNA/TCR-primer mixture ;
[0035] B. RNA/TCR-alpha-primer mixture ；
[0036] C.将上述mixture震荡混勻，稍离心；
[0037] D?反应条件为 42°C，90min ;72°C，7min ;4°C，⑴；
[0038] E. cDNA产物置冰上备用；
[0039] 表 lRNA/TCR-alpha-primer mixture
【权利要求】
1. 用于检测慢性乙型肝炎及肝癌T细胞受体库的引物，其特征在于，包括如下引物组 合： 1) 特异性逆转录引物TCR-RTl-alpha和TCR-RTl-beta，序列分别如Seq ID No. 1-2所 示； 2. TCR 第一轮特异性 PCR 扩增引物：TCR-lstPCR-5' primer、TCR-lstPCR-alpha 和 TCR-lstPCR-beta，序列分别如 Seq ID No. 3-5 所示； 3. TCR 第二轮特异性 PCR 扩增引物：TCR-2ndPCR-5' primer、TCR-2ndPCR-alpha 和 1'〇?-211(^〇^^七3，序列分别如569 10吣.6-8所示。
2. 含有权利要求1所述引物的用于检测慢性乙型肝炎及肝癌T细胞受体库的试剂盒。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括引物Oligo-dG、 DTT、dNTP混合物、Superscript? III RT、第一链缓冲液、PCR缓冲液、DNA聚合酶及MgSO4 中的一种或多种。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物01ig〇-dG的序列如Seq ID No. 9所示。
5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括慢性乙型肝炎及 肝癌特异性T细胞受体库标准品。
6. 权利要求1所述引物或权利要求2-5任一项所述试剂盒在检测慢性乙型肝炎及肝癌 T细胞受体库中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取样品总RNA ; 2) 以步骤1)中提取的RNA为模板，利用特异性逆转录引物TCR-RTl-alpha和 TCR-RTl-beta，进行TCRa和0链特异性逆转录反应； 3) 第一轮PCR扩增：以步骤2)的反应产物为模板，利用TCR第一轮特异性PCR扩增引 物，采用5' RACE法扩增TCRa和0链； 4) 第二轮PCR扩增：以步骤3)的扩增产物为模板，利用TCR第二轮特异性PCR扩增引 物，采用5' RACE法扩增TCRa和0链； 5) 分析PCR扩增产物。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中逆转录反应条件为：42°C， 90min ;72°C,7min ;4°C，⑴。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤3)中第一轮PCR扩增反应条件为： TCR-alpha :94 °C，2min ;94 °C，30s ;55 °C，30s ;68 °C，45s，共 30 个循环；68 °C，5min ; 4°C°° ； TCR-beta :94 °C，2min ;94 °C，30s ;59 °C，30s ;68 °C，45s，共 30 个循环；68 °C，5min ; 4°C 00。
10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤4)中第二轮PCR扩增反应条件为： TCR-alpha :94°C，2min ;94°C，30s ;68°C，75s，共 20 个循环；68°C，5min ;4°C ⑴； TCR-beta :94°C，2min ;94°C，30s ;68°C，75s，共 20 个循环；68°C，5min ;4°C ⑴。
【文档编号】C12Q1/68GK104212911SQ201410081683
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】张恒辉刘翟陈红松高福, 陈衍辉朱宝利 申请人:北京大学人民医院, 中国科学院微生物研究所