靶向cd22的强杀伤性嵌合抗原受体t细胞及其在制备治疗肿瘤的药物中的用图
【专利摘要】本发明提供了一种抗CD22嵌合抗原受体，其中，该抗CD22嵌合抗原受体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列，并且，该抗CD22嵌合抗原受体能够识别CD22蛋白且能够在识别CD22蛋白后活化酪氨酸信号通路。本发明还提供了如上所述的抗CD22嵌合抗原受体的编码核酸、表达载体、细胞、药物组合物和它们的用途。通过上述技术方案，本发明的表达抗CD22嵌合抗原受体的T淋巴细胞针对表达CD22的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用和非常强的杀伤能力。
【专利说明】
靶向CD22的强杀伤性嵌合抗原受体T细胞及其在制备治疗肿 瘤的药物中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及医药生物技术领域，具体地，涉及一种靶向CD22的嵌合抗原受体、其编 码核酸、表达载体、细胞、药物组合物和它们的用途。
【背景技术】
[0002] 嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)是人工合成的T细胞受体，由胞 外革巴向连接区（由单链抗体或配体），以及T细胞的激活信号结构域(铰链区、跨膜区、胞内信 号转导区）组成。胞外靶向连接区由单链抗体或配体构成，具有特异性结合靶抗原的功能。 跨膜区具有传导信号的功能，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM)CD3(或 FCSRH及共刺激信号分子CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。
[0003] CAR能够识别细胞表面未经加工处理的蛋白，不受MHC限制;且CAR与配体之间的结 合力较正常T细胞受体与肽-MHC间的结合力更大;CAR的识别也不受共刺激分子协同表达的 限制。因此，CAR修饰T细胞过继治疗可较好地克服肿瘤细胞的下调MHC分子或者减少共刺激 因子表达等免疫逃避机制。
[0004] ⑶22为135kDa膜糖蛋白，并且属于称为唾液酸粘附素的唾液酸结合蛋白家族。生 理上，其在B细胞发育早期的细胞质中可检测到，与IgD同时出现在细胞表面，并且存在于大 多数成熟B细胞上，而在干细胞或浆细胞上不存在。病理上，CD22在包括NHL、急性成淋巴细 胞性白血病（B-ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)和尤其是急性非淋巴细胞性白血病 (A-NLL)在内的大多数B细胞白血病和淋巴瘤中均有表达。
[0005] 利用抗CD22抗体构建嵌合抗原受体表达于T细胞表面，可使T细胞特异性杀伤CD22 阳性的肿瘤细胞，但是，杀伤能力仍然较低。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有的表达抗CD22嵌合抗原受体的T细胞杀伤CD22阳性的肿 瘤细胞的杀伤能力仍然较低的缺陷，提供一种杀伤能力较高的表达抗CD22嵌合抗原受体的 T细胞。
[0007] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种抗CD22嵌合抗原受体，其中，该抗 ⑶22嵌合抗原受体的氨基酸序列包括SEQ ID NO. 1所示的序列，并且，该抗⑶22嵌合抗原受 体能够识别CD22蛋白，且能够在识别CD22蛋白后活化酪氨酸信号通路。
[0008] 另一方面，本发明提供了一种核酸，其中，该核酸编码如上所述的抗CD22嵌合抗原 受体。
[0009] 另一方面，本发明提供了一种表达载体，其中，该表达载体插入有如上所述的核 酸，并且该表达载体能够在转染宿主细胞后，使得被转染的宿主细胞表达如上所述的抗 CD22嵌合抗原受体。
[0010] 另一方面，本发明提供了一种表达抗CD22嵌合抗原受体的细胞，其中，该表达抗 CD22嵌合抗原受体的细胞由宿主细胞转染如上所述的表达载体后得到，并且能够表达如上 所述的抗CD22嵌合抗原受体。
[0011] 另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其中，该药物组合物的有效成分包括如 上所述的表达抗CD22嵌合抗原受体的细胞。
[0012] 再一方面，本发明还提供了如上所述的抗CD22嵌合抗原受体、如上所述的核酸、如 上所述的表达载体、如上所述的表达抗CD22嵌合抗原受体的细胞在制备治疗肿瘤的药物中 的用途。
[0013] 通过上述技术方案，本发明的表达抗CD22嵌合抗原受体的T淋巴细胞针对表达 CD22的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用和非常强的杀伤能力。
[0014] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0015] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0016] 图1是实施例3中转染实施例2的慢病毒的流式细胞结果图。
[0017]图2是实施例3中转染对比例2的慢病毒的流式细胞结果图。
[0018] 图3是实施例3中转染空载体的慢病毒的流式细胞结果图。
【具体实施方式】
[0019] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0020] 一方面，本发明提供了一种抗CD22嵌合抗原受体，其中，该抗CD22嵌合抗原受体的 氨基酸序列包括SEQ ID NO. 1所示的序列，并且，该抗⑶22嵌合抗原受体能够识别⑶22蛋白 且能够在识别CD22蛋白后活化酪氨酸信号通路。
[0021]其中，优选地，该抗⑶22嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0022]本发明还提供了一种核酸，其中，该核酸编码如上所述的抗CD22嵌合抗原受体。 [0023] 其中，优选地，该核酸如SEQ ID N0.2所示。
[0024]另一方面，本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体插入有如上所述的核 酸，并且该表达载体能够在转染宿主细胞后，使得被转染的宿主细胞表达如上所述的抗 CD22嵌合抗原受体。
[0025]其中，优选地，该表达载体为慢病毒表达载体。
[0026]再一方面，本发明还提供了 一种表达抗⑶22嵌合抗原受体的细胞，其中，该表达抗 CD22嵌合抗原受体的细胞由宿主细胞转染如上所述的表达载体后得到，并且能够表达如上 所述的抗CD22嵌合抗原受体。
[0027]其中，所述宿主细胞可以为T细胞。
[0028] 再一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其中，该药物组合物的有效成分包括 如上所述的表达抗CD22嵌合抗原受体的细胞。
[0029] 再一方面，本发明还提供了如上所述的抗CD22嵌合抗原受体、如上所述的核酸、如 上所述的表达载体、如上所述的表达抗CD22嵌合抗原受体的细胞在制备治疗肿瘤的药物中 的用途。
[0030]其中，所述肿瘤可以为表达⑶22的肿瘤，例如表达⑶22的淋巴细胞白血病。
[0031 ]以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
[0032] 实施例1
[0033] 采用全序列合成方式，合成如SEQ ID N0.3所示的DNA，SEQ ID N0.3中，第1-6位为 上游酶切连接序列（内切酶为EcoRI )，第7-66位为信号肽编码序列，第67-1467位为编码序 列（如SEQ ID N0.2所示，编码SEQ ID NO. 1所示的多肽），第1468-1473位为下游酶切连接序 列（内切酶为Mlul)。
[0034] 对比例1
[0035] 采用全序列合成方式，合成如SEQ ID N0.4所示的DNA，SEQ ID N0.4中，第1-6位为 上游酶切连接序列（内切酶为EcoRI )，第7-66位为信号肽编码序列，第67-1473位为编码序 列，编码SEQ ID N0.5所示的多肽，第1474-1479位为下游酶切连接序列（内切酶为Mlul)。
[0036] 实施例2
[0037] 采用购自Clontech公司，货号为631982的pLVX-IRES-ZsGreenl作为载体，在其中 插入实施例1中如SEQ ID勵.2所示的0嫩编码序列。具体地，将口1^乂-11^3-286代6111和实施 例1中合成的如SEQ ID N0.3所示的DNA分别经内切酶EcoRI和内切酶Mlul酶切后进行连接， 连接子转化并验证正确后，得到本实施例的慢病毒表达载体PLVX-IRES-CAR。
[0038] 对比例2
[0039] 按照实施例2的方法制备慢病毒表达载体，不同的是，将实施例1中合成的如SEQ 10从).3所示的0嫩替换为对比例1中合成的如3￡〇10从).4所示的0嫩。
[0040] 实施例3
[0041 ] 将实施例2和对比例2得到慢病毒表达载体以及pLVX-IRES-ZsGreenl空载体分别 进行慢病毒包装，然后按照下述方法进行T细胞的体外培养、侵染和扩增。
[0042]按照下述方法分离血液中的单核细胞:将lmL无菌PBS与lmL混匀；然后轻轻加入 Ficoll的上层;4°C400 X g离心30min，加减速分别设置为0;轻轻的去掉上层的血浆，吸取中 间白膜层细胞;加入PBS重悬洗涤细胞；100 X g离心10min，加减速正常，离心后去掉上层洗 涤液；用lmL1640+10%FBS+l%双抗+lXGlutamine培养基重悬细胞。然后用于抗人CD3/ ⑶28磁珠(购自Thermo Fisher公司）刺激扩增，浓度1 X 106细胞/mL，加入100yL磁珠，，再加 入30IU/mL rhIL-2(CellGenix)，刺激培养3天
[0043]然后按照下述方法进行慢病毒转染：向培养3天的T细胞中分别加入空载体(pLVX-IRES-ZsGreenl)包装好的慢病毒或实施例2以及对比例2得到慢病毒表达载体包装好的慢 病毒(滴度相同），以及终浓度为6yg/mL的polybrene，混匀，加入慢病毒后设置离心机的温 度为32°C，转速为570Xg，加入上述慢病毒后离心30min后放入培养箱中继续培养24h后将 细胞以l〇〇〇rpm，10min离心换液，以1 X 106/mL的密度接种于孔板内，rhIL-30IU/mL刺激培 养，以后每2-3天换液一次，直至2-4周。
[0044]用PBS重悬细胞置于流式管中，流式细胞仪检测转染后T淋巴细胞的比例及表面 CAR蛋白的表达:分别离心收集转染后96h的待检测细胞(分别转染实施例2以及对比例2的 慢病毒得到慢病毒表达载体包装好的慢病毒）及对照组细胞（转染空载体（PLVX-IRES-ZsGreenl)包装好的慢病毒），PBS洗涤1次后弃上清，按抗体说明书加入相应检测量的单抗 避光30min后PBS洗涤、重悬，过膜后流式细胞仪检测，CD3( + )由APC标记的抗人⑶3抗体检 测，CAR( + )由⑶22-Fc和二抗FITC标记羊抗人Fc抗体检测，结果如图1-3所示。图1是转染实 施例2的慢病毒的流式细胞结果图，图2是转染对比例2的慢病毒的流式细胞结果图，图3是 转染空载体慢病毒的流式细胞结果图。图1-3中，横坐标表示CAR( + )信号，纵坐标表示CD3 ( + ){目号。
[0045] 通过图1-3可以看出，对照组细胞无抗⑶22嵌合抗原受体的表达，实施例2组的细 胞具有抗CD22嵌合抗原受体的表达。对比例2也具有抗CD22嵌合抗原受体的表达。
[0046] 实施例4
[0047] 本实施例通过体外共培养测定实施例3中分别转染实施例2以及对比例2的慢病毒 的T细胞的肿瘤杀伤作用：
[0048] Cy t 〇 To x 9 6 ?非同位素检测试剂盒购自Pr ome ga公司。
[0049] 取感染后的T细胞和⑶22抗原表达阳性的淋巴细胞白血病细胞系Daudi细胞，按不 同效靶比(E:T，也就是T细胞:肿瘤细胞)共培养于96孔板，靶细胞浓度至IX 106/mL。培养条 件包括:37°C，5%C02，饱和湿度孵箱孵育45分钟，200g离心平板4min。
[0050] 乳酸脱氢酶活性测定：加50iil LDH底物至96孔酶标板，室温避光反应30min。每孔 加50yl终止液终止酶促反应；酶标仪490nm测定吸光度（A490)。计算各组平均吸光度 (A490)，按下列公式计算CTL裂解靶细胞的百分率。结果如表1所示：
[0051 ] 裂解靶细胞％ =(实验组0D-靶细胞自发释放0D-效应细胞自然释放0D)/(靶细胞 最大释放0D-靶细胞自发释放0D)
[0052]表 1
[0054]通过表1的数据可见，本发明的表达抗⑶22嵌合抗原受体的T淋巴细胞针对表达 CD22的淋巴细胞白血病肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用和非常强的杀伤能力。 [0055]以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简 单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0056]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0057]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种抗CD22嵌合抗原受体，其特征在于，该抗CD22嵌合抗原受体的氨基酸序列包括 SEQ ID NO. 1所示的序列，并且，该抗⑶22嵌合抗原受体能够识别⑶22蛋白且能够在识别 CD22蛋白后活化酪氨酸信号通路。2. 根据权利要求1所述的抗CD22嵌合抗原受体，其中，该抗CD22嵌合抗原受体的氨基酸 序列如SEQ ID N0.1所示。3. -种核酸，其特征在于，该核酸编码权利要求1或2所述的抗CD22嵌合抗原受体。4. 根据权利要求3所述的核酸，其中，该核酸如SEQ ID NO. 2所示。5. -种表达载体，其特征在于，该表达载体插入有权利要求3所述的核酸，并且该表达 载体能够在转染宿主细胞后，使得被转染的宿主细胞表达权利要求1或2所述的抗CD22嵌合 抗原受体。6. 根据权利要求5所述的表达载体，其中，该表达载体为慢病毒表达载体。7. -种表达抗CD22嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，该表达抗CD22嵌合抗原受体的 细胞由宿主细胞转染权利要求5或6所述的表达载体后得到，并且能够表达权利要求1或2所 述的抗CD22嵌合抗原受体。8. 根据权利要求7所述的表达抗CD22嵌合抗原受体的细胞，其中，所述宿主细胞为T细 胞。9. 一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物的有效成分包括权利要求7或8所述的 表达抗CD22嵌合抗原受体的细胞。10. 权利要求1或2所述的抗CD22嵌合抗原受体、权利要求3或4所述的核酸、权利要求5 或6所述的表达载体、权利要求7或8所述的表达抗CD22嵌合抗原受体的细胞在制备治疗肿 瘤的药物中的用途。
【文档编号】C12N15/867GK105968210SQ201610318870
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】赵琦, 刘遥, 项春生, 李程
【申请人】深圳生创精准医疗科技有限公司