专利名称：攻击vegfr1阳性细胞的杂合毒素及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因重组技术，具体地说是血管内皮生长因子突变体与白喉毒素截短体(C区T区编码基因)制成的融合基因(mV8D)和其编码的杂合蛋白，其为攻击VEGFR1(血管内皮生长因子受体一)阳性细胞的杂合毒素及其编码基因。
背景技术：
血管内皮生长因子(VEGF)是血管生长所必需的生长因子之一，肿瘤快速生长时强烈的代谢形成对氧气、养料的大量需求，并在组织局部形成大量代谢废物的堆积；不完全代谢产物乳酸的堆积，造成pH值下降；乳酸的刺激，缺血、缺氧的刺激使肿瘤组织的血管内皮细胞大量表达VEGF受体(VEGFR)。VEGFR与VEGF结合，启动细胞内的信号通路，使血管内皮细胞增殖，形成新的血管，以满足肿瘤的生长需要；有些肿瘤细胞的表面也表达VEGFR；当有VEGF存在时，肿瘤细胞大量增殖(文献1.Yancopoulos G.D，Dacis S.，Gale N.W，et al Vascular-specific Growth Factorsand Blood Vessel Formation Nature 2000；407(14)242-248)。
白喉毒素(DT)是白喉杆菌产生的一种外毒素，可以分成C区，T区和R区三个区。R区可以和细胞表面的受体相结合完成毒素对细胞的吸附；T区可以在细胞膜上形成穿膜孔道，使毒素进入到细胞内；C区可以抑制延长因子-2的活性，阻断细胞的蛋白质合成，造成细胞死亡。实验表明将DT的R区敲掉，DT就使去了和细胞表面相应受体结合的能力。将DT的R区换成其它的蛋白配基，DT分子就能和此配基的受体结合，并杀死具有这一受体的细胞(文献2.Choe S.，Bennett M.J.，Fujii G.et al the Crystal Structure ofDiphtheria Toxin Nature1992；357(21)216-222)。
VEGF有两个受体，并且能和肝素非特异性结合。正常情况下，血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)位于血管内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞和肾小球膜细胞表面。血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)表达于血管内皮细胞、造血干细胞、巨核细胞、血小板和视网膜前体细胞表面。而硫酸肝素聚糖位于多种细胞的表面。在病理情况下，旺盛生长的肿瘤细胞表面和肿瘤组织的血管内皮细胞表面，有大量的VEGFR1和VEGFR2的表达。
利用VEGF可以与VEGF受体特异性结合这一特性，可以利用VEGF代替DT的受体结合区，把DT毒素引导到VEGF受体阳性的细胞上去，杀死这些细胞(文献3.Arora N.Masood R.，Zheng T.et al Vascular EndothelialGrowth Factor Chimeric Toxin is Highly Active Against Endothelial CellsCancer Res.1999 59(1)183-8.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高选择性杀伤作用的攻击VEGFR1阳性细胞的杂合毒素(VEGF-DT杂合蛋白)及其编码基因。
为实现上述目的，本发明以人的天然血管内皮生长因子基因为基础，对其基因上的碱基进行突变，再从白喉毒素编码基因中截取C区T区的编码基因，进行基因重组制成两种融合基因，并在大肠杆菌中表达成相应的有生物活性的蛋白。
具体为首先分别将VEGF165的3-165(制备VEGF突变基因mV8D)和3-114(制备VEGF突变基因smV8D)氨基酸残基编码基因中的82位的Arg，84位的Lys和86位的His变成Ala制成mV8；然后制备了DT的1-391氨基酸残基编码基因；再把DT基因与VEGF突变基因相连制成融合基因，并更改了其中部分稀有密码子以利于其在原核生物大肠杆菌中的表达。利用融合基因mV8D在原核生物--大肠杆菌中表达出有生物活性的杂合蛋白PmV8D；利用融合基因smV8D在原核生物--大肠杆菌中表达出有生物活性的杂合蛋白PsmV8D。
一种攻击VEGFR1阳性细胞的杂合毒素PmV8D，具有序列表SEQ IDNO2中的氨基酸序列。其可由具有序列表SEQ ID NO1中的碱基序列的编码基因制备而成。
一种攻击VEGFR1阳性细胞的杂合毒素PsmV8D，具有序列表SEQ IDNO4中的氨基酸序列。其可由具有序列表SEQ ID NO3中的碱基序列的编码基因制备而成。
本发明具有如下优点1.由于本发明采用白喉毒素做效应分子，与人源化单链抗体相比，它有更高的杀伤效率。抗体的Fc段是抗体的细胞毒作用区，单链抗体与抗体相比有更小的分子量，有更好的穿透活性，生产也更容易；但是由于单链抗体不带抗体的Fc段，所以细胞杀伤作用弱。本发明利用白喉毒素作效用分子；白喉毒素可以灭活真核细胞的廷长因子-2阻断蛋白合成；一个分子即可杀死一个细胞，杀伤效率远高于单链抗体。
2.与免疫毒素相比，本发明绕过了制备纯抗原，挑取细胞单克隆，制备单克隆抗体，人源化的技术障碍，使研制成本大大下降。
3.与国际上原有的VEGF白喉毒素杂合蛋白相比，本发明中涉及的蛋白专一性更高，由于改变了VEGF上的受体结合位点，使其失去了和VEGFR-2相结合的能力，而只有和受体1相结合的能力故其专一性比用未突变的VEGF高许多。其细胞杀伤专一性与单链抗体相似，高于未突变的VEGF-DT杂合蛋白。
4.本发明对VEGF进行突变制成融合基因。其编码的杂合蛋白PmV8D只与VEGFR1和肝素结合，PsmV8D只与VEGFR1结合而且不与肝素结合，这种VEGF突变体制成的杂合蛋白可以只杀死VEGFR-1阳性细胞，而不杀死VEGFR-2阳性细胞，而smV8D也不会受到遍布于各种细胞表面的硫酸肝素聚糖的影响。这样由VEGF突变体与白喉毒素制成的杂合蛋白可以提高VEGF-DT杂合蛋白的选择性杀伤作用。
图1-1为mV8D基因测序图之一；图1-2为mV8D基因测序图之二；图1-3为mV8D基因测序图之三；图1-4为mV8D基因测序图之四；图1-5为mV8D基因测序图之五；图2-1为smV8D基因测序图之一；图2-2为smV8D基因测序图之二；图2-3为smV8D基因测序图之三；图2-4为smV8D基因测序图之四；图3为PmV8D、PsmV8D蛋白电泳图；图4为PmV8D、PsmV8D蛋白免疫电泳图。
具体实施例方式
实施例1VEGF突变基因与白喉毒素C区T区截短基因的融合基因mV8D的碱基序列(序列表SEQ ID NO1)为ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGTCATAAGGGATAAAACTAAGACAAAGATAGAGTCTTTGAAAGAGCATGGCCCTATCAAAAATAAAATGAGCGAAAGTCCCAATAAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTAGAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGGGCTAACTATGCGGCGTGGGCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCGATAGCGAAACAGCTGATAATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACTTCCTGGTATCGGTAGCGTAATGGGCATTGCAGACGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTATCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTCGCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCAACCATTTCTTCATATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATAATGGCTATCGCTCCTGCCCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGTGAATTCTAA(1)SEQ ID NO 1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度1674碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源人VEGF165和白喉杆菌。
融合基因mV8D的具体制备过程如下以人的VEGF cDNA为模板，运用改良的重叠PCR在VEGF上引入六个突变点。从白喉杆菌基因组中运用PCR技术获得DT截短基因，运用基因重组技术把VEGF突变体基因连接到DT截短基因的3′端。融合基因构建到到原核表达载体中，并在保存菌株中保存。
VEGF基因、DT基因均参照文献制备(Greenfield L.，Bjorn M.J.，Horn G.，et al Nucletide seqence of the structural gene for diphtheraia toxin carried bycorynebacteriophage β Proc.Natl.Acad Sci.USA 198380(11)；6853-6857Tischer E.，Mitchell R.，Hartman T.et al The human gene for vascularendothelial growth factor J Boil.Chem.1991266(18)；11947-11954)，所用PCR试剂盒和内切酶等均购自大连宝生物公司。实验流程参照《精编分子生物学实验指南》(F奥斯伯等著科学出版社1998)和各产品说明书进行。简述如下委托上海生工生物工程公司合成如下引物。
引物1(P1)GTT GTA AAA CGA CGA CCA GTG A引物2(P2)AGC AGG AGC GAT AGC CAT TAT CTG CAT GG引物3(P3)GCG ATC GCA CCT GCC CAA GGC CAG CAC，引物4(P4)TAG AAT TCA CAT ATG GCA GAA GGA GGA GG引物5(P5)TAG AAT TCA CGC CTC GGC TTG TCA CAT C以本室制备的VEGF165为模板，以P4，P5为引物通过PCR法制得VEGF基因。PCR循环条件为94度30秒，72度30秒，55度30秒，循环30个循环。其余试剂用量均依然试剂盒说明进行。制得的VEGF基因克隆入突变载体，以P1，P2，P3为引物，用改良突变法在此基因上引入突变。PCR反应基本条件为94度预变性2分钟，循环条件为94度30秒，72度30秒，55度30秒，循环30个循环。
改良突变法详述如下1突变模板的制备取VEGF的PCR产物与突变载体连接。连接反应使用宝生物的T4DNA连接酶，反应条件依试剂说明进行。连接产物转化JM109感受态菌株，转化物铺于IPTG-Xgal-Amp+LB琼脂平板上，37℃培养过夜。随机挑取八个白色菌落，悬浮于100ul无菌milli Q水中。振荡混均，100℃加热10min。取10ul混合物加水90ul，做十倍稀释。此稀释物命名为混合模板。
突变反应依以下条件做PCR反应。
第一步VEGF N端编码基因突变物和C端编码基因突变物的合成取上一步中制成的混合模板1ul；P1，1ul；P2，1ul；Primix，25ul；ddH2O，22ul。分装12.5ul/管。做梯度PCR反应，退火温度依次设定为43℃，48℃，53℃。VEGF C端编码基因突变物的合成混合模板，1ul；P1，1ul；P3，1ul；Primix，25ul；ddH2O，22ul；分装12.5ul/管。做梯度PCR反应，退火温度依次设定为43℃，48℃，53℃。
第二步VEGF突变物的合成VEGF N端编码基因突变物0.5ul；VEGF C端编码基因突变物，0.5ul；P1，1ul；Primix，25ul；ddH2O，23ul；做梯度PCR反应，退火温度依次设定为41.3℃，45.4℃，48.0℃，50.7℃，56℃。
VEGF突变体基因的鉴定PCR产物走1％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带(700bp)，用引物P4-P5，P1-P2，P1-P3做PCR鉴定。
2白喉毒素截短基因的制备委托上海生工生物工程公司合成如下引物引物6(P6)AGTCCATGGGCGCTGATGATGTTGTTG引物7(P7)ATACATATGAAGAAATGGTTGCGTTTTATG以P6，P7为引物，以白喉毒素全长基因为模板，以PCR法制备白喉毒素截短基因。PCR反应基本条件为94度预变性2分钟，循环条件为94度30秒，72度30秒，50度30秒，循环35个循环。
3融合基因的制备制备的白喉毒素截短基因以Nco I和Nde I核酸内切酶进行酶切处理。VEGF突变体基因以Nde I和EcoR I核酸内切酶进行酶切处理。同时用NcoI和EcoR I核酸内切酶对表达载体进行酶切处理。酶切条件依宝生物公司的产品说明进行。酶切产物经琼脂糖凝胶纯化后，进行连接反应，连接条件同上。连接产物转化DH5α感受态菌株，转让化条件依文献进行(Chung CT，Niemela SL，Miller RH.One-step preparation of competent Escherichia colitransformation and storage of bacterial cells in the same solution.Proc NatlAcad Sci U S A.1989 Apr；86(7)2172-5)。经大肠杆菌体内扩增后，提取质粒，送大连宝生物公司进行DNA序列测定。
mV8D融合基因编码的杂合蛋白PmV8D的氨基酸序列(序列表SEQ IDNO2)为MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMAIAPAQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRREF.
(1)SEQ ID NO 2的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度557氨基酸残基*类型蛋白(b)分子类型蛋白质(c)假设否(e)最初来源mV8D基因工程菌株。
PmV8D的具体制备过程为以融合基因mV8D转化BL21(DE3)表达菌株。转化液铺于Kan+LB固体培养基上，挑取转化的菌落，接种于Kan+LB液体培养基，37度振荡培养4小时，用终浓度为1mM的IPTG诱导表达。表达的杂合蛋白命名为PmV8D。培养液置于冰上冷却十分钟，5000G离心十分钟分离菌体后，用生理盐水重悬菌体。-20度冷冻后融化，反复三次破碎细胞，14000G离心十分钟，分离包含体，包含体溶于6M盐酸胍溶液中，离心去除沉淀后，透析除盐，再用SDS-PAGE和WESTEN-BLOT检测所表达蛋白的正确性。
实施例2VEGF突变基因与白喉毒素C区T区截短基因的融合基因smV8D的碱基序列(序列表SEQ ID NO3中)为ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGTCATAAGGGATAAAACTAAGACAAAGATAGAGTCTTTGAAAGAGCATGGCCCTATCAAAAATAAAATGAGCGAAAGTCCCAATAAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTAGAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGGGCTAACTATGCGGCGTGGGCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCGATAGCGAAACAGCTGATAATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACTTCCTGGTATCGGTAGCGTAATGGGCATTGCAGACGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTATCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTCGCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCAACCATTTCTTCATATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATAATGGCTATCGCTCCTGCCCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGAC CAAAGAAAGATAGAGCCAGACAAGAGAATGAATTCTAA(1)SEQ ID NO 3的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度1524碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源人VEGF165和白喉杆菌。
融合基因smV8D的具体制备过程如下以人的VEGF cDNA为模板，运用改良的重叠PCR在VEGF上引入六个突变点。从白喉杆菌基因组中运用PCR技术获得DT截短基因，运用基因重组技术把VEGF突变体基因连接到DT截短基因的3′端。融合基因构建到到原核表达载体中，并在保存菌株中保存。
VEGF基因，DT基因参照实施例一中文献制备，所用PCR试剂盒和内切酶等均购自大连宝生物公司。实验流程参照《精编分子生物学实验指南》(F奥斯伯等著科学出版社1998)和各产品说明书进行。简述如下委托上海生工生物工程公司合成如下引物。
引物1(P1)GTT GTA AAA CGA CGA CCA GTG A引物2(P2)AGC AGG AGC GAT AGC CAT TAT CTG CAT GG引物3(P3)GCG ATC GCA CCT GCC CAA GGC CAG CAC，引物4(P4)TAG AAT TCA CAT ATG GCA GAA GGA GGA GG引物5(P5)GCG AAT TCA TTC TCT TGT CTG GCT CTA TC以本室制备的VEGF165为模板，以P4，P5为引物通过PCR法制得VEGF基因。PCR循环条件为94度30秒，72度30秒，55度30秒，循环30个循环。其余试剂用量均依然试剂盒说明进行。制得的VEGF基因克隆入突变载体，以P1，P2，P3为引物，用改良突变法在此基因上引入突变。PCR反应基本条件为94度预变性2分钟，循环条件为94度30秒，72度30秒，55度30秒，循环30个循环。
改良突变法详述如下1突变模板的制备取VEGF的PCR产物与突变载体连接。连接反应使用宝生物的T4DNA连接酶，反应条件依试剂说明进行。连接产物转化JM109感受态菌株，转化物铺于IPTG-Xgal-Amp+LB琼脂平板上，37℃培养过夜。随机挑取八个白色菌落，悬浮于100ul无菌milli Q水中。振荡混均，100℃加热10min。取10ul混合物加水90ul，做十倍稀释。此稀释物命名为混合模板。
1.1突变反应依以下条件做PCR反应。
第一步VEGF N端编码基因突变物和C端编码基因突变物的合成取上一步中制成的混合模板1ul；P1，1ul；P2，1ul；Primix，25ul；ddH2O，22ul。分装12.5ul/管。做梯度PCR反应，退火温度依次设定为43℃，48℃，53℃。VEGF C端编码基因突变物的合成混合模板，1ul；P1，1ul；P3，1ul；Primix，25ul；ddH2O，22ul；分装12.5ul/管。做梯度PCR反应，退火温度依次设定为43℃，48℃，53℃。
第二步VEGF突变物的合成VEGF N端编码基因突变物0.5ul；VEGF C端编码基因突变物，0.5ul；P1，1ul；Primix，25ul；ddH2O，23ul；做梯度PCR反应，退火温度依次设定为41.3℃，45.4℃，48.0℃，50.7℃，56℃。
1.2VEGF突变体基因的鉴定PCR产物走1％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带(700bp)，用引物P4-P5，P1-P2，P1-P3做PCR鉴定。
2白喉毒素截短基因的制备委托上海生工生物工程公司合成如下引物引物6(P6)AGTCCATGGGCGCTGATGATGTTGTTG引物7(P7)ATACATATGAAGAAATGGTTGCGTTTTATG以P6，P7为引物，以白喉毒素全长基因为模板，以PCR法制备白喉毒素截短基因。PCR反应基本条件为94度预变性2分钟，循环条件为94度30秒，72度30秒，50度30秒，循环35个循环。
3融合基因的制备制备的白喉毒素截短基因以Nco I和Nde I核酸内切酶进行酶切处理。VEGF突变体基因以Nde I和EcoR I核酸内切酶进行酶切处理。同时用NcoI和EcoR I核酸内切酶对表达载体进行酶切处理。酶切条作依然宝生物公司的产品说明进行。酶切产物经琼脂糖凝胶纯化后，进行连接反应，连接条作同上。连接产物转化DH5α感受态菌株，转让化条件依文献进行(ChungCT，Niemela SL，Miller RH.One-step preparation of competent Escherichia colitransformation and storage of bacterial cells in the same solution.Proc NatlAcad Sci U S A.1989 Apr；86(7)2172-5)。经大肠杆菌体内扩增后，提取质粒，送大连宝生物公司进行DNA序列测定。
smV8D融合基因编码的杂合蛋白PsmV8D的氨基酸序列(序列表SEQID NO4)为MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALWILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMAIAPAQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENEF.
(1)SEQ ID NO 4的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度507氨基酸残基*类型蛋白(b)分子类型蛋白质(c)假设否(e)最初来源smV8D基因工程菌株。
PsmV8D的具体制备过程为以融合基因smV8D转化BL21(DE3)表达菌株。转化液铺于Kan+LB固体培养基上，挑取转化的菌落，接种于Kan+LB液体培养基，37度振荡培养4小时，用终浓度为1mM的IPTG诱导表达。表达的杂合蛋白命名为PsmV8D。培养液置于冰上冷却十分钟，5000G离心十分钟分离菌体后，用生理盐水重悬菌体。-20度冷冻后融化，反复三次破碎细胞，14000G离心十分钟，分离包含体，包含体溶于6M盐酸胍溶液中，离心去除沉淀后，透析除盐，再用SDS-PAGE和WESTEN-BLOT检测所表达蛋白的正确性。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院沈阳应用生态研究所<120>攻击VEGFR1阳性细胞的杂合毒素及其编码基因<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1674<212>DNA<213>人VEGF165和白喉杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1674)<223>
<400>latg ggc gct gat gat gtt gtt gat tct tct aaa tct ttt gtg atg gaa 48Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu1 5 10 15aac ttt tct tcg tac cac ggg act aaa cct ggt tat gta gat tcc att 96Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile20 25 30caa aaa ggt ata caa aag cca aaa tct ggt aca caa gga aat tat gac144Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp35 40 45gat gat tgg aaa ggg ttt tat agt acc gac aat aaa tac gac gct gcg192Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala50 55 60gga tac tct gta gat aat gaa aac ccg ctc tct gga aaa gct gga ggc240Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly65 70 75 80gtg gtc aaa gtg acg tat cca gga ctg acg aag gtt ctc gca cta aaa288Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys85 90 95gtg gat aat gcc gaa act att aag aaa gag tta ggt tta agt ctc act336
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1.一种攻击VEGFR1阳性细胞的杂合毒素，其特征在于具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述攻击VEGFR1阳性细胞杂合毒素的编码基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO1中的碱基序列。
3.一种攻击VEGFR1阳性细胞的杂合毒素，其特征在于具有序列表SEQ ID NO4中的氨基酸序列。
4.一种权利要求1所述攻击VEGFR1阳性细胞杂合毒素的编码基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO3中的碱基序列。
全文摘要
本发明涉及基因重组技术，具体地说是两种血管内皮生长因子突变基因与白喉毒素C区T区的融合基因和其编码的杂合蛋白，其为VEGFR1阳性细胞的杂合毒素及其编码基因。融合基因mV8D具有序列表SEQ ID NO1中的碱基序列；融合基因smV8D具有序列表SEQ ID NO3中的碱基序列；杂合蛋白PmV8D具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列；杂合蛋白PsmV8D具有序列表SEQ ID NO4中的氨基酸基序列。它们是以人的天然血管内皮生长因子基因为基础，对其基因上的碱基进行突变，再从白喉毒素编码基因中截取C区T区的编码基因，进行基因重组制成两种融合基因，并在大肠杆菌中表达成相应的有生物活性的蛋白。
文档编号C07K19/00GK1690080SQ200410020438
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月21日 优先权日2004年4月21日
发明者吕安国, 白向阳, 吴文芳 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所