专利名称：用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物传感器领域，涉及一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，以及该生物传感器电极的制备方法。
背景技术：
黄曲霉毒素(AFT)、杂色曲霉素(ST)是目前已知的强致癌物之一，它们常污染动物饲料和人类的食品。用污染的饲料喂养禽畜会导致肉、乳及其制品的污染。人们如果食用被污染的食品，会导致急性中毒，引起肝脏坏死出血，慢性中毒可引起肝癌、肺癌。同时，用被污染的饲料饲养禽畜会使禽畜生产率降低，增重减慢，造成重大经济损失。各国对食品及饲料中的黄曲霉毒素均有严格的限量规定。杂色曲霉素是结构与黄曲霉毒素十分相似的霉菌毒素，其毒性、致癌性与黄曲霉毒素相似，因此对于食品及饲料中的杂色曲霉素各国也有严格的规定。
目前，对食品及饲料中黄曲霉毒素的检测方法大致有TLC(薄层色谱法)、HPLC(高效液相色谱)、ELISA(酶联免疫吸附分析)等几种(黄曲霉毒素B1检测方法的分析，食品与发酵工业2003年10期)。TLC法较为简单，不需要价格高昂的仪器设备，但样品的前处理繁琐，提取效果不理想，操作费时。HPLC法需要高昂的设备费用，专业的操作人员。ELISA法也需要专业的技术人员，需要专门的设备，还需要购买昂贵的试剂盒，仅适合于批量的检验，操作费时，需约4小时。而对于食品及饲料中黄曲霉毒素、杂色曲霉素的检测方法，则未见详细报道。
多壁碳纳米管自从1991年问世以来，由于其独特的物化特性以及所具有的纳米颗粒的大比表面积赋予了其在酶生物传感器研制方面无可比拟的优点。其纳米颗粒的大比表面积可以大大提高固化酶的数量，增加酶与底物反应的面积，从而大大提高酶生物传感器的响应性，并且其具有独特的金属或导体的性质，能在电极表面迅速传递电子，从而促进电极表面的电流响应，提高传感器的灵敏度。另外一个引人注目的优点是碳纳米管在酸氧化环境下经活化后，能在碳纳米管表面引入活性的功能基团-COOH，-OH，-CHO等基团，利用其这一特性可通过蛋白交联剂EDC、NHS将带有-NH2，-COOH的蛋白酶通过缩和反应共价结合在碳纳米管载体上，以固相酶的形式保持酶活力，从某种程度上大大节约酶用量和损失。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极。
本发明所述的用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，包括基底层与在基底层上形成的反应层，所述的反应层包含电子介体和黄曲霉毒素解毒酶，电子介体固定在基底层上成膜，该膜作为酶载体联结黄曲霉毒素解毒酶，形成黄曲霉毒素解毒酶修饰电极。
所述的电子介体可选用有机分子电子介体和高分子电子介体。有机分子电子介体主要有二茂铁及其衍生物、有机染料、醌及其衍生物、四硫富瓦烯；高分子介体主要包括变价过渡金属离子型和有机氧化还原型等氧化还原聚合物。高分子介体化合物通常是由低分子介体化合物与高分子链所带的活性基团进行反应固载生成的。
本发明优选的电子介体由在酸氧化环境下活化的多壁碳纳米管构成，其通过蛋白交联剂联结黄曲霉毒素解毒酶。活化后的多壁碳纳米管起了一个增敏的作用，即增强电极的灵敏性，同时，活化后的多壁碳纳米管具有较大量的羧基，这十分有利于对蛋白质的固定。
所述的多壁碳纳米管优选是以硝化氧化方式活化处理所得的羧基化多壁碳纳米管，也可以是其他强酸或强氧化剂活化处理所得的羧基化多壁碳纳米管。
所述的蛋白交联剂为EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺)、NHS(N-羟基丁二酰亚胺酯)，也可以为其它的联结蛋白质的方式。
当选用其他不同的电子介体时，可选用适合该电子介体的不同的联结方法。例如，选用二茂铁衍生物作为电子介体时，先利用双异硫氰酸酯与酶分子进行交替共聚制成酶膜，然后再将带有羧基的二茂铁衍生物通过与酶分子上的氨基反应键合到酶分子上去。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极的制备方法。
本发明所述的一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极的制备方法，包括以下步骤A、将多壁碳纳米管进行羧基化的活化处理，加表面活性剂促溶并配成羧基化多壁碳纳米管溶液；B、制备黄曲霉毒素解毒酶；C、以羧基化多壁碳纳米管溶液对基底层进行修饰成膜，在黄曲霉毒素解毒酶的酶液中加入适量的底物即杂色曲霉素粉末和/或黄曲霉毒素粉末，底物的加入量足以保护黄曲霉毒素解毒酶的活性中心，混匀，滴加于电极表面，羧基化多壁碳纳米管联结黄曲霉毒素解毒酶，得到黄曲霉毒素解毒酶修饰的生物传感器电极。
所述的步骤C中，滴加于电极表面的黄曲霉毒素解毒酶酶液中还加入适量的稳定剂，如PEG、甘油、吐温等。稳定剂的加入量与酶液的体积比为1∶10。
优选的制备方法包括以下步骤A、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管用王水回流8～12小时，离心，弃上清，干燥后为羧基化多壁碳纳米管；称取羧基化多壁碳纳米管溶于二甲基甲酰胺中，超声波搅拌均匀后，配成0.01～1.0mg/ml的羧基化多壁碳纳米管溶液；B、黄曲霉毒素解毒酶的制备采用Armillariella sp.菌体破碎提取法制得黄曲霉毒素解毒酶，或者采用基因工程方法获得黄曲霉毒素解毒酶；配制成蛋白浓度为0.2mg/ml的酶液，备用；C、多壁碳纳米管修饰酶电极的制备以金电极为基底层，打磨至光亮，并依次在丙酮，强碱溶液，强酸溶液以及蒸馏水中超声波清洗，将步骤A所得的羧基化多壁碳纳米管溶液滴加在电极表面，烘干成膜；再依次分别浸入100g/L的EDC溶液和100g/L的NHS溶液中30分钟；取步骤B所得的酶液100μl加入0.01～0.5μg的底物即杂色曲霉素粉末和/或黄曲霉毒素粉末，混匀，滴加于电极表面，15～25℃放置30分钟后，在用于配制EDC溶液和NHS溶液的PBS溶液中清洗数次；将电极置于黄曲霉毒素解毒酶酶液中0～4℃下12～24小时，用PBS缓冲液冲洗电极数次，洗去电极表面未固定上的酶，即得到黄曲霉毒素解毒酶修饰的生物传感器电极。
所述的步骤C中，每100μl酶液中还加入10μl的稳定剂PEG-200，混匀，然后滴加于电极表面。
更为优选的制备方法包括以下步骤A、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管用王水回流8～10小时，10000g离心15分钟，弃上清，用双蒸水清洗沉淀，10000g离心15分钟，洗涤沉淀，重复此步骤两次；将沉淀置于烘箱中烘干，为羧基化多壁碳纳米管；称取上述1mg羧基化多壁碳纳米管溶于10ml的二甲基甲酰胺中，超声波搅拌均匀后，配成0.1mg/ml的溶液；B、黄曲霉毒素解毒酶的制备采用Armillariellla sp.菌体破碎提取法制得黄曲霉毒素解毒酶，或者采用基因工程方法获得黄曲霉毒素解毒酶；配制成蛋白浓度为0.2mg/ml的酶液，备用；C、多壁碳纳米管修饰酶电极的制备将金电极以牙膏、硅藻土在绒布上打磨至光亮，并依次在丙酮、0.5mol的NaOH溶液、1∶1浓硝酸以及双蒸水中超声波清洗，每次3～5分钟，将10μl羧基化多壁碳纳米管溶液滴加在电极表面，置于60℃烘箱中烘干成膜。然后，再依次分别浸入100g/L的EDC溶液和100g/l的NHS溶液中30分钟，EDC溶液和NHS溶液均以0.01M，pH7.4PBS配制；取步骤B所得的酶液100μl加入0.01～0.5μg的底物即杂色曲霉素粉末和/或黄曲霉毒素粉末，在振荡器上混匀后，取20μl滴加于电极表面，15～25℃放置30分钟后，在0.01M，pH7.4PBS溶液中清洗数次；为减低黄曲霉毒素解毒酶的酶分子活性中心在交联过程中载体上失活，采用底物保护酶活性中心的方法，先用底物即杂色曲霉素和/或黄曲霉毒素封闭黄曲霉毒素解毒酶的酶活性中心和维持构象的必需基团，然后用交联剂EDC、NHS将黄曲霉毒素解毒酶固定在羧基化多壁碳纳米管载体上，最后去掉保护剂即杂色曲霉素和/或黄曲霉毒素；将电极置于黄曲霉毒素解毒酶酶液中0～4℃下过夜，用PBS缓冲液冲洗电极数次，洗去电极表面未固定上的酶，即得到黄曲霉毒素解毒酶修饰的生物传感器电极。
所述的步骤C中，每100μl酶液中还加入10μl的稳定剂PEG-200，混匀，然后滴加于电极表面。
基于碳纳米管的在酶生物传感器上的潜在应用，本发明以硝化氧化方式活化处理多壁碳纳米管，以MWNT-COOH作为酶载体构建了ADTZ固相酶生物传感器电极。
用原子力显微镜(AFM)观察固化酶修饰电极的膜表面，发现有很多酶分子附在羧基化开管处理的MWNT纳米颗粒上。AFM结果显示共价交联固化酶方式形成的膜面上ADTZ酶生物大分子均一的分布在MWNT上。这主要是由于MWNT具有纳米颗粒的均一自组装性，MWNT先在电极基质上均匀分散，自组装成均一的酶固化基底层；并且因为硝化处理的MWNT表面带有-COOH基团，提供有酶共价结合位点，在EDC，NHS交联剂的作用下，ADTZ酶生物大分子被定向引入到MWNT的-COOH位点上，从而防止了直接吸附固化ADTZ的无向性引起的ADTZ酶分散的无序性或聚集成团性，这样通过MWNT的纳米自组装均一性赋予了上面一层酶膜的ADTZ分布的有序性和均一性。
本发明用蛋白交联剂EDC、NHS将ADTZ酶分子通过直接共价结合的方式连接在MWNT纳米颗粒上。为减低ADTZ酶分子活性中心在交联过程中载体上失活，采用底物保护酶活性中心的方法，先用底物ST封闭ADTZ酶活性中心和维持构象的必需基团，然后用交联剂EDC、NHS将ADTZ固定在MWNT载体上，最后去掉保护剂ST，得到具有离刚性载体MWNT，又有较高活性的ADTZ固定化酶，制备得到交联固化ADTZ酶修饰电极，如图1所示。
本发明所述的生物传感器电极，主要是利用所含的黄曲霉毒素解毒酶(aflatoxin-detoxifizyme，ADTZ)来检测黄曲霉毒素(AFT)及杂色曲霉素(ST)，其原理如下
Aflatoxin B1Aflatoxin B1-8，9-dihydrodiol黄曲霉毒素B1(反应产物)黄曲霉毒素-8，9-二羟二醇 Sterigmatocystin Sterigmatocystin-8，9-dihydrodiol杂色曲霉素 (反应产物)杂色曲霉素-8，9-二羟二醇由于ST与AFTB1在结构上相似，在ADTZ催化下发生相似的氧化反应，均可在上述反应过程中产生可以被检测的电信号。因此，本发明所述的生物传感器电极，对于黄曲霉毒素(AFT)及杂色曲霉素(ST)的检测是高特异性的，而且其检测的灵敏度非常高。
本发明利用发明人报道的ADTZ酶首次制备出生物传感器电极，与现有技术相比，具有响应快、信号灵敏、特异性高、使用方便、可定量检测等优点。利用本发明所述的生物传感器电极，仅需要对样品进行简单的预处理，可用于在线检测，响应时间较快，仅2分钟，灵敏度高(可检出杂色曲霉素10个ppb、黄曲霉毒素5个ppb的样品)，比HPLC法高约10倍，单个样品或批量检测均可以方便地使用。本发明所述的生物传感器电极的灵敏度可达到1ppm～10ppb的水平。本发明省时、省力，操作简单，几乎无须培训即可推广应用。
图1为ADTZ通过交联剂EDC、NHS交联固化在MWNT上示意图。
图2为不同浓度ST的循环伏安图，图中，1为空白PBS；2～5为不同浓度的ST溶液，Scan rate100mv/s；图3为不同浓度ST的微分脉冲图；
图4为不同浓度ST与峰电流的关系图。
具体实施例方式
实施例一黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)修饰的生物传感器电极本发明所述的用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，包括基底层与在基底层上形成的反应层，所述的反应层包含电子介体和黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)，电子介体固定在基底层上，并作为酶载体联结黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)。
本实施例中，所采用的电子介体是由在酸氧化环境下活化的多壁碳纳米管构成，具体是以硝化氧化方式活化处理所得的羧基化多壁碳纳米管，其通过蛋白交联剂EDC、NHS联结黄曲霉毒素解毒酶。
实施例二黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)修饰的生物传感器电极的制备(一)、材料的准备(1)基底层选用金电极，购自天津兰力科技公司。
(2)多壁碳纳米管(MWNT)购自深圳纳米港。
(3)蛋白交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺酯(NHS)购自Sigma公司。
(二)、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管(MWNT)用王水1∶3(浓硝酸∶浓硫酸)回流8～10小时，10000g离心15分钟，弃上清，用双蒸水清洗沉淀，10000g离心15分钟，洗涤沉淀，重复此步骤两次。将沉淀置于烘箱中烘干，为羧基化多壁碳纳米管。
称取上述1mg羧基化的MWNT溶于10ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，超声波搅拌均匀后，配成0.1mg/ml的溶液。
(三)、黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)的制备采用Armillariella sp.菌体破碎提取法制得黄曲霉毒素解毒酶，参照发明人所报道的方法(Da Ling Liu，Dong Sheng Yao，et al.，Production，purification，andcharacterization of an intracellar aflatoxin-detoxifizyme from Armillariellatabescens(E-20)，Food and chemical toxicology，39(2001)461-466)，或由该方法的部分步骤获得。或者采用基因克隆、基因工程等方法获得该酶。
配制成蛋白浓度为0.2mg/ml的酶液，备用。
(四)、多壁碳纳米管修饰酶电极的制备将金电极以牙膏、硅藻土在绒布上打磨至光亮，并依次在丙酮、0.5mol的NaOH溶液、1∶1浓硝酸以及双蒸水中超声波清洗，每次3～5分钟，将10μlMWNT溶液滴加在电极表面，置于60℃烘箱中烘干成膜。然后，再依次分别浸入100g/L的EDC溶液和100g/l的NHS溶液(均以0.01M，pH7.4 PBS配制)中30分钟；100μl ADTZ酶液中加入0.01～0.5μg ST粉末，10μl的稳定剂PEG-200，混匀振荡器上混匀后，取20μl滴加于电极表面，15～25℃放置30分钟后，在0.01M，pH7.4 PBS溶液中清洗数次。为减低ADTZ酶分子活性中心在交联过程中载体上失活，采用底物保护酶活性中心的方法，先用底物ST封闭ADTZ酶活性中心和维持构象的必需基团，然后用交联剂EDC、NHS将ADTZ固定在MWNT载体上，最后去掉保护剂ST。
将电极置于ADTZ酶液中0～4℃下过夜，用PBS缓冲液冲洗电极数次，洗去电极表面未固定上的酶。
本实施例中，选用杂色曲霉素(ST)作为底物，还可选用黄曲霉毒素(AFT)作为底物，原理和操作方法相同。
本实施例为优选方案，在滴加于电极表面的ADTZ酶液中加入了稳定剂PEG-200，此步骤中即使不加入稳定剂也可制备出有相同功能的生物传感器电极。
所加入的稳定剂，除了本实施例所采用的PEG外，还可选用甘油、吐温等。
实施例三黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)修饰的的生物传感器电极用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉毒素的实验分析将本发明所述的黄曲霉毒素解毒酶修饰的Au电极作为基底层，与通用的对电极和任选的参比电极一起组成一个电极系统。
本实施例中，选用Ag/AgCl电极为参比电极，Pt丝电极为对电极组成三电极系统，磷酸盐缓冲液为电解液。
以杂色曲霉素(ST)的检测方法为例进行详细说明(一)样品的处理固态样品100g样品以粉碎机粉碎，用甲醇∶水＝45∶55(v/v)充分溶解震荡，以1∶1的氯仿提取3次，通过含有无水硫酸钠的漏斗，65℃下吹氮气挥干。
液态样品100ml样品以0.5∶1的氯仿提取3次，通过含有无水硫酸钠的漏斗，65℃下吹氮气挥干。
(二)MWNT修饰ADTZ酶电极对杂色曲霉素的电化学响应在电位范围-1000mV～1000mV，10ml的0.1mol/L，NaH2PO4-Na2HPO4(PBS)，pH6.0含0.1g/L KCL支持电解质的缓冲液中，用BAS-100 Electrochemical analyzer进行循环伏安(CV)研究和示差脉冲伏安(DPV)研究，扫描速率100mV/s。分别检测MWNT固化ADTZ修饰电极对杂色曲霉素的响应情况。
一、循环伏安法检测采用BAS-100电化学分析仪三电极系统(参比电极Ag/AgCl电极，对电极Pt丝电极，基底层修饰Au电极)，选择循环伏安扫描模式，设置电化学参数如下工作电位范围-1000mv～+1200mv扫描速率100mv/s；灵敏度10μA/V；静息时间2s设置好参数后，分别用不同的修饰基底层对10ml0.2M，pH6.60PBS(含1g/lKCl)的底液以及相同底液体系中加入不同浓度的ST的乙醇溶液或上述样品进行循环伏安扫描检测。
测试效果以100mv/s的扫描速率，在0～1200mv工作电位范围内用循环伏安法对不同浓度的ST溶液进行测定，如图2所示，峰电流随ST浓度的增加而增加。
二、微分脉冲伏安法检测选择微分脉冲伏安扫描模式，设置电化学参数如下脉冲振幅50mv；采集数据电位区间-1000mv～+1200mv；采样宽度20ms；扫描速度100mv/s；静息时间2s测试效果以交联固化ADTZ酶修饰电极对不同浓度的ST溶液进行微分脉冲伏安扫描，所测结果如图3所示，表明该电极对ST敏感，不同的浓度下产生不同大小的脉冲信号(信号大小与浓度有正比例关系)。即杂色曲霉素的含量可以通过脉冲信号表示出来。
如图4所示，以交联固化ADTZ酶修饰电极在+400mv位置用微分脉冲伏安法对ST进行定量分析，得到在4.16×10-5～2.66×10-3g/L浓度范围内，峰电流随着ST浓度的增加而上升，ST的线性检测范围为4.16×10-5～1.33×10-3g/L，线性方程为ip＝0.03C+0.497，R2＝0.9023。而当ST的浓度1.33×10-3～2.66×10-3g/L时，峰电流已趋于平缓，并且当ST的浓度大于2.66×10-3g/L后，峰电流反而随ST浓度的增加而下降。这可能于ST在水中溶解度低有关(≤g10-3g/L)。而且通常食品的ST污染亦不到这么高。
图4表明本发明所指的电极对ST响应灵敏，产生的峰电流大小与ST的含量成正比例关系，即可以通过峰电流表示样品中杂色曲霉素的含量。
由于杂色曲霉素(ST)与黄曲霉毒素(AFT)B1在结构上相似，在ADTZ催化下发生相似的氧化反应，均可在上述反应过程中产生可以被检测的电信号。因此，本实施例所述的检测方法，同样可用于检测黄曲霉毒素(AFT)，并达到相近的灵敏度。
权利要求
1.用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，包括基底层与在基底层上形成的反应层，其特征在于所述的反应层包含电子介体和黄曲霉毒素解毒酶，电子介体固定在基底层上成膜，该膜作为酶载体联结黄曲霉毒素解毒酶，形成黄曲霉毒素解毒酶修饰电极。
2.根据权利要求1所述的生物传感器电极，其特征在于所述的电子介体由在酸氧化环境下活化的多壁碳纳米管构成，其通过蛋白交联剂联结黄曲霉毒素解毒酶。
3.根据权利要求2所述的生物传感器电极，其特征在于所述的多壁碳纳米管是以硝化氧化方式活化处理所得的羧基化多壁碳纳米管。
4.根据权利要求2所述的生物传感器电极，其特征在于所述的蛋白交联剂为EDC、NHS。
5.一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤A、将多壁碳纳米管进行羧基化的活化处理，加表面活性剂促溶并配成羧基化多壁碳纳米管溶液；B、制备黄曲霉毒素解毒酶；C、以羧基化多壁碳纳米管溶液对基底层进行修饰成膜；在黄曲霉毒素解毒酶的酶液中加入适量的底物即杂色曲霉素粉末和/或黄曲霉毒素粉末，底物的加入量足以保护黄曲霉毒素解毒酶的活性中心，混匀，滴加于电极表面，羧基化多壁碳纳米管联结黄曲霉毒素解毒酶，得到黄曲霉毒素解毒酶修饰的生物传感器电极。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的步骤C中，滴加于电极表面的黄曲霉毒素解毒酶酶液中还加入适量的稳定剂，稳定剂的加入量与酶液的体积比为1∶10。
7.一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤A、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管用王水回流8～12小时，离心，弃上清，干燥后为羧基化多壁碳纳米管；称取羧基化多壁碳纳米管溶于二甲基甲酰胺中，超声波搅拌均匀后，配成0.01～1.0mg/ml的羧基化多壁碳纳米管溶液；B、黄曲霉毒素解毒酶的制备采用Armillariella sp.菌体破碎提取法制得黄曲霉毒素解毒酶，或者采用基因工程方法获得黄曲霉毒素解毒酶；配制成蛋白浓度为0.2mg/ml的酶液，备用；C、多壁碳纳米管修饰酶电极的制备以金电极为基底层，打磨至光亮，并依次在丙酮，强碱溶液，强酸溶液以及蒸馏水中超声波清洗，将步骤A所得的羧基化多壁碳纳米管溶液滴加在电极表面，烘干成膜；再依次分别浸入100g/L的EDC溶液和100g/L的NHS溶液中30分钟；取步骤B所得的酶液100μl加入0.01～0.5μg的底物即杂色曲霉素粉末和/或黄曲霉毒素粉末，混匀，滴加于电极表面，15～25℃放置30分钟后，在用于配制EDC溶液和NHS溶液的PBS溶液中清洗数次；将电极置于黄曲霉毒素解毒酶酶液中0～4℃下12～24小时，用PBS缓冲液冲洗电极数次，洗去电极表面未固定上的酶，即得到黄曲霉毒素解毒酶修饰的生物传感器电极。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的步骤C中，每100μl酶液中还加入10μl的稳定剂PEG-200，混匀，然后滴加于电极表面。
9.一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤A、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管用王水回流8～10小时，10000g离心15分钟，弃上清，用双蒸水清洗沉淀，10000g离心15分钟，洗涤沉淀，重复此步骤两次；将沉淀置于烘箱中烘干，为羧基化多壁碳纳米管；称取上述1mg羧基化多壁碳纳米管溶于10ml的二甲基甲酰胺中，超声波搅拌均匀后，配成0.1mg/ml的溶液；B、黄曲霉毒素解毒酶的制备采用Armillariella sp.菌体破碎提取法制得黄曲霉毒素解毒酶，或者采用基因工程方法获得黄曲霉毒素解毒酶；配制成蛋白浓度为0.2mg/ml的酶液，备用；C、多壁碳纳米管修饰酶电极的制备将金电极以牙膏、硅藻土在绒布上打磨至光亮，并依次在丙酮、0.5mol的NaOH溶液、1∶1浓硝酸以及双蒸水中超声波清洗，每次3～5分钟，将10μl羧基化多壁碳纳米管溶液滴加在电极表面，置于60℃烘箱中烘干成膜；再依次分别浸入100g/L的EDC溶液和100g/l的NHS溶液中30分钟，EDC溶液和NHS溶液均以0.01M，pH7.4PBS配制；取步骤B所得的酶液100μl加入0.01～0.5μg的底物即杂色曲霉素粉末和/或黄曲霉毒素粉末，在振荡器上混匀后，取20μl滴加于电极表面，15～25℃放置30分钟后，在0.01M，pH7.4PBS溶液中清洗数次；为减低黄曲霉毒素解毒酶的酶分子活性中心在交联过程中载体上失活，采用底物保护酶活性中心的方法，先用底物即杂色曲霉素和/或黄曲霉毒素封闭黄曲霉毒素解毒酶的酶活性中心和维持构象的必需基团，然后用交联剂EDC、NHS将黄曲霉毒素解毒酶固定在羧基化多壁碳纳米管载体上，最后去掉保护剂即杂色曲霉素和/或黄曲霉毒素；将电极置于黄曲霉毒素解毒酶酶液中0～4℃下过夜，用PBS缓冲液冲洗电极数次，洗去电极表面未固定上的酶，即得到黄曲霉毒素解毒酶修饰的生物传感器电极。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述的步骤C中，每100μl酶液中还加入10μl的稳定剂PEG-200，混匀，然后滴加于电极表面。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，以及该生物传感器电极的制备方法。本发明所述的用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，包括基底层与在基底层上形成的反应层，所述的反应层包含电子介体和黄曲霉毒素解毒酶，电子介体固定在基底层上成膜，该膜作为酶载体联结黄曲霉毒素解毒酶，形成黄曲霉毒素解毒酶修饰电极。本发明利用发明人报道的黄曲霉毒素解毒酶首次制备出生物传感器电极，与现有技术相比，具有响应快、信号灵敏、特异性高、使用方便、可定量检测等优点。本发明所述的生物传感器电极的灵敏度可达到1ppm～10ppb的水平。本发明省时、省力，操作简单，几乎无须培训即可推广应用。
文档编号G01N27/403GK1719243SQ200410028018
公开日2006年1月11日 申请日期2004年7月9日 优先权日2004年7月9日
发明者姚冬生, 刘大岭, 文圣梅, 谢春芳, 郑文杰 申请人:暨南大学