杂色曲霉sd-3及其在制备甲壳素脱乙酰酶中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一株杂色曲霉(Aspergillus?versicolor)SD-3及其在制备甲壳素脱乙酰酶中的应用；本发明的杂色曲霉SD-3营养要求简单、抗杂菌污染能力强、容易培养；杂色曲霉SD-3产生的甲壳素脱乙酰酶为胞外酶，分离除去菌体，即可获得甲壳素脱乙酰酶粗酶液，粗酶液可以直接应用，制备工艺简单；杂色曲霉SD-3产甲壳素脱乙酰酶活性高，在优选的条件下，未经分离纯化的粗酶液活力可达142.3U/mL；生产工艺不使用有毒有害原料，环保无污染。
【专利说明】杂色曲霉SD-3及其在制备甲壳素脱乙酰酶中的应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产甲壳素脱乙酰酶的杂色曲霉（Aspergillus versicolor) SD-3 及其制备甲壳素脱乙酰酶中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 甲壳素，又称几丁质（chitin)，是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖单体通过β -1，4-糖 苷键连接而成的多糖，广泛存在于许多无脊椎动物（如虾、蟹、昆虫等）的外壳或角质层，是 自然界中仅次于纤维素的天然多糖。甲壳素分子结构因其分子内部的结晶结构和很强的氢 键作用，很难溶于稀酸碱及一般的有机溶剂，因此应用范围不广。当甲壳素分子中的乙酰基 部分或全部脱除后，则形成壳聚糖（chitosan)，由于具有无毒、可被生物降解、良好的生物 相容性和成膜性等优良特性，在医药、食品、化工、化妆品和生物医学工程等诸多领域有着 广泛的应用。
[0003] 甲壳素脱乙酰化生产壳聚糖的方法常见的有化学法和酶法，目前基本都是采用浓 碱热解法生产。浓碱法反应过程不易控制，常常会影响到产品的粘度和分子量，且其排放的 污水对环境造成严重污染，壳聚糖产品的特性也存在不足，如脱乙酰度不均匀、分子量分布 范围宽、乙酰基所在的位置不能固定等，使得产品的实际应用范围有限。相比之下，利用酶 解法生产壳聚糖，既可以解决目前壳聚糖生产中的环境污染问题，又可以生产出高质量的 壳聚糖产品，如乙酰化程度均匀、分子量分布范围窄，以及具有特定乙酰化位置的壳聚寡糖 等，是一条既经济又行之有效的壳聚糖制备方法。
[0004] 酶法生产壳聚糖需要的酶是甲壳素脱乙酰酶（chitin deacetylase， E. C. 3. 5. 1. 41)，它是一种催化甲壳素中N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺的乙酰氨基水解的酶。甲 壳素脱乙酰酶来源广泛，包括部分真菌、植物病原体和一些昆虫等，其中以真菌最多，也是 获得该酶的最佳来源。虽然目前国内外对甲壳素脱乙酰酶的研究已经相当广泛和深入，甚 至已经发展到了分子水平，但仍未见将其工业化生产并应用于壳聚糖生产的报道，工业化 应用研究亟待加强。
[0005] 我国沿海地区虾蟹类加工业发达，现有数十家甲壳素的生产企业，目前对甲壳素 的进一步加工利用主要是通过高温强碱脱乙酰生产壳聚糖，以及对壳聚糖进一步高温强酸 水解生产壳寡糖和氨基葡萄糖。但是由于生产过程耗能大且产生大量废液，导致产品能耗 高，环境污染严重，许多甲壳素加工企业也因污染严重，无力治污而面临关闭。
[0006] 因此，摒弃污染大的生产工艺，利用绿色环保的酶解法来生产壳聚糖，是甲壳素生 产企业的必行之道。酶解法生产壳聚糖工艺过程并不复杂，但关键是要有酶活力高、活性稳 定、价格低的甲壳素脱乙酰酶作保证。国内外有不少报道关于采用微生物制备甲壳素脱乙 酰酶，但仍然存在微生物发酵周期长、酶活力低或发酵成本高等问题，至今未见产业化生产 甲壳素脱乙酰酶的报道。即使有报道采用基因工程方法将甲壳素脱乙酰酶基因转入大肠杆 菌中表达，也未能产业化应用。因此，获得产酶活力高、生长繁殖快、营养要求低的产甲壳素 脱乙酰酶微生物菌株，以及发酵工艺简单、原料成本低等仍是该酶工业化应用的关键。 (三）
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供一株甲壳素脱乙酰酶产生菌--杂色曲霉（Aspergillus versicolor) SD-3,及其在制备甲壳素脱乙酰酶中的应用，较好地克服现有微生物发酵生产 甲壳素脱乙酰酶的培养基成本高、发酵周期长和酶活性低的缺点，生产工艺具有成本低、工 艺简单、效率高等优点。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明涉及一株甲壳素脱乙酰酶产生菌一杂色曲霉（Aspergillus versicolor) SD-3,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072,保藏编号： CCTCC NO :M 2013328 ;保藏日期：2013 年 7 月 11 日。
[0010] 本发明所述杂色曲霉SD-3,是由甲壳素混入土壤经过自然富集和人工富集培养， 从富集培养物中分离和筛选得到的优良野生菌株，再经紫外线照射诱变处理和筛选获得。
[0011] 所述杂色曲霉SD-3的形态学特征如下：涂布或划线接种于马铃薯平板培养基上， 生长迅速，28°C下培养3?4天菌丝便长满平板，并产生大量分生孢子。菌落呈絮状，正面 灰绿色，反面黄褐色。分生孢子穗疏松放射状，顶囊近球形或梨形；分生孢子梗双层，无色， 表面光滑；分生孢子球形或近球形，褐色，表面粗糙。
[0012] 所述杂色曲霉SD-3的18s rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示：
[0013] GTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGGAG GGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCCTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGG CCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGC AACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCA GGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTA ATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATT CCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCC GCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAATCCCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGTGGAAC CAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAAT AGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTC AGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAA TCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGA TCGGGCGGCGTTTCTATGATGACCCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGT CGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACAC GGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATCTTTTGGATGGTGGTGC ATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCC GGTCCGCGTCCGCGGGCCGCTGGCTTCTTAGGGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTGCGAGGCAATAACAGGT CTGTGATGC
[0014] 本发明还涉及所述的杂色曲霉SD-3在微生物发酵制备甲壳素脱乙酰酶中的应 用，具体所述应用为：将杂色曲霉SD-3菌种孢子或经过扩大培养的种子液接种至产酶培 养基中，28?32°C培养3?5天，获得发酵液，将发酵液经过离心或过滤除去菌丝体，所得 上清液或滤液即为甲壳素脱乙酰酶粗酶液，将粗酶液分离提取，获得甲壳素脱乙酰酶；所 述产酶培养基终浓度组成为：蔗糖5?10g/L，酵母浸出粉2?6g/L，（NH4)2S0 42?4g/L， K2HP041?2g/L，KH2P04l?2g/L，乙酸钠1?3g/L，玉米浆（玉米浆是玉米淀粉生产中的一 种副产物，是配制微生物培养基的常用原料，市购）4?6mL/L，溶剂为自来水，pH4. 5?6. 5。
[0015] 进一步，所述种子液的体积接种量为5?10%。
[0016] 所述菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面培养基活化培养，或经过种子扩大培 养，然后用孢子或种子液接入产酶培养基进行产酶发酵。
[0017] 具体的，所述活化、种子扩大培养、产酶培养和粗酶液的获得步骤如下：
[0018] (1)将保藏的杂色曲霉SD-3菌种孢子接种于斜面或平板培养基，于28?32°C培 养2?3天，得到活化后的杂色曲霉菌种（即获得杂色曲霉SD-3菌种孢子）。所述的每升 斜面或平板培养基制备方法为：马铃薯150?200g(马铃薯去皮切成小块，加4?5倍质量 体积的自来水煮沸20?30min，纱布过滤留汁液）、蔗糖10?20g、琼脂15?20g，自来水 补足至1000mL，pH5. 0?6. 0,高压蒸汽121°C灭菌20?30min。每升斜面或平板培养基组 成优选：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，pH6. 0。
[0019] (2)将步骤（1)活化培养后杂色曲霉SD-3孢子接种至种子培养基中，于28? 32°C、150?250r/min振荡条件下培养2?3天，得到种子液；所述每升种子培养基制备方 法为：鹿糖5?10g，酵母浸出粉2?6g，（NH 4)2S042?4g，K2HP041?2g，KH 2P041?2g，乙 酸钠1?3g，玉米楽4?6mL，加自来水至1000mL，pH4. 5?6. 5,高压蒸汽121°C灭菌20? 30min。种子培养基组成优选为：蔗糖10g，酵母浸出粉6g，（NH4) 2S044g，K2HP042g，KH2P0 42g， 乙酸钠3g，玉米楽6mL，加自来水至lOOOmL，pH6. 0。
[0020] (3)将步骤（1)的杂色曲霉SD-3孢子，或步骤⑵制备的种子液以5%?10%的 体积比移种到产酶培养基中，于28?32°C、150?250r/min振荡培养3?4天，得到含甲 壳素脱乙酰酶的发酵液；所述产酶培养基组成同步骤（2)中的种子培养基。
[0021] 将步骤（3)含甲壳素脱乙酰酶的发酵液用4层纱布过滤，或者4000?6000r/min 离心5?10min，分离除去菌丝体，所得滤液或上清液即为甲壳素脱乙酰酶的粗酶液。所制 备的甲壳素脱乙酰酶粗酶液，可以直接应用于水解甲壳素制备壳聚糖，也可以保存于4°C冰 箱20天内使用；也可以经过冷冻干燥（_50°C )，制成粗酶粉保存于4°C冰箱长期使用。
[0022] 本发明以甲壳素为唯一碳源，经过天然富集和人工富集培养，筛选获得一株产甲 壳素脱乙酰酶活力较高的杂色曲霉野生菌株，经过紫外诱变和筛选后，获得一株产甲壳素 脱乙酰酶活性高、传代稳定的突变株，经过产酶发酵工艺优化后，在最优的条件下，粗酶液 活力达到了 142. 3U/mL，较现有的技术相比，技术优势显著，能够大幅度降低酶的生产成本。
[0023] 本发明的有益效果主要体现在：（1)本发明的杂色曲霉SD-3营养要求简单、抗 杂菌污染能力强、容易培养；（2)杂色曲霉SD-3产生的甲壳素脱乙酰酶为胞外酶，分离除 去菌体，即可获得甲壳素脱乙酰酶粗酶液，粗酶液可以直接应用，制备工艺简单；（3)杂色 曲霉SD-3产甲壳素脱乙酰酶活性高，在优选的条件下，未经分离纯化的粗酶液活力可达 142. 3U/mL ; (4)生产工艺不使用有毒有害原料，环保无污染。 (四）【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1产甲壳素脱乙酰酶菌株平板筛选具变色圈的菌落照片；
[0025] 图2杂色曲霉SD-3在平板培养基上的菌落照片。 (五）【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0027] 实施例1 :产甲壳素脱乙酰酶微生物的富集、分离和筛选
[0028] 为了获得产酶活力较高的菌株，首先对产甲壳素脱乙酰酶微生物进行自然富集。 方法是：初夏季节，在花坛土壤中埋入粉碎的蟹壳，洒水保持土壤湿润，2个月后采集此处 土壤样品，作为甲壳素脱乙酰酶微生物的分离源。
[0029] 采集自然富集的土壤，再进行产甲壳素脱乙酰酶微生物的人工培养富集，方法是： 250mL三角瓶中加入45mL富集培养基，经灭菌后加入5g上述土样，三角瓶于28°C、200r/ min振荡培养5天，取富集培养液5mL接种于另一只装有45mL富集培养基的三角瓶中，重复 上述培养过程一次，使得能以甲壳素为唯一碳源生长的微生物数量增加。
[0030] 将上述富集培养液用无菌水稀释后涂布于平板培养基上，培养皿于28°C的生化培 养箱中培养至有变色圈的菌落出现。挑取颜色和形态不同的菌落用划线法接种到另一块筛 选平板培养基上，28°C培养3天后，挑取单菌落转接斜面培养基，28°C培养3天，作进一步摇 瓶筛选。
[0031] 用接种环分别刮取各个菌株的新鲜斜面菌种孢子2环，接入产酶培养基中，30°C、 200r/min振荡条件下发酵培养5天。发酵液于4500r/min、4°C条件下离心lOmin后，上清 液即为甲壳素脱乙酰酶粗酶液。
[0032] 测定不同菌株发酵所得粗酶液的甲壳素脱乙酰酶的活力，经过比较，一株编号为 CR-3的菌株产酶活力最高，为41. 6U/mL。
[0033] 菌株CR-3形态学特征如下：涂布或划线接种于马铃薯平板培养基上，生长迅速， 28°C下培养3?4天菌丝便长满平板，并产生大量分生孢子。菌落呈絮状，正面灰绿色，反 面黄褐色。分生孢子穗疏松放射状，顶囊近球形或梨形；分生孢子梗双层，无色，表面光滑； 分生孢子球形或近球形，褐色，表面粗糙。
[0034] 依据菌株CR-3菌落形态、菌丝大小和孢子形态初步判断为曲霉（Aspergillus)， 采用18S rDNA序列分析方法对菌株CR-3进行鉴定，确定其为一株杂色曲霉（Aspergillus versicolor)，命名为杂色曲霉（Aspergillus versicolor)CR_3。
[0035] 所述的富集培养基组成为：甲壳素 2. 5g，K2HP040. 7g，KH2P040. 3g，MgS040. 5g， NaClO. 5g，加自来水至1000mL，pH6. 0,高压蒸汽121°C灭菌20min。
[0036] 所述的筛选平板培养基组成为：甲壳素200g，Κ2ΗΡ040· 7g，ΚΗ2Ρ040· 3g，MgS040. 5g， NaClO. 5g，对硝基-N-乙酰苯胺0. 2g，琼脂20g，加自来水至1000mL，pH6. 0,高压蒸汽121°C 灭菌20min。
[0037] 所述的斜面培养基为马铃薯培养基（PDA)，组成为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂 2〇g，自来水l〇〇〇mL。制备方法为：将200g马铃薯去皮切碎，加自来水1000mL，煮沸30min 后用纱布过滤留汁，再加入20g蔗糖和20g琼脂，补水至1000mL，pH6.0,高压蒸汽121°C灭 菌 20min。
[0038] 所述的初始摇瓶筛选产酶培养基组成为：蔗糖5g，蛋白胨2. 5g，（NH4)2S042. 5g， K2HP04lg，KH2P04lg，乙酸钠3g，玉米浆5mL，加自来水至1000mL，pH6.0,高压蒸汽121°C灭菌 20min〇
[0039] 本发明中，测定甲壳素脱乙酰酶活力的方法是：比色管中加入50°C预保温、浓度 为0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8. 0)3mL、200mg/L的对硝基-N-乙酰苯胺水溶液lmL 和用Tris-HCl缓冲液（ρΗ8· 0、0· 05mol/L)稀释1?4倍的粗酶液lmL (依据酶的活力大小 情况，稀释1-4倍，酶活低时不需要稀释，酶活达到140U/mL以上是稀释4倍），于50°C水浴 反应15min，沸水浴终止酶促反应，用蒸馈水定容至lOmL，摇勻，4000r/min离心lOmin ;以经 沸水灭活相应粗酶液的相同处理作为参比，测定上清液在波长400nm处的吸光度。由测定 的吸光值，依据对硝基苯胺的浓度一吸光度标准曲线方程（Y = 〇. 0657X+0. 003，Y为400nm 处的吸光度，X为硝基苯胺的浓度）计算出反应体系中对硝基苯胺浓度，再按酶活力单位定 义计算出甲壳素脱乙酰酶的活力。
[0040] 甲壳素脱乙酰酶的酶活单位定义：在上述反应条件下每小时产生1 μ g对硝基苯 胺所需要的酶量（mL)定义为一个酶活力单位（U)。
[0041] 实施例2 :甲壳素脱乙酰酶高产菌株的诱变育种
[0042] 对实施例1筛选得到的野生杂色曲霉CR-3菌株用紫外线照射诱变，筛选产甲壳素 脱乙酰酶活力有所提高的突变菌株。
[0043] 紫外线照射诱变方法：将菌株CR-3斜面菌种活化培养后，刮取孢子到含50mL无 菌生理盐水的三角瓶中，室温振荡30min，漏斗颈部放一棉花团过滤孢子悬液。在显微镜 下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，控制孢子数量在 1 X 108个/mL左右。在红光下，取2mL上述孢子悬液和一枚无菌回形针至直径6cm的培养 皿中，将培养皿置于磁力搅拌器上，在预热20min的紫外灯下分别照射1?5min。取0. 5mL 上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后分别移取0. 2mL涂布平板。以同样操作，做未 经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。用黑布包裹所有培养皿，28°C 培养3天，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。挑取致死率在90%以上经紫外线照射处 理后长出的菌落转接斜面，按实施例1所述的方法，对突变菌株进行筛选。
[0044] 对野生杂色曲霉CR-3菌株进行了紫外照射诱变后，经过筛选，获得产酶活力显著 提高的菌株SD-3,酶活达到78. 3U/mL，较用野生菌株提高了 88. 2%。SD-3菌株经过转接传 代5次，酶活力波动范围小于10%，说明该菌株产甲壳素脱乙酰酶遗传稳定性良好。将菌株 SD-3命名为杂色曲霉（Aspergillus versicolor) SD-3,并提交中国典型培养物保藏中心保 藏，编号：CCTCC No :M2013328,保藏日期：2013年7月11日。
[0045] 紫外线照射野生菌株诱变育种的条件为：紫外照射功率为15W，照射距离为30cm， 照射时间为3?4min。
[0046] 所述的平板培养基、斜面培养基和产酶培养基组成均与实施例1相同。
[0047] 实施例3 :杂色曲霉SD-3发酵制备甲壳素脱乙酰酶的方法1
[0048] 以杂色曲霉SD-3为菌种，不经种子扩大培养，在50mL摇瓶规模下制备甲壳素脱乙 酰酶的方法如下：
[0049] (1)将试管斜面保藏的杂色曲霉SD-3菌种接种于斜面培养基，斜面于28°C生化培 养箱中培养3天。所述的斜面培养基组成及制备方法同实施例1。
[0050] (2)用接种环刮取步骤⑴活化培养后杂色曲霉SD-3孢子接种至产酶培养基， 28°C、150r/min振荡条件下培养5天，得到含甲壳素脱乙酰酶的发酵液；所述的产酶培养 基组成为：鹿糖5g，酵母浸出粉2. 5g，（NH4)2S042. 5g，K2HP04lg，KH2P04lg，乙酸钠 lg，玉米浆 4mL，加自来水至lOOOmL，pH5. 0。250mL的三角瓶装50mL产酶培养基，八层纱布扎口，高压 蒸汽121°C灭菌30min。
[0051] (3)将步骤⑵的含甲壳素脱乙酰酶发酵液于5000r/min、4°C条件下离心5min，倾 倒出上层清液，弃去沉淀物，所得清液即为甲壳素脱乙酰酶粗酶液，酶活力达到81. 2U/mL。
[0052] 实施例4 :杂色曲霉SD-3发酵制备甲壳素脱乙酰酶的方法2
[0053] 以杂色曲霉SD-3为菌种，经过种子制备方法、产酶培养基组成和发酵条件优化 后，在50mL摇瓶规模下制备甲壳素脱乙酰酶的方法如下：
[0054] (1)将试管斜面保藏的杂色曲霉SD-3菌种接种于斜面培养基，斜面于28°C生化培 养箱中培养3天。所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例1。
[0055] (2)用接种环挑取步骤（1)活化培养后杂色曲霉SD-3孢子至种子培养基中，于 32°C、250r/min振荡条件下培养2天，得到种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖10g，酵 母浸出粉 6g，（NH4)2S044g，K2HP0 42g，KH2P042g，乙酸钠 3g，玉米浆 6mL，加自来水至 1000mL， pH6. 0, 250mL的三角瓶装50mL种子培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121°C灭菌20min。
[0056] (3)步骤（2)种子液以5%的体积比接种量接至产酶培养基，3〇1：、20〇17/1^11振荡 条件下培养4天，得到含甲壳素脱乙酰酶的发酵液；所述的产酶培养基组成为：蔗糖10g，酵 母浸出粉 6g，（NH4)2S044g，K2HP0 42g，KH2P042g，乙酸钠 3g，玉米浆 6mL，加自来水至 1000mL， pH6. 0, 250-mL的三角瓶装50mL产酶培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121°C灭菌20min。
[0057] (4)将步骤⑶的含甲壳素脱乙酰酶发酵液用4层纱布过滤，所得滤液即为甲壳素 脱乙酰酶粗酶液，酶活力达到147. 4U/mL。
[0058] 实施例5 :杂色曲霉SD-3发酵制备甲壳素脱乙酰酶的方法3
[0059] 以杂色曲霉SD-3为菌种，经过种子制备方法、产酶培养基组成和发酵条件优化 后，在500mL摇瓶制备甲壳素脱乙酰酶的方法如下：
[0060] (1)将试管斜面保藏的杂色曲霉SD-3菌种接种于斜面培养基，斜面于28°C生化培 养箱中培养3天。所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例1。
[0061] (2)用接种环挑取步骤（1)活化培养后杂色曲霉SD-3孢子至种子培养基中，于 32°C、200r/min振荡条件下培养2天，得到种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖5g，酵母 浸出粉 2g，（NH4)2S042g，K2HP0 4lg，KH2P04lg，乙酸钠 lg，玉米浆 4mL，加自来水至 1000mL， pH6. 0,250mL的三角瓶装50mL种子培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121 °C灭菌20? 30min〇
[0062] (3)步骤（2)种子液以10%的体积比接种量接至产酶培养基，28°C、200r/min振荡 条件下培养3天，得到含甲壳素脱乙酰酶的发酵液；所述的产酶培养基组成为：蔗糖10g，酵 母浸出粉 6g，（NH4)2S044g，K2HP0 42g，KH2P042g，乙酸钠 3g，玉米浆 6mL，加自来水至 1000mL， pH6. 0, 2L的三角瓶装500mL产酶培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121°C灭菌30min。
[0063] (4)将步骤（3)的含甲壳素脱乙酰酶发酵液用4层纱布过滤，所得滤液即为甲壳素 脱乙酰酶粗酶液，酶活力达到142. 3U/mL。
[0064] 实施例6 :甲壳素脱乙酰酶的保存与冻干
[0065] 实施例3?5制备的甲壳素脱乙酰酶粗酶液可应用于酶解甲壳素制备壳聚糖，可 以立即使用，也可以密封保存于4°C冰箱中。由实施例5制备的酶活为142. 3U/mL的甲壳素 脱乙酰酶粗酶液，在4°C冰箱中密封保存20天后，酶活为121. 4U/mL，活力损失为14. 7%，可 以用于酶解甲壳素制备壳聚糖。
[〇〇66] 实施例3?5制备的甲壳素脱乙酰酶粗酶液经-50°C冷冻干燥，制得干燥酶粉，可 保存于4°C冰箱长期使用。由实施例5制备的酶活为142. 3U/mL的甲壳素脱乙酰酶粗酶液， 在-50°C的条件下冷冻干燥，制得干燥的酶粉，加等同原酶液体积的蒸馏水溶解，酶活力为 115. 8U/mL，活力损失为18. 6%，可以用于酶解甲壳素制备壳聚糖。
【权利要求】
1. 杂色曲霉（Aspergillus versicolor)SD-3,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址： 中国，武汉，武汉大学，430072,保藏编号：CCTCC NO :M 2013328;保藏日期：2013年7月11 曰。
2. -种权利要求1所述杂色曲霉SD-3在微生物发酵制备甲壳素脱乙酰酶中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将杂色曲霉SD-3菌种孢子或经 过扩大培养的种子液接种至产酶培养基中，28?32°C培养3?5天，获得发酵液，将发酵液 经过离心或过滤除去菌丝体，所得上清液或滤液即为甲壳素脱乙酰酶粗酶液，将粗酶液分 离提取，获得甲壳素脱乙酰酶；所述产酶培养基终浓度组成为：蔗糖5?10g/L，酵母浸出粉 2 ?6g/L，（NH4)2S042 ?4g/L，K2HP041 ?2g/L，KH2P041 ?2g/L，乙酸钠 1 ?3g/L，玉米浆 4?6mL/L，溶剂为自来水，ρΗ5· 0?6· 0。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述杂色曲霉SD-3菌种孢子按如下方法制 备：将杂色曲霉SD-3接种于斜面或平板培养基，于28?32°C培养2?3天，得到杂色曲霉 SD-3菌种孢子；所述每升斜面或平板培养基组成为：马铃薯150?200g、蔗糖10?20g、琼 脂15?20g，自来水补足至1000mL，ρΗ5· 0?6. 0。
5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述杂色曲霉SD-3种子液按如下步骤制备： (1)将杂色曲霉SD-3接种于斜面或平板培养基，于28?32°C培养2?3天，得到杂色曲霉 SD-3菌种孢子；所述每升斜面或平板培养基组成为：马铃薯150?200g、蔗糖10?20g、 琼脂15?20g，自来水补足至lOOOmL，pH5. 0?6. 0 ; (2)将步骤⑴杂色曲霉SD-3菌种 孢子接种至种子培养基中，于28?32°C、150?250r/min振荡条件下培养2?3天，得到 种子液；所述每升种子培养基组成为：鹿糖5?10g，酵母浸出粉2?6g，（NH 4)2S042?4g， K2HP041?2g，KH2P041?2g，乙酸钠1?3g，玉米浆4?6mL，力口自来水至1000mL，ρΗ4· 5? 6. 5〇
6. 如权利要求3或5所述的应用，其特征在于所述种子液的体积接种量为5?10%。
【文档编号】C12N1/14GK104109636SQ201410305365
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】陈虹, 张建芬, 柯薇, 活泼 申请人:浙江树人大学