以沙门氏菌菌毛为载体的hiv-1 10e8表位疫苗及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种以沙门氏菌菌毛为载体的HIV-1?10E8表位疫苗及其构建方法和应用。属于生物制药领域，本发明采用沙门氏菌(S.typhimurium)的细聚合菌毛(thin?aggregative?fimbriae)为载体构建表达HIV-1?10E8表位的疫苗，利用沙门氏菌携带菌毛的特点，显著提高10E8表位蛋白的表达数量，解决HIV-1?10E8中和表位免疫原性差问题，同时提高了其表位的免疫原性并刺激机体使之产生针对HIV-1?10E8表位的中和抗体和特异性T细胞。因此本发明的一种以沙门氏菌菌毛为载体的HIV-1?10E8表位疫苗能够做为HIV候选疫苗，达到预防HIV感染的目的。
【专利说明】以沙门氏菌菌毛为载体的HIV-1 10E8表位疫苗及其构建 方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表位疫苗，特别涉及用减毒Salmonella typhimurium ST14028_3b菌株的细聚合菌毛（thin aggregative fimbriae)为载体构建表达HIV-1 10E8 表位的疫苗。本发明属于生物制药领域，
【背景技术】
[0002] HIV-1感染机体后能够刺激宿主细胞产生体液和细胞免疫应答，因此学术界普遍 认为，有效预防HIV-1感染的疫苗必须同时具备诱导机体产生病毒特异性的体液免疫和细 胞免疫的双重能力。而事实上，虽然HIV疫苗的研究由来已久，但随着研究的深入，人们发 现要研制具备上述特性的理想疫苗还面临着许多困难（5111；[1：111^.1116!11￥￥300；[116 8383· Med Immunol. 2003 ;2 (1):1.):其中最关键的问题是HIV病毒变异性高。HIV基因变异速度 快，在病毒感染过程中抗体中和表位和CTL表位的变异使病毒快速逃避机体免疫系统的监 视，导致疫苗的效力降低，所以如何在快速变异的病毒分子中筛选出能够诱导广泛中和抗 体的保守性抗原是开发疫苗的关键。为解决这个问题，近年来以保守的包膜主要中和表位 (principle neutralizingdeterminants，PND)为基础的表位疫苗应运而生。研究结果表 明，表位多肽疫苗能够诱导机体产生针对不同HIV-1毒株的广谱中和抗体，是一种很有前 途的疫苗形式。由于大多中和表位仅由几个或几十个氨基酸组成，免疫原性较差，因此如何 提高表位的免疫原性并能诱导能够中和多个HIV-1分离株抗体反应的表位疫苗是目前研 究的重点。
[0003] HIV-ι保守的广谱中和表位主要集中在跨膜蛋白gp41的近膜端胞外区（MPER)， MPER主要含有3个构象依赖性抗原决定簇（aa579-604, aa619-648, aa644-663)，含有2F5、 4E10和Z13三个具有广谱中和活性的抗原表位。虽然从病人体内分离出的抗体可以中和 高度多样化的HIV-1分离株，但研究表明以这3个表位研制的疫苗却很难诱生出具有广谱 中和活性的中和抗体（BNabs)反应。2012年Huang等发现了一个HIV-1 gp41近膜端胞 外区（MPER)特异性抗体，命名为10E8,该抗体可中和?98 %的实验病毒（Huang J，0fek G, Laub L, et al. Broad and potent neutralization of HIV-1 by a gp41_specific human antibody[J]. Nature，2012)。10E8是目前报道的最广谱、最强的中和抗体之一。与以往 MPER抗体相比，10E8更易接近原代病毒Env的MPER区。以往MPER抗体的脂质结合性和自 身反应性是其显著特征，也是疫苗诱导此类抗体的重要阻碍。然而，10E8缺乏这些特征。另 夕卜，文章报道的慢性感染队列中，具有相似特异性的抗体并不罕见。这表明10E8样抗体并 没有通过自身反应性筛选而从抗体系统中被删除。这些结果进一步提示，如果设计疫苗诱 生这些抗体，接种未感染HIV的人群后可能在大多数人体中产生10E8样抗体。所以10E8 表位可能是HIV表位疫苗不可或缺的表位之一。但对于表位疫苗而言可能不仅需要天然 10E8表位的呈递，还需要运用一个载体平台，使其具有足够的免疫原性去引导10E8样抗体 进化。
[0004] 性传播是HIV-ι主要的传染方式，通过泌尿道、生殖道和肛肠粘膜，突破粘膜的解 剖学、生物学和免疫学屏障，是HIV感染的先决条件。所以粘膜免疫是预防HIV传播的重要 手段。对于HIV表位疫苗来说，人们期望构建一种疫苗载体既能提高表位的免疫原性并能 通过粘膜途径有效地将HIV抗原表位递呈给机体的免疫系统，诱导产生局部粘膜的IgA和 CTLs的反应，以及全身的特异性CTLs及IgG、IgM的反应。而减毒沙门氏菌就是这样一个 理想的递呈外源抗原的粘膜载体的候选者。这是因为沙门氏菌是具有高度侵袭性的细胞内 寄生菌，在感染人体后不仅可以刺激机体产生良好的局部粘膜免疫反应，而且由于其细胞 内寄生的特性，沙门氏菌能诱导机体形成较广泛的全身免疫反应,包括血清抗体、粘膜IgA 抗体以及不同类型的细胞介导免疫反应。携带外源抗原的沙门氏菌可直接接触肠道局部粘 膜，并由此侵入肠粘膜上皮细胞。开始，沙门氏菌可滞留在内噬小体内，但其质粒所携带的 抗原可经细胞凋亡机制释放出来，被抗原提呈细胞加工后，传递给免疫活性细胞，从而诱导 体液及细胞免疫反应一一这是迄今沙门氏菌用作疫苗载体在体内诱导免疫的一般过程，其 中很多情况下沙门氏菌是用来携带载有抗原表位的质粒载体。然而在使用质粒载体的过 程中存在着一个明显问题，即表达质粒在体内的不稳定性，这是因为重组质粒往往带有抗 生素耐药基因，在人体内缺乏抗生素压力的情况下，质粒易丢失。也有研究者把抗原表位基 因整合到染色体上，然而外源基因的表达通常水平低下，难以产生足够的重组蛋白以激发 机体的免疫反应。为了避免上述2个主要问题，确保HIV抗原表位在沙门氏菌染色体上高 水平表达，本发明通过基因置换技术（U. S.patent6864365)在沙门氏菌菌毛的基因中插入 HIV-1 10E8抗原表位。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能够高效表达HIV-1 10E8中和表位的， 以沙门氏菌为载体的表位疫苗。
[0006] 为了增强沙门氏菌携带外源蛋白的数量本发明采用了以下技术手段来高效表达 HIV-1 10E8中和表位：
[0007] 以沙门氏菌细聚合菌毛AgfA为载体表达10E8中和表位。通过基因置换技术将 10E8中和表位置换到沙门氏菌的聚合菌毛AgfA上。菌毛AgfA具有以下特点：1)高水平表 达并且位于细菌的表面。沙门氏菌的细聚合菌毛是细菌表面毛发状蛋白附属物，一般不参 与细菌的运动而有可能与细菌的黏附有关。细聚合菌毛的表达量非常高，每个细菌大约有 100?1000条，每条细聚合菌毛至少由1000个相同的菌毛亚单位呈螺旋状排列聚合而成。 因此如果以细聚合菌毛为载体表达外源多肽则其表达量将非常强大。2)很大的容纳性。本 发明通过实验证明AgfA的最大容量可达25个氨基酸。现在的中和表位一般都不会超过25 个氨基酸，恰好位于AgfA的容纳范围内，因此AgfA应该是其一个理想的载体。3)可起到佐 剂的作用。以此为载体表达的表位将能有效地刺激机体产生强有力的免疫反应。
[0008] 本发明所利用的抗原表位插入载体细聚合菌毛（Thin aggregative fimbriae) 和细菌的抗原性及黏附性有关，直径3-4nm，为周身菌毛（500根/细胞），其单体 蛋白（fimbrin)携带的外源表位拷贝数可达500, 000/细胞，适宜作为活疫苗。该 细聚合菌毛结构稳定，不溶于511似0!1、81尿素或2%十二烷基磺酸钠（303)，其单 体蛋白仅在90 %甲酸溶液中发生解聚（Collinson S. K.，et al. Purification and characterization of thin, aggregative fimbriae from Salmonella enteritidis. J. Bacteriol. 1991，173, 4773-4781.)。AgfA蛋白是细聚合菌毛的一种主要的单体蛋 白，在沙门氏菌中结构保守（R〇mling，U.，et al. Curli fibers are highly conserved between Salmonella typhimurium and Escherichia coli with respect to operon structure and regulation. Journal of Bacteriologyl998，）。该蛋白抗原性强，对于 检测插入其中的外源表位是十分重要的，此外重组菌毛的制备和纯化方法简单、成本较低 (Pallesen, L. &Klemm, P. (1994). Chimeric fimbrial vaccines. In Fimbriae adhesion, gen etics, biogenesis, and vaccines(Klemm, P. , ed. ), pp. 271-276. CRC Press, Boca Raton. )〇 AgfA蛋白C末端含有一个蛋白酶抗性结构域，由五个β -链，结构类似（Sx5QxGx2NxAx3Q) 的五个重复片断组成，可以插入外源表位片段。
[0009] 本发明的一种以沙门氏菌菌毛为载体的HIV-1 10E8表位疫苗，其特征在于：以沙 门氏菌（s. typhimurium)的细聚合菌毛作为疫苗的活载体，使艾滋病病毒的抗原表位10E8 表达在沙门氏菌（S. typhimurium)的细聚合菌毛上，其中所述的艾滋病病毒的抗原表位 10E8的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示（由SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列编码）。
[0010] 在本发明中，优选的，所述的沙门氏菌（S. typhimurium)为aroA营养缺陷型沙门 氏国。
[0011] 更优选的，所述的沙门氏菌为减毒沙门氏菌菌株ST14028-3b，购自SALMONELLA GENETIC STOCK CENTRE(SGSC, www. ucalgary. ca/ ?kesander/) 〇
[0012] 在本发明中，优选的，是将艾滋病病毒的抗原表位10E8的序列置换到沙门氏菌 (S. typhimurium)细聚合性菌毛的染色体agfA基因之中。
[0013] 进一步的，本发明还提出了一种构建以上任一项所述表位疫苗的方法，其特征在 于包括以下步骤：
[0014] 1)提取沙门氏菌的基因组DNA ;
[0015] 2)通过两步重叠 PCR法扩增得到嵌合有HIV-1 10E8抗原表位的沙门氏菌的聚合 性菌毛agfA的目的基因片段agfA: : 10E8 ;
[0016] 3)将目的基因片段agfA: : 10E8与温度敏感型质粒进行酶切连接，得到重组质粒， 重组质粒经电穿孔转入沙门氏菌（S. typhimurium)中；
[0017] 4)进行同源重组，使目的基因片段agfA: :10E8置换至沙门氏菌（S. typhimurium) 的染色体中，即得。
[0018] 在本发明中，优选的，步骤1)中两步重叠 PCR法扩增所用的引物包括两个外部引 物agfAfor和agfArev以及两个内部引物10E8for和10E8rev，其核苷酸序列分别如下所 示：
[0019] agfAfor ：GCAGAATTCAGCAGTTGTAGTGCAGAAACAGTCGCATAT
[0020] 10E8rev ：ACCGGATTTTATATACCACAGCCAGTTTGTTATGTCAAACCAATTGGATCCATTATCCGCA CCCTGGCCTACATCG
[0021] 10E8for ：GGATCCAATTGGTTTGACATAACAAACTGGCTGTGGTATATAAAATCCGGTGACCAGTGGA ACGCTAAAAACTCCGAT
[0022] agfArev ：AGACGCAAGCTTCGTTTAATGTGACCTGAGGGATCACC
[0023] 扩增步骤包括：先分别以agfAfor和10E8rev，10E8for和agfArev为引物，以沙门 氏菌的基因组为模板第一轮扩增得到两个目的片段A和B，然后以A和B为模板，agfAfor 和agfArev为引物进行第二轮扩增得到嵌合有HIV-1 10E8抗原表位的沙门氏菌的聚合性 菌毛agfA的目的基因片段agfA: : 10E8。
[0024] 在本发明中，优选的，所述的沙门氏菌为减毒沙门氏菌菌株ST14028_3b。
[0025] 在本发明中，优选的，步骤（3)中所述的温度敏感性质粒是PHSG415。
[0026] 在本发明中，优选的，步骤（4)包括以下步骤：
[0027] 1)取含有重组质粒的单克隆菌落接种于5ml含Ampl00ug/ml TB培养基，42°C， 200rpm,12h ；
[0028] 2)从步骤1)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨苄100ug/ml TB培养基中，42°C 水浴，200rpm，12h ;
[0029] 3)从步骤2)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨苄100ug/ml TB培养基中，42°C 水浴，200rpm，12h ;
[0030] 4)从步骤3)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨苄100ug/ml TB培养基中，42°C 水浴，200rpm，12h ;
[0031] 5)从步骤4)得到的菌液中取菌液三道划线于氨苄板，42°C温箱，过夜培养；
[0032] 6)氨苄板上挑取4-8个阳性菌落，接种于新鲜的5mlTB培养基中，28°C 200rpm， 12h ；
[0033] 7)从步骤6)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培养基中，28°C水浴，200rpm， 12h ；
[0034] 8)从步骤7)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培养基中，28°C水浴，200rpm， 12h ；
[0035] 9)从步骤8)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培养基中，28°C水浴，200rpm， 12h ；
[0036] 10)步骤8)得到的菌液用生理盐水稀释6-8倍，取10_6,10_7,10_ 8菌液各lOOul均 匀涂于板LB板，28°C温箱，过夜培养；
[0037] 11)挑选单克隆，分别划线于LB平板和含氨苄LB平板，28°C温箱，过夜培养；
[0038] 12)筛选氨苄青霉素敏感的菌落；
[0039] 13)从氨苄青霉素敏感的菌落中利用PCR方法筛选同时含HIV-1 10E8抗原表位的 重组沙门氏菌株。
[0040] 更进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的艾滋病活载体疫苗在制备预防或 治疗HIV感染药物中的应用。
[0041] 本发明的创新点在于：
[0042] 1、HIV病毒通过能通过生殖道、肠道粘膜侵入机体，根据共同粘膜免疫理论，一处 粘膜免疫，可在多处粘膜产生免疫作用，此沙门氏菌载体免疫后能广泛诱导机体产生广泛 特异针对HIV-1 10E8中和表位的肠道、生殖道的粘膜抗体。
[0043] 2、沙门氏菌对巨噬细胞有特殊的亲和性，因此以沙门氏菌为载体可直接特异性地 将HIV-1 10E8中和表位抗原蛋白运送到免疫相关器官的APC细胞，这比传统的免疫途径的 抗原递呈更加有效。
[0044] 3、高表达，菌株的菌毛携带HIV-1 10E8抗原表位，一个细菌大约有100?1000 条，每条细聚合菌毛至少有1000个相同的含Hiv-l 10E8抗原表位菌毛亚单位，HIV-110E8 抗原蛋白携带数量相当强大。
[0045] 4、用其作为载体制备的载体菌生产过程简单，较易储存和运输，可口服，易于大规 模免疫接种，因此显著减低了以后作为疫苗应用平台生产成本和周期。
【专利附图】
【附图说明】
[0046] 图1为细聚合菌毛单体蛋白AgfA的结构模式图；
[0047] C5a_e为五个β -链，是结构类似（Sx5QxGx2NxAx3Q)的五个重复片段，可以插入外 源表位片段；
[0048] 图2为本发明目的表位基因 10E8抗原的克隆方案；
[0049] 图3为本发明目的表位基因序列10E8抗原克隆的第一步扩增结果；
[0050] 泳道 M :DL2000DNA Marker :由大到小为 2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, 100 bp ;泳道1 :引物agfAfor和10E8rev的PCR产物；泳道2 :引物agfArev和10E8for的PCR 产物；
[0051] 图4为本发明目的表位基因序列10E8抗原克隆的第二步扩增结果；
[0052] 泳道 M :DL2000DNA Marker :由大到小为 2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, 100 bp ;泳道 2、3 :引物 agfAfor 和 agfArev 的 PCR 产物；
[0053] 图5为本发明目的表位基因序列10E8连接到质粒PHSG415上酶切鉴定结果；
[0054] 泳道1、2 :PHSG415质粒对照；泳道2、6 :阳性结果，用EcoRI和Hindlll双酶切后 电泳，可见两条带，737bp的插入片段和5322bp的载体片段；泳道M :DL2000DNA Marker :由 大到小为 2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp ;
[0055] 图6为将2、6泳道PHSG415-10E8质粒送去测序后测序鉴定结果；
[0056] 图7为用LB平板筛选氨苄青霉素敏感的菌落结果；
[0057] 左侧为不含氨苄青霉素 LB平板，右侧为含氨苄青霉素 LB平板；
[0058] 图8为同源重组后氨苄青霉素敏感的菌agfa基因测序结果；
[0059] 测序结果表明菌毛基因 agfa中上置换上了 10E8表位；
[0060] 图9为Western blotting检测含10E8表位菌毛表达情况；
[0061] 可见在20100- 14400D之间突变株10E8有明显的条带，表明了菌毛的表达（约 17KD)；
[0062] 图10为Dot-ELISA检测含10E8表位菌毛表达情况，证实了 Western blotting的 结果；
[0063] 图11为感染后第3天重组菌在各脏器分布；
[0064] 图12为小鼠免疫血清10E8表位特异性抗体检测结果，结果表明小鼠免疫血清 10E8表位特异结合性抗体约为1:10 2 5 ;W55为含有其他HIV表位的沙门氏菌免疫检测结 果；
[0065] 图13为10E8表位小鼠免疫血清细胞因子检测结果；
[0066] 图14为pHSG415质粒图谱。
【具体实施方式】
[0067] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0068] 实施例1以沙门氏菌菌毛为载体的HIV-1 10E8表位疫苗的构建
[0069] 1、通过两步重叠 PCR法扩增出在细聚合性菌毛基因 agfA上嵌合有10E8抗原抗原 表位的基因片段
[0070] 菌株和质粒：ST14028-3b 和突变株 ST14028-3b Λ AgfA 来自 SALMONELLA GENETIC STOCK CENTRE(SGSC,www. ucalgary. ca/ ?kesander/) 〇 PHSG415 为温度敏感低拷贝质粒。 大肠杆菌DH5a本实验室保存。
[0071] 工具酶和主要试剂：内切酶EcoRI和Hindlll、高保真DNA聚合酶、购自大连宝生 物工程公司，T4连接酶购自NEB公司，DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量纯化试剂盒购自全式 金公司。
[0072] PCR :利用两步重叠 PCR 的方法（Horton RM, Hunt HD, Ho SN, Pullen JK, Pease LR:Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Genel989;77:61_68·)，根据编码细聚合菌毛基因 agfA 和外源基因10E8的序列设计引物各四条，其中包括两个外部引物agfAfor (含有EcoRI酶 切位点）和agfArev (含有HindllI酶切位点）以及两个内部引物10E8for和10E8rev (含有 外源基因 10E8)。先分别以 agfAfor 和 10E8rev，10E8for 和 agfArev 为引物，以 ST14028-3b 基因组为模板第一轮扩增得到两个目的片段A和B，然后以A和B为模板，agfAfor和 agfArev为引物进行第二轮扩增得到含有外源基因10E8的嵌合agfA片段agfA: : 10E8 (图 1，2)。引物序列见表1。
[0073] 表 1
[0074] 引物 序列（5'-3'） agfAfor GCAGAATTCAGCAGTTGTAGTGCAGAAAC-AGTCGCATAT 10E8rev ACCGGATTTTATATACCACAGCCAGTTTGTTATGTCAAACCAAT TGGATCCATTATCCOCACCCTCGCCTACATCG 】0E8for iGGATCCiAATTGGTTTGACATAACAAACTGGCTGTGGTATATAAA ATCC-GGTGACCAGTGGAACGCTAAAAACTC-CGAT agfArev AGACGCAAGCTTCGTTTAATGTGACCTGAGGGATCACC_
[0075] 1)模板的制备：从_80°C冰箱中取出菌株ST14028-3b立即放入-20°C，取3ml LB 液体培养基于l〇ml的试管中，取接菌环在酒精灯上灭菌，从_20°C取出菌株挑取接种到LB 培养基中，放入水浴摇床培养，37°C，150rpm，过夜培养。取3ml的活化菌液6500rpm离心 10min，加入100ul的高压过的去离子水，放入水浴锅（90°C )煮沸30min，变性，12000rpm离 心10min，取上清做模板，之后存于-20°C备用。
[0076] 2)第一轮PCR扩增实验
[0077] 反应体系：
[0078]
【权利要求】
1. 以沙门氏菌菌毛为载体的Hiv-l 10E8表位疫苗，其特征在于：以沙门氏菌 (S. typhimurium)的细聚合菌毛作为疫苗的活载体，使艾滋病病毒的抗原表位10E8表达在 沙门氏菌（S. typhimurium)的细聚合菌毛上，其中所述的艾滋病病毒的抗原表位10E8的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 按照权利要求1所述的表位疫苗，其特征在于：所述的沙门氏菌（S. typhimurium) 为aroA营养缺陷型沙门氏菌。
3. 按照权利要求1所述的表位疫苗，其特征在于：所述的沙门氏菌为减毒沙门氏菌菌 株 ST14028-3b。
4. 按照权利要求6所述的表位疫苗，其特征在于：将艾滋病病毒的抗原表位10E8的序 列置换到沙门氏菌（S. typhimurium)细聚合性菌毛的染色体agfA基因之中。
5. -种构建权利要求1-4任一项所述表位疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 提取沙门氏菌的基因组DNA ; 2) 通过两步重叠 PCR法扩增得到嵌合有HIV-1 10E8抗原表位的沙门氏菌的聚合性菌 毛agfA的目的基因片段agfA: : 10E8 ; 3) 将目的基因片段agfA: : 10E8与温度敏感型质粒进行酶切连接，得到重组质粒，重组 质粒经电穿孔转入沙门氏菌（S. typhimurium)中； 4) 进行同源重组，使目的基因片段agfA: :10E8置换至沙门氏菌（S. typhimurium)的染 色体中，即得。
6. 按照权利要求5所述的方法，其特征在于步骤1)中两步重叠 PCR法扩增所用的引物 包括两个外部引物agfAfor和agfArev以及两个内部引物10E8for和10E8rev，其核苷酸序 列分别如下所示： agfAfor ： GCAGAATTCAGCAGTTGTAGTGCAGAAACAGTCGCATAT 10E8rev ：ACCGGATTTTATATACCACAGCCAGTTTGTTATGTCAAACCAATTGGATCCATTATCCGCACCCT GGCCTACATCG 10E8for ：GGATCCAATTGGTTTGACATAACAAACTGGCTGTGGTATATAAAATCCGGTGACCAGTGGAACGC TAAAAACTCCGAT agfArev ：AGACGCAAGCTTCGTTTAATGTGACCTGAGGGATCACC 扩增步骤包括：先分别以agfAfor和10E8rev，10E8for和agfArev为引物，以沙门氏 菌的基因组为模板第一轮扩增得到两个目的片段A和B，然后以A和B为模板，agfAfor和 agfArev为引物进行第二轮扩增得到嵌合有HIV-1 10E8抗原表位的沙门氏菌的聚合性菌 毛agfA的目的基因片段agfA: : 10E8。
7. 按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的沙门氏菌为减毒沙门氏菌菌株 ST14028-3b〇
8. 按照权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（3)中所述的温度敏感性质粒是 PHSG415。
9. 按照权利要求8所述的方法，其特征在于步骤（4)包括以下步骤： 1) 取含有重组质粒的单克隆菌落接种于5ml含AmplOOug/ml TB培养基，42°C，200rpm， 12h ； 2) 从步骤1)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨苄100ug/ml TB培养基中，42°C水 浴，200rpm，12h ; 3) 从步骤2)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨苄lOOug/ml TB培养基中，42°C水 浴，200rpm，12h ; 4) 从步骤3)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨苄100ug/ml TB培养基中，42°C水 浴，200rpm，12h ; 5) 从步骤4)得到的菌液中取菌液三道划线于氨苄板，42°C温箱，过夜培养； 6) 氨苄板上挑取4-8个阳性菌落，接种于新鲜的5mlTB培养基中，28°C 200rpm，12h ; 7) 从步骤6)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培养基中，28°C水浴，200rpm，12h ; 8) 从步骤7)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培养基中，28°C水浴，200rpm，12h ; 9) 从步骤8)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培养基中，28°C水浴，200rpm，12h ; 10) 步骤8)得到的菌液用生理盐水稀释6-8倍，取10_6,10_7,10_8菌液各lOOul均匀涂 于板LB板，28 °C温箱，过夜培养； 11) 挑选单克隆，分别划线于LB平板和含氨苄LB平板，28°C温箱，过夜培养； 12) 筛选氨苄青霉素敏感的菌落； 13) 从氨苄青霉素敏感的菌落中利用PCR方法筛选同时含HIV-1 10E8抗原表位的重组 沙门氏菌株。
10.权利要求1-4任一项所述的表位疫苗在制备预防或治疗HIV感染药物中的应用。
【文档编号】C12R1/42GK104087545SQ201410305185
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】刘树林, 李庆海, 金刚, 王福祥, 岳超 申请人:哈尔滨医科大学