专利名称：杠柳毒苷的制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗急、慢性充血性心力衰竭的强心苷的制备方法。
背景技术：
香加皮是萝藦科植物杠柳的干燥根皮，近年来香加皮常用于治疗急、慢性充血性心力衰竭(CHF)。香加皮有毒，过量服用能产生不良反应，临床上也有致死报告。2000年版的《中华人民共和国药典》中香加皮的含量测定项下采用4-甲氧基水杨醛为HPLC法测定用对照品，但是到目前为止并无4-甲氧基水杨醛具有相关药理作用的报道。杠柳毒苷(periplocin)即杠柳苷G(结构式见下)是香加皮中的一种强心苷成分，与香加皮的临床疗效密切相关，因此以杠柳毒苷作为香加皮治疗CHF的质控指标较为合理。但是目前无法从国内外市场购得杠柳毒苷对照品。
杠柳毒苷C36H56O131969年日本学者从香加皮中分离出杠柳毒苷并确定了结构(Seiichi Sakama et al.On theStructure of Glycoside G and K of Bei-Wujiapi.Chem.Pharm.Bull，1969，17(10)2183.)，他采用的方法为甲醇或乙醇提取，提取液浓缩后用苯萃取，苯萃后的水层用水饱和的正丁醇萃取，正丁醇部位浓缩后反复经硅胶柱层析，最后得到杠柳毒苷单体(产率0.02％)。1989年胡英杰(胡英杰，木全章.滇杠柳的化学成分.云南植物研[J].1989，11(4)465～479)从杠柳的同属植物滇杠柳(黑龙骨)也分离出杠柳毒苷，采用方法为95％乙醇回流提取，醇提取物经石油醚脱脂后，用丙酮回流提取，丙酮可溶部位经硅胶柱层析和RP-8硅胶反相柱层析，得到杠柳毒苷(产率0.023％)。
到目前为止所采用的杠柳毒苷的制备方法，有的是对原料用95％乙醇回流提取，对药材的提取不完全，并且提取出的低极性杂质多，不利于杠柳毒苷单体的分离；有的要经反复硅胶柱层析，即费溶剂又费时间，产率低，成本较高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种杠柳毒苷的制备方法。
本发明的技术方案概括如下(1)香加皮药材的提取以体积百分比浓度为40％～80％的乙醇或40％～100％甲醇为提取溶剂，对香加皮进行提取，提取后蒸去溶剂，加水过滤或离心，得澄清的香加皮水溶液；(2)大孔树脂吸附分离香加皮水溶液经大孔树脂吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，浓缩后分别进行薄层层析，用强心苷专用显色剂显色，收集合并含有强心苷的部位；(3)高效液相制备分离将强心苷部位用反相色谱柱进行高效液相制备，以体积比为30～60∶70～40的甲醇∶水，或15～40∶85～60的乙腈∶水为流动相，同步采用紫外检测器于217～220nm监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得到杠柳毒苷。
香加皮药材的提取溶剂乙醇优选的浓度为50％～70％，最佳浓度为60％。
所述大孔树脂为非极性大孔树脂或弱极性大孔树脂。
所述非极性大孔树脂是以苯乙烯或乙基苯乙烯或α-甲基苯乙烯为骨架的大孔树脂。
所述弱极性大孔树脂是以苯乙烯为骨架的大孔树脂。
在步骤(2)与步骤(3)之间也可对强心苷部位进行硅胶柱层析分离将强心苷部位上样后，用体积比为11∶1～6∶1的水饱和乙酸乙酯∶甲醇，或65∶3～65∶20的氯仿∶甲醇梯度洗脱，洗脱液各个流分分别进行薄层层析，用强心苷专用显色剂显色，收集合并含有强心苷的流分。
在步骤(3)之后也可对杠柳毒苷进行重结晶，所用溶剂为甲醇或乙醇或乙酸乙酯，得杠柳毒苷晶体。
用本发明的“一种杠柳毒苷的制备方法”所制备的杠柳毒苷经UV、IR、13C-NMR、MS分析确认为杠柳毒苷；经TLC、HPLC(PDA检测器)检测本品纯度达98.8％，所得产品可达含量测定用中药化学对照品的要求。而且用本发明方法制备杠柳毒苷，药材提取完全，产率高；有机溶剂用量少。
图1为本发明制备的杠柳毒苷的IR图谱。
图2为本发明制备的杠柳毒苷的C13-NMR图谱，表1为C13-NMR数据。
图3为本发明制备的杠柳毒苷的MS图谱。
图4为本发明制备的杠柳毒苷的三维色谱图。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的说明实施例1(1)香加皮药材的提取500g香加皮加4000mL体积百分比浓度为40％乙醇溶液，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至约500mL，加500mL水稀释后过滤，得澄清的香加皮水溶液；(2)大孔树脂吸附分离将香加皮水溶液用已经预处理好的AB-8大孔树脂(南开大学化工厂生产)吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，减压蒸干溶剂，残渣加乙醇溶解，分别进行薄层层析，用氯仿∶甲醇∶水＝65∶30∶10的下层为展开剂，3，5-二硝基苯甲酸试剂显色，结果显示部位3～5(40％～60％乙醇洗脱部位)中有紫红色斑点，将其合并，得强心苷部位；(3)硅胶柱层析分离160～200目层析硅胶300克用乙酸乙酯湿法装柱，强心苷部位干法上样，用体积比为11∶1～6∶1的乙酸乙酯∶甲醇梯度洗脱，每200mL洗脱液为一份，各个流分分别减压蒸干溶剂加乙醇溶解后，进行薄层层析，用强心苷专用显色剂显色，收集合并含有强心苷的流分，结果显示流分2～6中有强心苷成分；(4)高效液相制备分离将2～6流分用微孔滤膜(0.45μm)过滤后进行高效液相制备分离，色谱柱C18反相色谱柱(Hypersil，5μm，10×250mm)；色谱条件流动相为甲醇∶水＝30∶70；流速2.5mL/min；同步采用紫外检测器于220nm监视流出曲线以指导产品收集，得到杠柳毒苷收集液。
(5)重结晶将收集液减压浓缩，挥干溶剂，加2mL甲醇，转移至结晶皿中，放入干燥器内(CaCl2干燥剂)，逐渐析出白色针状结晶，将结晶过滤出来，如此反复3次，干燥后共得结晶412mg，产率为0.08％。
(6)结构与纯度检测结构确认A.紫外扫描UVmax(EtOH)＝218nm(具有Δα，β五元内酯环强心苷的特征吸收)。
B.IR分析主要吸收为3600～3200(-OH)，1782，1741，1631(β-取代-Δα，β-γ-内酯)，1077，1044cm-1。图谱见附图1。
C.C13-NMR数据与胡英杰，木全章.滇杠柳的化学成分.云南植物研[J].1989，11(4)465～479所公布的一致。数据见表1，图谱见图2。
D.MS分析m/z697.4(M+)，534.1(M+-C6H10O5)。图谱见附图3。
经分析确认为杠柳毒苷。
纯度分析A.TLC在高效硅胶板上点样0.3μg、3μg、30μg，氯仿∶甲醇；水＝65∶30∶10下层展开，分别用3，5-二硝基苯甲酸及10％H2SO4显色，均只见单一红色及黑色斑点。
B.经HPLC(PDA)检测，纯度达98.8％。见附图4，在图中，保留时间12分钟的峰为杠柳毒苷峰。
表1 所制备杠柳毒苷的13C-NMR数据甙元碳数杠柳毒苷自制品糖基碳数 杠柳毒苷 11 25.9 25.96 1’ 97.3 97.322 26.3 26.33 2’ 36.6 36.563 73.6 73.64 3’ 77.8 77.94 35.3 35.35 4’ 82.6 82.885 75.2 75.32 5’ 69.4 69.486 35.4 35.42 6’ 18.5 18.617 24.2 24.28 OMe 58.5 58.58 40.9 40.91 1” 106.3 106.489 39.2 39.17 2” 75.9 75.9710 41.1 41.13 3” 78.2 78.3811 21.9 21.95 4” 71.9 71.7612 39.9 39.85 5” 78.2 78.3213 49.9 49.91 6” 62.8 62.9614 84.6 84.5815 33 33.0616 27.2 27.217 51.2 51.2518 16 16.119 17.1 17.1720 175.9 175.8621 73.6 73.6622 117.6 117.6423 174.4 174.45实施例2(1)香加皮药材的提取500g香加皮加3000mL体积百分比浓度为80％乙醇溶液，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至约500mL，加800mL水稀释后过滤，得澄清的香加皮水溶液；(2)大孔树脂吸附分离将香加皮水溶液用已经预处理好的D101(天津农药厂生产)大孔树脂吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，减压蒸干溶剂，残渣加乙醇溶解，分别进行薄层层析。用氯仿∶甲醇∶水＝65∶30∶10的下层为展开剂，3，5-二硝基苯甲酸试剂显色，结果显示部位3～5(40％～60％乙醇洗脱部位)中有紫红色斑点，将其合并，得强心苷部位；(3)高效液相制备分离将强心苷部位用微孔滤膜(0.45μm)过滤后进行HPLC制备分离。色谱柱C18反相色谱柱(Hypersil，5μm，10×250mm)；色谱条件流动相为甲醇∶水＝40∶60，流速2.5mL/min；同步采用紫外检测器于217nm监视流出曲线以指导产品收集，得到杠柳毒苷收集液；
将收集液减压浓缩，挥干溶剂，干燥后得杠柳毒苷495mg，产率为0.10％。
实施例3(1)香加皮药材的提取500g香加皮加3500mL体积百分比浓度为50％乙醇溶液，回流提取2次，每次3小时，合并提取液，减压浓缩至约400mL，加1000mL水过滤，得澄清的香加皮水溶液；(2)大孔树脂吸附分离将香加皮水溶液用已经预处理好的Dm2(天津南开大学化工厂生产)大孔树脂吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，减压蒸干溶剂，残渣加乙醇溶解，分别进行薄层层析，用氯仿∶甲醇∶水＝65∶30∶10的下层为展开剂，3，5-二硝基苯甲酸试剂显色，结果显示部位3～5(40％～60％乙醇洗脱部位)中有紫红色斑点，将其合并，得强心苷部位；(3)高效液相制备分离将强心苷部位用微孔滤膜(0.45μm)过滤后进行HPLC制备分离，色谱柱C18反相色谱柱(Hypersil ODS，5μm，10×250mm)；色谱条件流动相为甲醇∶水＝50∶50，流速2.5mL/min；同步采用紫外检测器于220nm监视流出曲线以指导产品收集，得到杠柳毒苷收集液；将收集液减压浓缩，挥于溶剂，干燥后得杠柳毒苷。
实施例4(1)香加皮药材的提取500g香加皮加2500mL体积百分比浓度为70％乙醇溶液，回流提取1小时，提取4次，合并提取液，减压浓缩至800mL，加300mL水过滤，得澄清的香加皮水溶液；(2)大孔树脂吸附分离将香加皮水溶液用已经预处理好的HPD100大孔树脂(沧州宝恩化工有限公司生产)吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，减压蒸于溶剂，残渣加乙醇溶解，分别进行薄层层析，用氯仿∶甲醇∶水＝65∶30∶10的下层为展开剂，3，5-二硝基苯甲酸试剂显色，结果显示部位3～5(40％～60％乙醇洗脱部位)中有紫红色斑点，将其合并，得强心苷部位；(3)高效液相制备分离将强心苷部位用微孔滤膜(0.45μm)过滤后进行HPLC制备分离，色谱柱C18反相色谱柱(Hypersil ODS，5μm，10×250mm)；色谱条件流动相为乙腈∶水＝15∶85，流速2.5mL/min；同步采用紫外检测器于217nm监视流出曲线以指导产品收集，得到杠柳毒苷。
实施例5(1)香加皮药材的提取500g香加皮加8000mL体积百分比浓度为40％甲醇溶液进行渗漉提取，将提取液减压浓缩至约400mL，加700mL水稀释后过滤，得澄清的香加皮水溶液；(2)大孔树脂吸附分离将香加皮水溶液用已经预处理好的D2(南开大学化工厂生产)大孔树脂吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，减压蒸干溶剂，残渣加乙醇溶解，分别进行薄层层析，用氯仿∶甲醇∶水＝65∶30∶10的下层为展开剂，3，5-二硝基苯甲酸试剂显色，结果显示部位3～5(40％～60％乙醇洗脱部位)中有紫红色斑点，将其合并，得强心苷部位；
(3)高效液相制备分离将强心苷部位用微孔滤膜(0.45μm)过滤后进行HPLC制备分离，色谱柱C8反相色谱柱(Hypersil ODS，5μm，10×250mm)；色谱条件流动相为乙腈∶水＝40∶60，流速2.0mL/min；同步采用紫外检测器于217nm监视流出曲线以指导产品收集，得到杠柳毒苷收集液；(4)重结晶将收集液减压浓缩，挥干溶剂，加2mL甲醇，转移至结晶皿中，放入干燥器内(CaCl2干燥剂)，逐渐析出白色针状结晶，将结晶滤出，洗涤后干燥。
实施例6(1)香加皮药材的提取500g香加皮加3500mL甲醇溶液，回流提取2小时，提取4次，合并提取液，减压浓缩至约500mL，加700mL水过滤，得澄清的香加皮水溶液；(2)大孔树脂吸附分离将香加皮水溶液用已经预处理好的GDX-104(天津试剂二厂生产)大孔树脂吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，减压蒸干溶剂，残渣加乙醇溶解，分别进行薄层层析，用氯仿∶甲醇∶水＝65∶30∶10的下层为展开剂，3，5-二硝基苯甲酸试剂显色，结果显示部位3～5(40％～60％乙醇洗脱部位)中有紫红色斑点，将其合并，得强心苷部位；(3)高效液相制备分离将强心苷部位用微孔滤膜(0.45μm)过滤后进行HPLC制备分离，色谱柱(C18反相色谱柱Hypersil ODS，5μm，10×250mm)；色谱条件流动相为乙腈∶水＝27∶73，流速2.0mL/min；同步采用紫外检测器于217nm监视流出曲线以指导产品收集，得到杠柳毒苷收集液；将收集液减压浓缩，干燥后得杠柳毒苷。
实施例7(1)香加皮药材的提取500g香加皮加3500mL体积百分比浓度为60％乙醇溶液，回流提取2小时，提取4次，合并提取液，减压浓缩至约500mL，加700mL水过滤，得澄清的香加皮水溶液；(2)大孔树脂吸附分离将香加皮水溶液用已经预处理好的GDX-104(天津试剂二厂生产)大孔树脂吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，减压蒸干溶剂，残渣加乙醇溶解，分别进行薄层层析，用氯仿∶甲醇∶水＝65∶30∶10的下层为展开剂，3，5-二硝基苯甲酸试剂显色，结果显示部位3～5(40％～60％乙醇洗脱部位)中有紫红色斑点，将其合并，得强心苷部位；(3)高效液相制备分离将强心苷部位用微孔滤膜(0.45μm)过滤后进行HPLC制备分离，色谱柱(C18反相色谱柱Hypersil ODS，5μm，10×250mm)；色谱条件流动相为甲醇∶水＝38∶62，流速2.0mL/min；同步采用紫外检测器于217nm监视流出曲线以指导产品收集，得到杠柳毒苷收集液；将收集液减压浓缩，干燥后得杠柳毒苷。
在实际操作时，还可以选用其它型号非极性大孔树脂如HPD 100或HPD 300(沧州宝恩化工有限公司)；GDX-104(天津试剂二厂)；SIP-1100或SIP-1200或SIP-1300或SIP-1400(上海医药工业研究院)；上试101或上试102或上试401或上试402(上海试剂厂)；南大3520或D1或D2，或Dm2，或Dm5(南开大学化工厂)，等等。可以选用的弱极性大孔树脂的型号为AB-8(南开大学化工厂)；HPD 500，HPD 400(沧州宝恩化工有限公司)；D201，D301(天津农药厂)，国外Diaion(HP10，HP20，HP21)，Amberlite(XAD-1，XAD-2)，等等。
除了香加皮以外，也可以萝藦科植物滇杠柳或希腊杠柳或美叶杠柳，或夹竹桃科植物毒毛旋花的种子为原料提取杠柳毒苷。
工业制备杠柳毒苷可选用的制备柱有Waters C18(20mm×250mm)，Zorbax SB-C18(9.4×250mm)等等。
权利要求
1.一种杠柳毒苷的制备方法，其特征是包括如下步骤(1)香加皮药材的提取以体积百分比浓度为40％～80％的乙醇或40％～100％的甲醇为提取溶剂，对香加皮进行提取，提取后蒸去溶剂，加水过滤或离心，得澄清的香加皮水溶液；(2)大孔树脂吸附分离香加皮水溶液经大孔树脂吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，浓缩后分别进行薄层层析，用强心苷专用显色剂显色，收集合并含有强心苷的部位；(3)高效液相制备分离将强心苷部位用反相色谱柱进行高效液相制备，以体积比为30～60∶70～40的甲醇∶水，或15～40∶85～60的乙腈∶水为流动相，同步采用紫外检测器于217～220nm监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得到杠柳毒苷。
2.根据权利要求1所述的一种杠柳毒苷的制备方法，其特征是所述乙醇的浓度为50％～70％。
3.根据权利要求2所述的一种杠柳毒苷的制备方法，其特征是所述乙醇的浓度为60％。
4.根据权利要求1所述的一种杠柳毒苷的制备方法，其特征是所述大孔树脂为非极性大孔树脂或弱极性大孔树脂。
5.根据权利要求4所述的一种杠柳毒苷的制备方法，其特征是所述非极性大孔树脂是以苯乙烯或乙基苯乙烯或α-甲基苯乙烯为骨架的大孔树脂。
6.根据权利要求4所述的一种杠柳毒苷的制备方法，其特征是所述弱极性大孔树脂是以苯乙烯为骨架的大孔树脂。
7.根据权利要求1所述的一种杠柳毒苷的制备方法，其特征是，在步骤(2)与步骤(3)之间对强心苷部位进行硅胶柱层析分离将强心苷部位上样后，用体积比为11∶1～6∶1的水饱和乙酸乙酯∶甲醇，或65∶3～65∶20的氯仿∶甲醇梯度洗脱，洗脱液各个流分分别进行薄层层析，用强心苷专用显色剂显色，收集合并含有强心苷的流分。
8.根据权利要求1或7所述的一种杠柳毒苷的制备方法，其特征是将杠柳毒苷用甲醇或乙醇或乙酸乙酯进行重结晶，制得杠柳毒苷晶体。
全文摘要
本发明公开了一种杠柳毒苷的制备方法，它包括如下步骤(1)香加皮药材的提取，并制成香加皮水溶液；(2)大孔树脂吸附分离香加皮水溶液经大孔树脂吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，浓缩后分别进行薄层层析，用显色剂显色，收集合并含有强心苷的部位；(3)高效液相制备分离将强心苷部位用反相色谱柱进行高效液相制备，以体积比为30～60∶70～40的甲醇水为流动相，同步采用紫外检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得到杠柳毒苷，经检测，杠柳毒苷纯度达98.8％，所得产品可达含量测定用中药化学对照品的要求，而且用本发明方法制备杠柳毒苷，药材提取完全，产率高；有机溶剂用量少。
文档编号C07J19/00GK1594353SQ20041001996
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月12日 优先权日2004年7月12日
发明者张伯礼, 刘虹, 高秀梅, 潘桂湘, 郭俊华, 朱晓薇 申请人:天津中医学院