专利名称：洋地黄提取物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种洋地黄提取物及其制备方法与应用。
背景技术：
洋地黄叶为玄参科植物紫花洋地黄Digitalis purpurea L.的干燥叶。目前已从紫 花洋地黄叶中分离出20余种强心甙，由三种不同的甙元即洋地黄毒甙元 (digitoxigenin)、羟基洋地黄毒甙元(gitoxigenin)和吉他洛武元(gitaloxigenin)与不 同的糖縮合而成。将从洋地黄中提取得到的有效成分应用于临床疾病治疗的历史悠 久，例如洋地黄毒苷用于治疗充血性心力衰竭己有近百年的历史。近年来，经过 大量的研究发现洋地黄的某些有效成分可以用来治疗眼部视疲劳。目前行业内制备 洋地黄提取物的方法主要使用大量的毒性有机溶剂(例如氯仿)进行萃取，收率低 而且污染重；并且得到的有效成分都是混合物，成分不明，机理不清，行业内也没 有精确的指纹图谱，缺乏统一的标准，重复性很低。
发明内容
本发明的目的是提供一种洋地黄提取物及其制备方法。 本发明所提供的洋地黄提取物是按照包括下述步骤的方法制备得到的
1) 将紫花洋地黄叶用乙醇水溶液进行回流提取，过滤，收集提取液，然后除 去乙醇，得到粗提液；其中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为70%-90%;
2) 将所述粗提液用截留分子量为12K-16K的超滤柱进行超滤，收集超滤液；
3) 将所述超滤液用含氯有机溶剂进行萃取，收集有机层液体；将所述有机层 液体减压蒸干，得到粗提物的干粉；其中，所述含氯有机溶剂的极性值为l一4;
4) 将所述粗提物的干粉加水溶解，得粗体物的水溶液；在所述水溶液中加入 体积为所述水溶液体积1/15、浓度为0.025-0.035mol/L的盐酸溶液，于75"—85°C 酸解25-35分钟，调pH值至中性，得到洋地黄提取物。
其中，步骤1)中所述乙醇水溶液与所述紫花洋地黄叶的配比可为8-12mL: lg。 步骤l)中所述提取的温度具体可为75"C-85°C，所述提取的时间可为50—70 分钟。
步骤l)中除去乙醇的方法可采用减压蒸发法；所述减压蒸发的压力可为 0. 092—0. llMPa，温度可为50-60。C。
3步骤3)所述萃取中所述超滤液与所述含氯有机溶剂的体积比具体可为1: l一 1: 1.3。可用于本发明的含氯有机溶剂具体可为氯苯、三氯甲烷等。
在本发明中为了提高洋地黄叶的提取效率，可将紫花洋地黄叶粉碎后再进行提取。
所述方法还可包括将步骤4)得到的洋地黄提取物进行干燥处理，得到洋地黄
提取物干粉的步骤。所述干燥的温度具体可为6(TC。
本发明的另一个目的是提供所述洋地黄提取物在制备预防和/或治疗眼部疾病 药物中的应用。
所述眼部疾病，具体可为眼部炎症、视疲劳以及黄斑变性等。 本发明的再一个目的是提供一种预防和/或治疗眼部疾病药物。 本发明所提供的预防和/或治疗眼部疾病药物，其活性成分包括本发明所提供 的洋地黄提取物。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述 载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸 收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂、 和着色剂等。
所述药物可以制成口服制剂、注射剂或局部眼用制剂等多种形式。所述局部眼 用制剂包括滴眼剂、眼用凝胶、眼膏剂、眼用膜剂和透皮贴剂等。上述各种剂型 的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明提供了一种从紫花洋地黄叶中提取洋地黄提取物的方法。该方法优化了 现有的提取方法，不再使用大量的毒性有机溶剂(如氯仿)进行萃取，降低了对环 境的污染，提高了产品的纯度，并且制定了稳定可行的指纹图谱，使通过该方法得 到的产品质量稳定可控。以本发明方法制备得到的洋地黄提取物单独作为活性成分 或与其它药用物质混合可以制成治疗眼部炎症、视疲劳以及黄斑变性的眼部用药。 动物实验表明，本发明所提供的洋地黄提取物能明显缓解由酸碱烧伤引起的非特异 性炎症，加快创伤愈合。
图1为实施例1制备的洋地黄提取物的高效液相色谱图。
图2为实施例2制备的洋地黄提取物的高效液相色谱图。 图3为实施例3制备的洋地黄提取物的高效液相色谱图。 图4为对比例1制备的洋地黄提取物的高效液相色谱图。 图5为对比例2制备的洋地黄提取物的高效液相色谱图。
具体实施例方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料， 如无特殊说明，均可从商业途径获得。 实施例1、制备洋地黄提取物
1) 取紫花洋地黄叶300g粉碎，加入2400ml体积百分含量为70Q/。的乙醇水溶 液，在75"C回流提取50分钟，过滤后得到提取液；利用真空旋转蒸发仪将所述提 取液，在50。C， 0.092MPa的条件下减压除乙醇至无醇味，得到粗提液约670ml。
2) 将粗提液经过截留分子量为12k的中空纤维超滤柱(美国MILLIPORE公司， 规格型号PyrogardD)超滤后，得超滤液约640ml。
3) 在超滤液中加入等体积的氯苯萃取，弃水层保留氯苯层(萃取液)；萃取 液在60'C、 0.09MPa条件下蒸干，回收氯苯和乙醇，得到粗提取的干粉92.17mg。
4) 将所述干粉溶于1500ml水中，得干粉的水溶液，再向所述水溶液中加入 100ml浓度为0.025mol/L盐酸溶液，75'C酸解25分钟，调pH值至中性。
5) 将上述水溶液60。C蒸干，即得洋地黄提取物92.30 mg，为样品1。 高效液相色谱(HPLC)检测
色谱条件如下
采用十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(200mmx4.6mm, 5|im) 以水-乙腈为流动相(水与乙腈的体积比为15: 1) 流速1 ml/min检测波长220 nm
将lmg样品l用10ml水溶解，配成浓度为O. lmg/ml的溶液，取10pl进样，在上述 色谱条件下进行分析，所得色谱图见图l。
由图可知，在该色谱条件下，在保留时间10—30分钟之间，有峰面积占总面 积超过10%的有6个色谱峰。
实施例2、制备洋地黄提取物
1) 取紫花洋地黄叶300g粉碎，加入3000ml体积百分含量为80。/。的乙醇水溶 液，在80。C回流提取1小时，过滤后得到提取液；利用真空旋转蒸发仪将所述提取 液，在55。C， O.lMPa的条件下减压除乙醇至无醇味，得到粗提液约900ml。
2) 将粗提液经过截留分子量为14k的中空纤维超滤柱(美国MILLIPORE公司) 超滤后，得超滤液约880ml。
3) 在超滤液中加入1.15倍体积的氯苯萃取，弃水层保留氯苯层(萃取液)； 萃取液在6(TC、0.09MPa条件下蒸干，回收氯苯和乙醇，得到粗提取的干粉97.24mg。
54) 将所述干粉溶于1500ml水中，得干粉的水溶液，再向所述水溶液中加人 100ml浓度为0.03mol/L盐酸溶液，8(TC酸解30分钟，调pH值至中性。
5) 将上述水溶液6(TC蒸干，即得洋地黄提取物97.27 mg，为样品2。 高效液相色谱(HPLC)检测
色谱条件同实施例l，所得色谱图见图2。
实施例3、制备洋地黄提取物
1) 取紫花洋地黄叶300g粉碎，加入3600ml体积百分含量为90。/。的乙醇水溶 液,在85"C回流提取70分钟，过滤后得到提取液；利用真空旋转蒸发仪将所述提取 液，在60。C, O.llMPa的条件下减压除乙醇至无醇味，得到粗提液约1200ml。
2) 将粗提液经过截留分子量为14k的中空纤维超滤柱(美国MILLIPORE公司 生产)超滤后，得超滤液约1185 ml。
3) 在超滤液中加入1.3倍体积的氯苯萃取，弃水层保留氯苯层(萃取液)；萃 取4液在60。C、0.09MPa条件下蒸干，回收氯苯和乙醇，得到粗提取的干粉103.36mg。
4) 将所述干粉溶于1500ml水中，得干粉的水溶液，再向所述水溶液中加入 100ml浓度为0.035mol/L盐酸溶液，85。C酸解35分钟，调pH值至中性。
5) 将上述水溶液60。C蒸干，即得洋地黄提取物103.4 mg，为样品3。 高效液相色谱(HPLC)检测
色谱条件同实施例l，所得色谱图见图3。
对比例1、制备洋地黄提取物
1) 取紫花洋地黄叶300g粉碎，加入3000ml体积百分含量为80%的乙醇水溶 液，在8(TC回流提取1小时，过滤后得到提取液；利用真空旋转蒸发仪将所述提取 液，在55'C， O.lMPa的条件下减压除乙醇至无醇味，得到粗提液约900ml。
2) 在粗提液中加入等体积的氯苯萃取，弃水层保留氯苯层(萃取液)；萃取 液在6(TC、 0.09MPa条件下蒸干，回收氯苯和乙醇，得到粗提取的干粉121.10mg。
3) 将所述干粉溶于1500ml水中，得干粉的水溶液，再向所述水溶液中加入 100ml浓度为0.03mol/L盐酸溶液，80。C酸解30分钟，调pH值至中性。
4) 将上述水溶液6(TC蒸干，即得洋地黄提取物121.17 mg，为样品4。 高效液相色谱(HPLC)检测
色谱条件同实施例1，所得色谱图见图4。对比例2、制备洋地黄提取物
1) 取紫花洋地黄叶300g粉碎，加入3000ml体积百分含量为80%的乙醇水溶 液，在8(TC温度回流提取1小时，过滤后得到提取液；利用真空旋转蒸发仪将所述 提取液，在55。C， O.lMPa的条件下减压除乙醇至无醇味，得到粗提液约900ml。
2) 将粗提液经过截留分子量为14k的中空纤维超滤柱(美国MILLIPORE公司 生产)超滤后，得超滤液约880ml，将超滤液蒸干，得到粗提取的干粉99.24mg。
3) 将所述干粉溶于1500ml水中，得干粉的水溶液，再向所述水溶液中加入 10Oml浓度为0.03mol/L盐酸溶液，8(TC酸解25分钟，调pH值至中性。
4) 将上述水溶液6(TC蒸干，即得洋地黄提取物l 15.63 mg，为样品5。 高效液相色谱(HPLC)检测
色谱条件同实施例1，所得色谱图见图5。
对比例3、制备洋地黄提取物 (1)取紫花洋地黄叶300g粉碎，加入3000ml体积百分含量为80Q/。的乙醇水 溶液，在8(TC回流提取1小时，过滤后得到提取液；利用真空旋转蒸发仪将所述提 取液，在55'C， O.lMPa的条件下减压除乙醇至无醇味，得到粗提液约900ml。
2) 将粗提液经过截留分子量为14k的中空纤维超滤柱(美国MILLIPORE公司 生产)超滤后，得超滤液约880ml。
3) 在超滤液中加入等体积的氯苯萃取，弃水层保留氯苯层(萃取液)；萃取 液在60。C、 0.09MPa条件下蒸干，回收氯苯和乙醇，得到粗提取的干粉99.29mg， 为样品6。
高效液相色谱(HPLC)检测
色谱条件同实施例l，样品堵塞色谱柱，无法得到图谱。
实施例4、洋地黄提取物治疗眼部炎症的药效试验
1、 供试品制备
分别取样品l一6各lmg，用50ml水稀释，制成0. 02mg/ml的水溶液作为供试
(=1
叩o
2、 动物模型及分组
本实验采用日本大耳白家兔(辽宁医学院实验动物中心，合格证号辽实动质 证字038号)56只，体重为2. 5 3. 5Kg，雌雄兼用，健康无眼病。用1%地卡因表 面麻醉。将浸有0.5mol/L NaOH溶液的直径为8mm的滤纸片，置角膜表面中央，维持lmin取下，用灭菌生理盐水连续冲洗2min，制成碱烧伤模型。将每只兔右侧 角膜碱烧伤后，将动物随机均分成7组，前6组分别为供试品l-6组，第7组为生 理盐水对照组。 3、实验方法
给药方法为患眼每次l滴，每天4次，连续2周，观察供试品缓解碱烧伤造成 的炎症和水肿，促进角膜上皮愈合的效果；计算角膜上皮愈合率来评价各样品的治 疗效果。计算角膜上皮愈合率采用荧光染色方法用20%荧光素钠无菌溶液一滴， 滴入兔结膜囊内，使其被动闭眼5min，然后稍停片刻，如果眼内仍有较多的染料， 可用生理盐水溶液冲洗除去之，分别于伤后0、 1、 2、 3、 5、 7、 10、 14天进行裂 隙灯检査，荧光素染色照相，照片经计算机图象分析系统处理，计算其角膜上皮愈 合率。
o天着色面积—观察时着色面积
角膜上皮愈合率=-xioo%
o天着色面积
4、实验结果
表l、角膜上皮损伤面积(mm2, X±SD)
组 别o夭第l天第2天第3天第5天第7天第io天第14天
150.26±0.2034.45±1.7434.15±2.333.71士2.1830.44±1.5925.78士3.6118.11±2.0716.8±0.33
249.93±0.2635.73±2.3735.71±2.533.29±1-628.77士1.2525.68±3.8117.95±1.3416.67±0.44
350.17±0.2134.72±1.6934.24±2.233.71±2.1829.94±1.4726.01±3.5418.20±2.0416.81±0.29
450.12±0.1536.62±1.4236.48±1.8735.87±3.333.17±3.1932.5±2.524.67±1.9122.57士3.32
550.24±0.1635.98±2.0235.82士1.8535.52±2.332.92±1.4630.21±5.2123.8±2.7321.7土0.93
650.58±0.3537.82±1.3537.70±0.4237.29±1.0833.16±1.1031.26±3.5024.25±1.4222.23土0.36
750.37±0.1647.62士1.4439.47±3.539.17±3.2135.5±2.534.57±3.3231.69±1.91
表2、角膜上皮细胞愈合率(％)
8组别0天第l天第2天第3天第5天第7天第10天第14天
1031.532.132.939.448.764.066.6
2028.428.433.342.448.664.066.6
3030.831.832.840.348.263.766.5
4026.927.228,433,835.250.854.0
5028.428.729.234.539.952.656.8
6025.225.526.334.438.252,156.0
705-517.621.622.229.531.437.1
上述实验结果可以看出，第1、 2、 3组角膜上皮愈合率没有明显差距，第4、 5、 6组角膜上皮愈合率明显低于第1、 2、 3组；第7组(对照组)愈合率明显低于治 疗组(前6组)，尤其在前三天差距更为明显，我们分析认为造模初期炎症和水肿 严重，治疗组药物能够缓解炎症和水肿，因此初期愈合效果明显。
实验结果表明，通过实施例l、 2、 3获得的产品在相同条件下得到的色谱图无 明显差别，得到的产品对缓解眼角膜炎症和水肿、促进角膜愈合的疗效无明显差别。
9
权利要求
1、一种洋地黄提取物的制备方法，包括下述步骤1)将紫花洋地黄叶用乙醇水溶液进行回流提取，过滤，收集提取液，然后除去乙醇，得到粗提液；其中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为70％-90％；2)将所述粗提液用截留分子量为12K-16K的超滤柱进行超滤，收集超滤液；3)将所述超滤液用含氯有机溶剂进行萃取，收集含氯有机溶剂层；将所述含氯有机溶剂层液体蒸干，得到粗提物的干粉；其中，所述含氯有机溶剂的极性值为1-4；4)将所述粗提物的干粉加水溶解，得粗体物的水溶液；在所述水溶液中加入体积为所述水溶液体积1/15的浓度为0.025-0.035mol/L盐酸溶液，75℃-85℃酸解25-35分钟，调pH值至中性，得到洋地黄提取物。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤l)中所述乙醇水溶液与所 述紫花洋地黄叶的配比为8-12mL: lg。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤l)中所述提取的温度 为75-85°C，所述提取的时间为50_70分钟。
4、 根据权利要求l-3中任一所述的方法，其特征在于步骤l)中除去乙醇的 方法为减压蒸发；所述减压蒸发的压力为0. 092—0. llMPa，温度可为50-6(TC。
5、 根据权利要求l-4中任一所述的方法，其特征在于步骤3)所述萃取中所 述超滤液与含氯有机溶剂的体积比为1: l一l: 1.3;所述含氯有机溶剂为氯苯或三 氯甲烷。
6、 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法还可包括将 步骤4)得到的洋地黄提取物进行干燥处理的步骤。
7、 权利要求1-6中任一所述方法制备得到的洋地黄提取物。
8、 权利要求7所述的洋地黄提取物在制备预防和/或治疗眼部疾病药物中的应用。
9、 根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述眼部疾病包括眼部炎症、 视疲劳和黄斑性变性。
10、 一种预防和/或治疗眼部疾病药物，其活性成分包括权利要求7所述的洋 地黄提取物。
全文摘要
本发明公开了一种洋地黄提取物及其制备方法与应用。本发明所提供的洋地黄提取物是按照下述方法制备得到的1)将紫花洋地黄叶用乙醇水溶液进行提取，过滤，收集提取液，然后除去乙醇，得到粗提液；所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为70％-90％；2)将所述粗提液用截留分子量为12K-16K的超滤柱进行超滤，收集超滤液；3)将所述超滤液用含氯有机溶剂进行萃取，收集有机层液体；将所述有机层液体蒸干，得到粗提物的干粉；4)将所述粗提物的干粉加水溶解，得粗体物的水溶液；加盐酸酸解25-35分钟，调pH值至中性，得到洋地黄提取物。本发明方法克服了现有提取方法中使用大量的毒性有机溶剂(如氯仿)进行萃取的缺点，降低了对环境的污染，提高了产品的纯度，并且得到的产品质量稳定可控。
文档编号A61K36/80GK101623377SQ20091009033
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月5日 优先权日2009年8月5日
发明者张桂萍, 星 李, 菁 杨, 王洪新 申请人:锦州奥鸿药业有限责任公司