专利名称：一种从沙蜇刺丝囊毒素内分离溶血毒素蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体的说是一种从沙蜇(Stomolophus meleagris L. Agassiz)刺丝囊细胞毒素中分离纯化溶血毒素蛋白的方法。
背景技术：
水母(jellyfish)是一种胶质状的浮游动物，主要包括四大类群刺胞动物门的水螅水母类、管水母类、钵水母类以及栉水母门的栉水母类。水母种类繁多，分布广泛， 世界上已记录的水母种类大约有1000种左右，其中我国海域已知的约有400种。我国是海岸线非常长的国家之一，从北到南地跨寒温带、温带、亚热带和热带，而在我国的沿海地区几乎均有大量水母分布，其中以沙蜇数量尤为丰富。沙蜇(Stomolophus meleagris L. Agassiz)，是大型钵水母，伞径180-980mm。隶属于腔肠动物门(Coelenterata)，钵水母纲(^cyphomedusae)，根口水母目(Rhizostomeae), 口冠水母科(Stomolophidea)，口冠水母属(Stomolophus)。近年来，水母经常暴发，造成众多游泳者被蜇伤，轻者皮肤出现皮疹、 红肿、瘙痒，令被蜇伤者痛苦不堪，重者昏厥、休克甚至死亡。而水母之所以能够给人们带来如此大的危害，最主要的原因是存在于水母触手上的刺丝囊细胞内含有大量的水母毒素。 水母毒素主要是蛋白类物质，其中包含多种具有不同生物活性的毒素蛋白，如溶血活性、酶活性、抗氧化活性、致死毒性、心脏血管毒性、肝脏毒性等，而水母毒素作为一类结构新颖的蛋白，为开发新型的海洋药物提供了重要的先导化合物。
但是，到目前为止对水母毒素的研究主要集中在水母粗毒方面，其主要原因有以下几方面第一，水母粗毒素中含有许多种蛋白组分，其中某些组分之间的性质(如分子量、带电荷数、疏水性等)非常相近，这就给水母毒素的分离纯化带来了很大的麻烦；第二， 水母毒素是蛋白类物质，具有热敏感性，容易受到温度等环境因素的影响而致使其活性降低甚至丧失，这就造成在分离纯化过程中很难保持其活性。第三，水母种类的不同，其生理结构以及体内所含的毒素成分和活性也存在较大的差异，这就致使不同种类水母毒素的分离纯化工作难以直接效仿，只能通过繁杂的实验摸索才能获得。所以，水母毒素的分离纯化工作具有很大的难度。发明内容
本发明的目的是提供一种从沙蜇刺丝囊毒素内分离溶血毒素蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种从沙蜇刺丝囊毒素中分离溶血毒素蛋白的方法，
1)将处理后的沙蜇刺丝囊细胞上清液经微孔滤膜过滤，滤液经含DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，采用洗脱液以UmLmirT1流速进行纯化分离，收集洗脱液在低温下用3 涨的超滤管进行浓缩，待用；所述洗脱液为含不同浓度NaCl的磷酸缓冲液，NaCl 浓度分别为0,0. 1,0. 2,0. 3和2M ；收集采用含0. 2M NaCl的磷酸缓冲液洗脱下的组分；
2)将上述所得洗脱组分经微孔滤膜过滤，滤液经凝胶色谱柱SuperdeUOO采用0. 15M NaCl，10 50mM，pH7. OPBS缓冲液以0. 2 1. OmLmirT1流速进行分离纯化，收集洗脱体积处于60 SOmL的洗脱液，而后在2 6°C下用3 涨的超滤管进行浓缩，浓缩后即得到从沙蜇刺丝囊毒素中分离溶血毒素蛋白。
所述处理后的沙蜇刺丝囊细胞上清液将沙蜇刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后2 6°C离心，收集上清液于2 6°C下用磷酸缓冲液透析过夜，然后低温离心， 收集上清液，待用。
所述沙蜇刺丝囊细胞将置于-80 -20°c低温的沙蜇触手于2 6°C自溶12 48h，自溶后利用20 60目的标准分样筛滤去触手残片，而后在2 6°C下10000 15000g 离心5 20min，收集下部沉淀，2 6°C冷冻干燥，待用。
所述沙蜇刺丝囊细胞加入pH7. 0，浓度10 30mM的2 6°C下预冷磷酸缓冲液中，而后将其置于冰浴下用超声波功率为200 400kw下破碎20 60min中，工作/间隙为k/30s ；所述收集上清液于2 6°C下用pH7. 0，浓度10 30mM磷酸缓冲液透析过夜。
所述采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱进行分离纯化，其中洗脱液为含不同浓度NaCl的磷酸缓冲液，即洗脱液为OM NaCl的pH7. 0，浓度10 30mM的磷酸缓冲液(PBS)、0. IM NaCl 的 ρΗ7· 0，浓度 10 30mM 的磷酸缓冲液(PBS)、0· 2M NaCl 的 ρΗ7· 0， 浓度10 30mM的磷酸缓冲液(PBS)、0. 3M NaCl的pH7. 0，浓度10 30mM的磷酸缓冲液 (PBS)和2M NaCl的ρΗ7· 0，浓度10 30mM的磷酸缓冲液(PBS)。
所述微孔滤膜过滤为采用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜过滤。
本发明的优点
1.本发明从沙蜇毒素中分离纯化溶血毒素蛋白的方法，为水母毒素蛋白的纯化提供了方法指导。
2.本发明采用阴离子交换树脂DEAE Sepharose Fast Flow和凝胶过滤树脂 SuperdeX200分离溶血毒素蛋白，具有流速快、分辨率高、产率高的特点，而且分离步骤少， 只经过两步柱层析分离就能够得到较纯的溶血毒素蛋白，有效地缩短了分离时间，减少了溶血毒素蛋白的活性损失。
图1为本发明实施例提供的阴离子交换树脂DEAE Sepharose Fast Flow分离沙蜇毒素的分步洗脱层析图。
图2本发明实施例提供的凝胶过滤树脂SuperdeX200分离上一步中溶血组分的洗脱层析图。
图3分离到的溶血蛋白的非变性电泳图片。
图4分离到的溶血蛋白的溶血梯度图具体实施例
实施例1
1)沙蜇毒素刺丝囊细胞的制备将Ikg冰冻的沙蜇触手于2°C下自溶过夜后，用滤筛过滤去除沙蜇触手残片，收集上清液倒掉。然后1000g，2°C下冷冻高速离心5min并收集下层沉淀，用生理盐水(0. 154mol - L-1NaCl溶液)于4°C反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，-20°C下冷冻保存备用。
2)沙蜇毒素的提取称取沙蜇刺丝囊细胞5mg，加入20mL pH7. 0，IOmM在2°C下预冷的磷酸缓冲液中，而后将其置于冰浴中用超声波功率为200kw下破碎20min中，工作/间隙为5s/30s。然后2°C, IOOOOg离心5min待用。
3)阴离子交换树脂DEAE Sepharose Fast Flow分离沙蜇毒素
①上样前样品的预处理取上述提取到的沙蜇毒素于2。C pH7. 0，IOmM磷酸缓冲液中透析过夜，然后2°C下IOOOOg离心5min，取上清，用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜过滤，待用。
②上样和洗脱将上述处理好的样品上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，分离时采用分步洗脱，流速为ImLmirT1，洗脱液分别为0、0. 1、0. 2、0. 3和2M NaCl的pH7.0，浓度IOmM的磷酸缓冲液(PBS)，然后收集溶血组分即收集0. 2M NaCl的洗脱液(参见图1)。
4)凝胶过滤交换树脂SuperdeX200分离上一步中溶血组分
①上样前样品的预处理将上步分离得到的溶血组分在2°C用I超滤管浓缩后用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜过滤，待用。
②上样和洗脱将上述处理好的样品上凝胶过滤柱SuperdeX200，洗脱液为 PH7. 0，IOmM PBS,流速为0. ZmLmirT1，收集洗脱体积为60_80mL的洗脱液，2°C下用I的超滤管进行浓缩(参见图2)。并且利用标准蛋白Blue deXtran2000 (葡聚糖2000, 2000kDa)， Ferritin hors (马脾铁蛋白，450kDa)，Catalase bovine (牛过氧化氢酶，240kDa)， Aldolase rabbit (兔酸缩醇，160kDa) ,Albumin egg(卵清蛋白，45kDa) ,Chymotrypsinogen A (糜蛋白酶原，25kDa) Cytochrome C (细胞色素c，12. 4kDa)进行分子量校正，结果显示该溶血毒素蛋白分子量约为450kDa。(参见图2)
5) Native-PAGE检测溶血毒素蛋白纯度将步骤4)分离到的DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱溶血洗脱峰进行Native-PAGE电泳检测其纯度，具体如下利用4%浓缩胶和7. 5%分离胶以及Tris-Gly电泳缓冲液(不含SDS)在4°C进行电泳。其中浓缩胶， 分离胶中也均不含有SDS，上样缓冲液中不含有SDS和DTT或β-巯基乙醇等还原剂。电泳结束后利用银染法对胶进行染色，结果显示该蛋白的纯度在90%左右。(参见图3)
6)溶血活性的检测将健康鸡的新鲜血液用等渗液(0. 145Μ NaCl 20mMpH 7. 4PBS)稀释10倍后，IOOOg离心15min，弃上清，然后重复三次，收集底部红细胞并用等渗液稀释至0.05%红细胞悬浮液待用。分别取100 μ L步骤4)洗脱峰浓缩液加入到 0. 5mL0. 05%鸡血红细胞悬浮液中，用等渗液稀释至终体积为5mL，37°C下反应30min，反应结束后IOOOg离心15min，取上清液于415nm处测定吸光度，以未加毒素组为空白对照，以直接用水稀释0. 5mL0. 05%鸡血红细胞悬浮液至5ml为100%溶血的阳性对照，实验结果显示该溶血蛋白的半溶血率约为70μ g/mL。(参见图4)
实施例2
1)沙蜇毒素刺丝囊细胞的制备将^^冰冻的沙蜇触手于4°C下自溶过夜后，用滤筛过滤去除沙蜇触手残片，收集上清液倒掉。然后1200g，4°C下冷冻高速离心15min并收集下层沉淀，用生理盐水(0. 154mol - L-1NaCl溶液)于4°C反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，-20°C下冷冻保存备用。
2)沙蜇毒素的提取称取沙蜇刺丝囊细胞20mg，加入30mL pH7. 0，20mM在2°C下预冷的磷酸缓冲液中，而后将其置于冰浴中用超声波功率为300kw下破碎40min中，工作/ 间隙为5s/30s。然后2°C，12000g离心IOmin待用。
3)阴离子交换树脂DEAE Sepharose Fast Flow分离沙蜇毒素
①上样前样品的预处理取上述提取到的沙蜇毒素于2。C pH7. 0，20mM磷酸缓冲液中透析过夜，然后4°C下12000g离心5min，取上清，用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜过滤，待用。
②上样和洗脱将上述处理好的样品上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，分离时采用分步洗脱，流速为ZmLmirT1，洗脱液为0,0. 1,0. 2,0. 3和2M NaCl的ρΗ7· 0，浓度 20mM的磷酸缓冲液(PBS)，然后收集溶血组分即收集0. 2M NaCl的洗脱液。
4)凝胶过滤交换树脂SuperdeX200分离上一步中溶血组分
①上样前样品的预处理将上步分离得到的溶血组分在4°C用涨超滤管浓缩后用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜过滤，待用。
②上样和洗脱将上述处理好的样品上凝胶过滤柱SuperdeX200，洗脱液为 PH7. 0，20mM PBS,流速为0. SmLmin"1,收集洗脱体积为60_80mL的洗脱液，4°C下用涨的超滤管进行浓缩。并且利用标准蛋白Blue dextran2000(葡聚糖2000，2000kDa)，Ferritin hors(马脾铁蛋白，450kDa)，Catalase bovine (牛过氧化氢酶，240kDa)，Aldolase rabbit (兔酸缩醇，160kDa)，Albumin egg (卵清蛋白，45kDa)， Chymotrypsinogen A (魔蛋白酶原，25kDa) Cytochrome C (细胞色素c，12. 4kDa)进行分子量校正，结果显示该溶血毒素蛋白分子量约为450kDa。(参见图2)
5)Native-PAGE检测溶血毒素蛋白纯度将步骤4)分离到的DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱溶血洗脱峰进行Native-PAGE电泳检测其纯度，具体如下利用4%浓缩胶和7. 5%分离胶以及Tris-Gly电泳缓冲液(不含SDS)在4°C进行电泳。其中浓缩胶， 分离胶中也均不含有SDS，上样缓冲液中不含有SDS和DTT或β-巯基乙醇等还原剂。电泳结束后利用银染法对胶进行染色，结果显示该蛋白的纯度在90%左右。(参见图3)
6)溶血活性的检测将健康鸡的新鲜血液用等渗液(0. 145Μ NaCl 20mMpH 7. 4PBS)稀释10倍后，IOOOg离心15min，弃上清，然后重复三次，收集底部红细胞并用等渗液稀释至0.05%红细胞悬浮液待用。分别取100 μ L步骤4)洗脱峰浓缩液加入到 0. 5mL0. 05%鸡血红细胞悬浮液中，用等渗液稀释至终体积为5mL，37°C下反应30min，反应结束后IOOOg离心15min，取上清液于415nm处测定吸光度，以未加毒素组为空白对照，以直接用水稀释0. 5mL0. 05%鸡血红细胞悬浮液至5ml为100%溶血的阳性对照，实验结果显示该溶血蛋白的半溶血率约为70μ g/mL。(参见图4)
实施例3
1)沙蜇毒素刺丝囊细胞的制备将3kg冰冻的沙蜇触手于6°C下自溶过夜后，用滤筛过滤去除沙蜇触手残片，收集上清液倒掉。然后1500g，6°C下冷冻高速离心20min并收集下层沉淀，用生理盐水(0. 154mol - L-1NaCl溶液)于6°C反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，-20°C下冷冻保存备用。
2)沙蜇毒素的提取称取沙蜇刺丝囊细胞30mg，加入40mL pH7. 0，30mM在6°C下预冷的磷酸缓冲液中，而后将其置于冰浴中用超声波功率为400kw下破碎60min中，工作/ 间隙为5s/30s。然后6°C，15000g离心20min待用。
3)阴离子交换树脂DEAE Sepharose Fast Flow分离沙蜇毒素
①上样前样品的预处理取上述提取到的沙蜇毒素于6°CpH7.0，30mM磷酸缓冲液中透析过夜，然后6°C下15000g离心5min，取上清，用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜过滤，待用。
②上样和洗脱将上述处理好的样品上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，分离时采用分步洗脱，流速为SmLmirT1，洗脱液为0,0. 1,0. 2,0. 3和2M NaCl的ρΗ7· 0，浓度 20mM的磷酸缓冲液(PBS)，然后收集溶血组分即收集0. 2M NaCl的洗脱液。
4)凝胶过滤树脂SuperdeX200分离上一步中溶血组分
①上样前样品的预处理将上步分离得到的溶血组分在6°C用IOK超滤管浓缩后用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜过滤，待用。
②上样和洗脱将上述处理好的样品上凝胶过滤柱SuperdeX200，洗脱液为 pH7. 0,30mM PBS，流速为lmLmirT1，收集洗脱体积为60_80mL的洗脱液，6°C下用IOK的超滤管进行浓缩。并且利用标准蛋白Blue dextran2000(葡聚糖2000，2000kDa)，Ferritin hors(马脾铁蛋白，450kDa)，Catalase bovine (牛过氧化氢酶，240kDa)，Aldolase rabbit (兔酸缩醇，160kDa)，Albumin egg (卵清蛋白，45kDa)， Chymotrypsinogen A (魔蛋白酶原，25kDa) Cytochrome C (细胞色素c，12. 4kDa)进行分子量校正，结果显示该溶血毒素蛋白分子量约为450kDa。(参见图2)
5)Native-PAGE检测溶血毒素蛋白纯度将步骤4)分离到的DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱溶血洗脱峰进行Native-PAGE电泳检测其纯度，具体如下利用4%浓缩胶和7. 5%分离胶以及Tris-Gly电泳缓冲液(不含SDS)在4°C进行电泳。其中浓缩胶， 分离胶中也均不含有SDS，上样缓冲液中不含有SDS和DTT或β-巯基乙醇等还原剂。电泳结束后利用银染法对胶进行染色，结果显示该蛋白的纯度在90%左右。(参见图3)
6)溶血活性的检测将健康鸡的新鲜血液用等渗液(0. 145Μ NaCl 20mMpH 7. 4PBS)稀释10倍后，IOOOg离心15min，弃上清，然后重复三次，收集底部红细胞并用等渗液稀释至0.05%红细胞悬浮液待用。分别取100 μ L步骤4)洗脱峰浓缩液加入到 0. 5mL0. 05%鸡血红细胞悬浮液中，用等渗液稀释至终体积为5mL，37°C下反应30min，反应结束后IOOOg离心15min，取上清液于415nm处测定吸光度，以未加毒素组为空白对照，以直接用水稀释0. 5mL0. 05%鸡血红细胞悬浮液至5ml为100%溶血的阳性对照，实验结果显示该溶血蛋白的半溶血率约为70 μ g/mL。(参见图4)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种从沙蜇刺丝囊毒素中分离溶血毒素蛋白的方法，其特征在于1)将处理后的沙蜇刺丝囊细胞上清液经微孔滤膜过滤，滤液经含DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱，采用洗脱液以UmLmirT1流速进行纯化分离，收集洗脱液在低温下用3 涨的超滤管进行浓缩，待用；所述洗脱液为含不同浓度NaCl的磷酸缓冲液，NaCl 浓度分别为0,0. 1,0. 2,0. 3和2M ；收集采用含0. 2M NaCl的磷酸缓冲液洗脱下的组分；2)将上述所得洗脱组分经微孔滤膜过滤，滤液经凝胶色谱柱SuperdeUOO采用0.15M NaCl，10 50mM，pH7. OPBS缓冲液以0. 2 1. OmLmirT1流速进行分离纯化，收集洗脱体积处于60 SOmL的洗脱液，而后在2 6°C下用3 涨的超滤管进行浓缩，浓缩后即得到从沙蜇刺丝囊毒素中分离溶血毒素蛋白。
2.按权利要求1所述的从沙蜇刺丝囊毒素内分离溶血毒素蛋白的方法，其特征在于 所述处理后的沙蜇刺丝囊细胞上清液将沙蜇刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后 2 6°C离心，收集上清液于2 6°C下用磷酸缓冲液透析过夜，然后低温离心，收集上清液， 待用。
3.按权利要求2所述的从沙蜇刺丝囊毒素内分离溶血毒素蛋白的方法，其特征在于 所述沙蜇刺丝囊细胞将置于-80 _20°C低温的沙蜇触手于2 6°C自溶12 48h，自溶后利用20 60目的标准分样筛滤去触手残片，而后在2 6°C下10000 15000g离心5 20min,收集下部沉淀，2 6°C冷冻干燥，待用。
4.按权利要求2所述的从沙蜇刺丝囊毒素中分离溶血毒素蛋白的方法，其特征在于 所述沙蜇刺丝囊细胞加入PH7. 0，浓度10 30mM的2 6°C下预冷磷酸缓冲液中，而后将其置于冰浴下用超声波功率为200 400kw下破碎20 60min中，工作/间隙为k/30s ； 所述收集上清液于2 6°C下用pH7. 0，浓度10 30mM磷酸缓冲液透析过夜。
5.按权利要求1所述的从沙蜇刺丝囊毒素内分离溶血毒素蛋白的方法，其特征在于 所述采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱进行分离纯化，其中洗脱液为含不同浓度NaCl的磷酸缓冲液，即洗脱液为OMNaCl的pH7. 0，浓度10 30mM的磷酸缓冲液(PBS)、 0. IM NaCl的ρΗ7· 0，浓度10 30mM的磷酸缓冲液(PBS)、0· 2M NaCl的ρΗ7· 0，浓度10 30mM的磷酸缓冲液(PBS)、0· 3M NaCl的ρΗ7· 0，浓度10 30mM的磷酸缓冲液(PBS)和2M NaCl的ρΗ7· 0，浓度10 30mM的磷酸缓冲液(PBS)。
6.按权利要求1所述的从沙蜇刺丝囊毒素中分离溶血毒素蛋白的方法，其特征在于 所述微孔滤膜过滤为采用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜过滤。
全文摘要
本发明涉及海洋生物技术领域，具体的说是一种分离纯化沙蜇毒素内溶血毒素蛋白的方法。其分离方法如下沙蜇刺丝囊细胞经超声破碎提取得到水母粗毒素，透析除盐后先后依次经过阴离子和凝胶过滤色谱层析分离纯化，最终得到一种具有溶血活性的水母毒素蛋白，并且测定其半溶血率约为70μg/mL，分子量约为450kDa。本发明具快速、简便的特点，为获得沙蜇毒素溶血毒素蛋白提供了重要的方法指导。
文档编号C07K1/34GK102516380SQ20111041495
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者于华华, 刘松, 孟祥涛, 崔金会, 李克成, 李冰, 李荣锋, 李鹏程, 秦玉坤, 邢荣娥 申请人:中国科学院海洋研究所