专利名称：AXMI-066和AXMI-076:δ-内毒素蛋白及其使用方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白质和编码 它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂以及生产转基因的抗害虫植物。
背景技术：
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特 征在于它能产生对某些目和种的昆虫有特异性毒性，但是对植物和其他非靶向生物体无害 的晶状包含体。因此，包含苏云金杆菌菌株或它们的杀虫蛋白的组合物可用作环境可接受 的杀虫剂以控制农业虫害或针对多种人或动物疾病的昆虫媒介。来自苏云金杆菌的晶体(Cry)蛋白(S-内毒素)具有主要针对鳞翅目，双翅 目和鞘翅目幼虫的有效杀虫活性。这些蛋白质还显示出抗膜翅目，同翅目，虱目，食毛目 和螨害虫目，以及如线虫，扁形动物和Sarcomastigorphora等其他无脊椎动物目的活性 (Feitelson(1993)TheBacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc.，New York, N. Y.)。这些蛋白质主要基于它们的杀虫活 性而最初被划分为Cryl到CryV。这些主要的类别是鳞翅目特异性的(I)，鳞翅目和双翅目 特异性的(II)，鞘翅目特异性的(III)，双翅目特异性的(IV)，以及线虫特异性的(V)和 (VI)。所述蛋白质被进一步划分为亚家族；各个家族内更密切相关的蛋白质被指派上分类 字母，如Cry 1A, Cry IB, Cry 1C等等。在各亚类内更紧密相关的蛋白质则命名为如Cry 1C1, CrylC2 等等。最近出现了一种针对Cry基因的新命名法，其基于的是氨基酸序列同源性而非昆 虫靶特异性(Crickmore 等人(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807_813)。在该新的分 类法中，每种毒素被分配了一个独特的名称，其中合并了第一分类(阿拉伯数字)、第二分 类(大写字母)、第三分类(小写字母)和第四分类(另一个阿拉伯数字)。在该新的分类 法中，罗马数字被转换成第一分类的阿拉伯数字。序列同一性小于45%的蛋白质具有不同 的第一分类，而对于第二和第三分类而言这一标准分别为78%和95%。晶体蛋白在已经被摄取和在昆虫中肠溶解前不显示杀虫活性。被摄取的前毒素 在昆虫消化道内经蛋白酶水解成活性的毒性分子。(Hofte和Whiteley (1989)Microbiol. Rev. 53 :242-255)。此毒素与靶幼虫中肠内的顶端刷状缘受体结合并插入顶端膜中，产生离 子通道或孔，导致幼虫死亡。6 -内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(参见，例 如，de Maagd等人(2001) Trends Genetics 17:193-199)。第一个保守的结构性结构域由 7个a螺旋组成，并涉及膜插入和孔形成。结构域II由排列成希腊语key构型的3个日折 叠片组成，而结构域III由“薄卷饼型(非同源蛋白质折叠)”形式的两个反向平行0折叠 组成(de Maagd等人，2001，同上文)。结构域II和III涉及受体识别和结合，并因此被认 为是毒素特异性的决定簇。由于昆虫可造成的破坏，和通过控制虫害而致的产量提高，所以一直需要发现新 形式的杀虫毒素。
发明概述提供了赋予细菌，植物，植物细胞，组织和种子杀虫活性的组合物和方法。组合物 包括编码杀虫和杀昆虫多肽的核酸分子，包含那些核酸分子的载体，和包含这些载体的宿 主细胞。组合物还包括杀虫多肽序列和针对那些多肽的抗体。该核苷酸序列可用于DNA构 建体或表达盒中，用于转化生物体和在生物体中表达，该生物体包括微生物和植物。核苷酸 或氨基酸序列可以是已经被设计成用于在生物体中表达的合成序列，包括但不限于，微生 物或植物。组合物还包括转化的细菌，植物，植物细胞，组织和种子。特别地，提供了编码杀虫蛋白的分离的核酸分子。另外，包含与该杀虫蛋白对应的 氨基酸序列。尤其是，本发明提供了下述分离的核酸分子，其含有编码SEQ ID N0:2或5中 所示的氨基酸序列的核苷酸序列，和SEQID N0:l、3、4、6、9或11中所示的核苷酸序列，或者 保藏在登录号为NRRL B-50045的细菌宿主中的质粒的DNA插入物的5 -内毒素核苷酸序 列，及其变体和片段。还包含与本发明的核苷酸序列互补或与本发明的序列杂交的核苷酸 序列。还提供了用于生产本发明的多肽的方法，以及利用那些多肽来控制或杀死鳞翅 目，鞘翅目，线虫或双翅目害虫的方法。还包括用于在样品中检测本发明的核酸和多肽的方 法和试剂盒。本发明的组合物和方法用于产生具有增强的抗虫性或耐受性的生物体。这些生物 体和包含该生物体的组合物是农业用途所需的。本发明的组合物也用于产生具有经改变或 改良的杀虫活性的蛋白质，或用于检测产品或生物体中杀虫蛋白或核酸的存在。附图简述
图1显示了 axmi-066基因的DNA序列和它周围的DNA区域(SEQ IDN0 :8)。第1 个ATG (对应于SEQ ID NO 1的起始位点；SEQ ID NO 1的翻译编码AXMI-066 (SEQ ID NO 2))，位于该图中所示序列的第52位核苷酸。第2个内部的甲硫氨酸(其翻译编码SEQ ID NO :2的14到637位残基)位于该图中的第91位。TAA终止密码子开始于该图中的序列的 第1963位。ATG起始密码子和TAA终止密码子以黑体字显示。2个推定的核糖体结合位点 以斜体和下划线表示。图 2A-2D 显示 了 AXMI-066_long(SEQ ID NO 2), AXMI-066 (SEQID N0:10)、 Cry2Aal(SEQ ID NO :14)、Cry2Abl(SEQ ID NO : 15)、Cry2Acl(SEQ ID NO : 16)、Cry2Adl(SEQ ID NO 17)、Cry2Ael (SEQ IDN0 18)、CrylAc(SEQ ID NO 19)和 Cry3Aal (SEQ ID NO 20) 的序列比对。该序列比对显示了以黑色突出显示的最高度保守氨基酸残基，和以灰色突出 显示的高度保守氨基酸残基。详细说明本发明涉及用于调控生物体，尤其是植物或植物细胞中害虫抗性或耐受性的组合 物和方法。“抗性”是指害虫(例如，昆虫)在摄取本发明的多肽或者与本发明的多肽以其 他方式接触之后被杀死。“耐受性”是指损害或减少害虫的运动，进食，繁殖或其他的功能。 该方法包括用编码本发明的杀虫蛋白的核苷酸序列转化生物体。具体而言，本发明的核苷 酸序列可用于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因而，提供了转化的细菌，植物，植物细 胞，植物组织和种子。组合物是芽孢杆菌属或其他物种的杀虫核酸和蛋白质。所述序列发现 用于构建表达载体，其用于随后转化入目的生物体内，作为探针用于分离其他的同源(或
6部分同源)基因，以及通过本领域已知的方法产生改变的杀虫蛋白，如结构域交换或DNA改 组。所述蛋白质发现用于控制或杀死鳞翅目，鞘翅目，双翅目和线虫害虫种群，以及用于产 生具有杀虫活性的组合物。含有本发明的axmi-066核苷酸序列的质粒于2007年5月29日保藏于农业研究机 构保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection,Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815North UniversityStreet, Peoria,伊利诺斯州 61604, 美国)的永久收藏中，登录号为NRRLB-50045。该保藏物将根据国际承认用于专利程序的 微生物保存布达佩斯条约的条款进行维持。在申请未决期间，对于专利和商标的委员和经 求由该委员确定对其有资格的人员可获得这些保藏物。在本申请的任何权利要求得到批 准时，诸位申请人将依据37C. F. R. § 1. 808，将使由NRRL保藏的这种或这些样品可供公众 获取。。进行这种保藏仅仅是为了本领域熟练技术人员的方便，而非承认保藏是根据35U. S.C. § 112所要求的。“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”是指对一种或多种害虫具有毒性的毒素，或者与这 种蛋白质具有同源性的蛋白质，所述害虫包括但不限于，鳞翅目，双翅目和鞘翅目或线虫 门的成员。已经从生物体包括例如芽孢杆菌，双酶梭菌(Clostridium bifermentans)和 Paenibacillus popilliae分离出杀虫蛋白。杀虫蛋白包含由这里公开的全长核苷酸序列 推导出来的氨基酸序列，以及由于使用可选择的下游起始位点或者由于产生具有杀虫活性 的较短蛋白质的加工所造成的比全长序列短的氨基酸序列。加工可发生在表达所述蛋白质 的生物体内，或者在摄取所述蛋白质后的害虫体内。杀虫蛋白包括内毒素。内毒素包括被确认为cryl到cry 43、cytl和 cyt2的蛋白质，以及Cyt-类毒素的蛋白质。目前有超过250种具有广泛特异性和毒性的 已知 6 -内毒素。更全面的名单参见 Crickmore 等(1998)，Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 807-813，而定期的更新参见 www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index 上 白勺 Crickmore 等(2003) "Bacillusthuringiensis toxin nomenclature，，。因此，这里提供了赋予杀虫活性的新的分离的核苷酸序列。这些分离的核苷酸序 列编码与已知的内毒素或二元毒素同源的多肽。还提供了杀虫蛋白的氨基酸序列。由 该基因的翻译而产生的蛋白质可使细胞控制或杀死摄取它的害虫。分离的核酸分子及其变体和片段本发明的一个方面是关于含有编码杀虫蛋白和多肽或其生物学活性部分的核苷 酸序列的分离的或重组核酸分子，以及足以用作杂交探针来鉴定编码具有序列同源性区域 的蛋白质的核酸分子的核酸分子。如这里使用的，术语“核酸分子”意在包括DNA分子(例 如，重组DNA，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和利用核苷酸类似物产生的所 述DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质或者其生物学活性部分，指当通过重组 技术生产时基本上无其他的细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上无化学前体或其 他的化学物质。优选的，“分离的”核酸中没有在该核酸来源的生物体的基因组DNA内天然 状态下处于该核酸两侧(即，位于所述核酸的5’和3’末端的序列)的序列(优选蛋白质 编码序列)。就本发明的目的而言，“分离的”当用于描述核酸分子时，并不包括分离的染 色体。例如，在多种实施方案中，分离的编码杀虫蛋白的核酸分子可包含天然存在于所述核酸来源的细胞的基因组DNA中该核酸分子两侧的小于大约5kb，4kb，3kb，2kb，lkb，0. 5kb或 0. lkb的核苷酸序列。基本上无细胞物质的杀虫蛋白包括具有少于大约30%，20%，10%或 5% (干重)的非杀虫蛋白(这里也称为“污染蛋白质”)的蛋白质制品。编码本发明蛋白质的核苷酸序列包括SEQ ID N0:l，3，4，6，9或11中所示的序列， 或者保藏在登录号B-50045的细菌宿主中的核苷酸序列及其变体，片段和互补序列。“互补 序列”意指足以与给定核苷酸序列互补以致可与该给定核苷酸序列杂交从而形成稳定的双 螺旋的核苷酸序列。由该核苷酸序列编码的杀虫蛋白的相应氨基酸序列在SEQ ID N0:2或 5中所示。作为编码杀虫蛋白的这些核苷酸序列的片段的核酸分子也包括在本发明内。“片 段”指编码杀虫蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可编码杀虫蛋白的生物学 活性部分，或者它可以是可以用作下面公开的方法中杂交探针或PCR引物的片段。为编码 杀虫蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少大约50、100、200、300、400、500、600、 700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400个连续核苷酸，或者至多编码这里公开的 杀虫蛋白的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目，这取决于目的用途。“连续”核苷酸指彼 此紧密相邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的片段将编码保留杀虫蛋白的生物学活 性，并从而保持杀虫活性的蛋白质片段。“保留活性”指所述片段具有杀虫蛋白的杀虫活性 的至少大约30 %，至少大约50 %，至少大约70 %，80 %，90 %，95 %或更高。在一个实施方 案中，杀虫活性是杀鞘翅目活性。在另一个实施方案中，杀虫活性是杀鳞翅目活性。在另 一个实施方案中，杀虫活性是杀线虫活性。在另一个实施方案中，杀虫活性是杀双翅目活 性。用于测定杀虫活性的方法是本领域公知的。参见，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83 :2480_2485 ；Andrews 等(1988)Biochem. J. 252 199-206 ；Marrone 等(1985) J. of Economic Entomology 78 :290_293 ；和美国专利
发明者D·J·汤姆索, K·S·桑普森, N·德赛, S·沃尔拉斯, S·阿加瓦尔, V·海因里希斯 申请人:阿森尼克斯公司