用于检测呕吐毒素的elisa试剂盒的制备方法
【专利摘要】本发明为一种用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被了呕吐毒素抗原的酶标板、呕吐毒素标准品、呕吐毒素抗体工作液、酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩样品稀释液和浓缩洗涤液。呕吐素素检测试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里将会出现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中呕吐毒素的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测谷类及谷物制品中的呕吐毒素。
【专利说明】用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备
【技术领域】
[0001]本发明属于检测【技术领域】，具体地涉及一种用于定量检测谷物和谷物产品中的呕吐毒素残留量的ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002]真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，目前己知的有300多种化学结构不同的真菌毒素，其中有30多种真菌菌株产生的代谢产物对动物和人类都具有致病性。根据FAO估计，每年全世界约有25%的粮食作物受到真菌毒素的污染，造成的经济损失每年达数千亿美元。在人类日益关注食品卫生质量和安全的今天，真菌毒素的污染已成为不容忽视的问题。我国农产品和饲料中常见的、危害性比较大的真菌毒素主要有黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌炼醇、呕吐菌素、玉米赤霉烯酮及赭曲霉毒素A等。
[0003]呕吐毒素，又称脱氧雪腐镰刀菌炼醇(Deoxynivalenol, DON),是于1970年从被禾谷镰刀菌污染的玉米中分离出来的一种能引起呕吐的毒素，主要由禾谷镰刀菌iFusarium graminearum )、黄色键刀菌 QFusarium cuImorum )和燕麦键刀菌 QFusariumavenaceum)产生,常见于赤霉病麦。我国是小麦赤霉病高发区，赤霉病流行时，长江中下游地区、东北春麦区和黄淮小麦的病穗率高达50%以上。呕吐毒素的化学名称为3a，7a, 15-三羟基草镰孢菌-9-唏-8-酮，分子量296.3，属单端孢霉炼族化合物B型。对热比较稳定，一般的烹调和加热都不能破坏其毒性，对碱性环境比较敏感，用碳酸钠溶液洗涤粮食，可以除掉70%左右的DON。
[0004]DON对小麦黄化芽鞘和培根的生长有强生物活性，特别是对感病小麦有显著的生长抑制作用，并损伤寄主组织细胞，导致芽鞘、胚根变色溃烂。DON可直接污染谷类等农作物，从而进入人或动物体内，还可通过被污染的肉、奶等动物源性食品进入人体。动物DON中毒后表现为呕吐，食欲减退，体重下降，流产，弱仔和死胎，死亡率增高。人类DON中毒后会出现恶心、呕吐、胃部不适、腹痛、腹泻、头痛、头暈，还可能有口干、全身无力的症状，少数患者会出现颜面潮红、发烧。DON还具有很强的致癌、致畸、致突变的毒性、免疫毒性等危害，已被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为最危险的自然发生食品污染物之一。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为三类致癌物。
[0005]呕吐毒素的危害已引起很多国家的重视，一些国家已制定了谷物中呕吐毒素的限量标准，美国制定供人类食用的小麦呕吐毒素允许限量< 2 mg/kg，而欧盟制定的限量标准相对较严，谷粉及玉米粉中允许限量< 0.75 mg/kg。我国GB 2715-2005《粮食卫生标准》中规定小麦、大麦、玉米及其成品粮中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量为1000μ g/kg，GB 2761-2005《食品中真菌毒素限量》规定小麦和玉米的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量为1000 μ g/kg。
[0006]自60年代以来，所建立的呕吐毒素的检测方法多达30余种，主要分为三类:生物学方法、理化方法以及免疫分析方法。生物学方法的检测方法极易受到干扰，现已较少使用。基于大型精密仪器的理化方法具有灵敏度高、特异性强的优点，但其需要昂贵的检测设备、专业的操作人员，以及复杂的样本前处理方法，限制了该方法的广泛应用。免疫分析方法兴起于上世纪80年代，基于抗原抗体的特异性结合，具有灵敏、快速、特异、简便等优点，近年来已广泛应用到毒素残留的检测中。目前呕吐毒素的免疫学检测试剂盒大多来自进口，而国内有关呕吐毒素的试剂盒的开发还相对落后。本发明旨在建立一种检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备。
【发明内容】
[0007]针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。本发明提供了一种用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备。
[0008]检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、呕吐毒素标准品、呕吐毒素抗体工作液、酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。
[0009]一种用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备，包括以下步骤:酶标板的制备、呕吐毒素标准品的制作、呕吐毒素单克隆抗体及其工作液的制备、酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。
[0010]其进一步特征在于:所述呕吐毒素包被抗原是将呕吐毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为卵清白蛋白(OVA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将呕吐毒素包被抗原稀释成lPg/mL, 100 μ?ν孔,4°C放置过夜,取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μ?ν孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180 μ?7孔，37°C放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C )晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。
[0011]所述呕吐毒素标准品浓度分别为O Pg/mL、0.2 Pg/mL、0.5 Pg/mL、1.0 Pg/mL、2.5M-g/mL ；
所述呕吐毒素单克隆抗体工作液的制备:采用呕吐毒素人工抗原免疫小鼠，并通过细胞融合、筛选所得到，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成1:10000 ；
所述酶标二抗工作液的制备:用羊抗小鼠的酶标二抗稀释液稀释成1:2000比例；
所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液； 所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；
所述终止液为2 mol/L的硫酸；
所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
[0012]呕吐毒素的ELISA试剂盒的检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤:
(1)样本前处理，并将其复溶于样品稀释液工作液中；
(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20~25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(3)取包被有呕吐毒素抗原的酶标板，加标准品/样本50μ?7孔到对应的微孔中；
(4)加入酶标二抗工作液，50μ?7孔，然后加入呕吐毒素抗体工作液，50 μ?7孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min ；(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260μ?7孔，充分洗涤4飞次，每次间隔10 S，用吸水纸拍干；
(6)加入底物液A50 PL/孔，底物液B 50 PL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15~20min ；
(7)加入终止液50μ?/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)；
(8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中呕吐毒素的含量。
[0013]其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品:
(1)取粉碎好的样品过20目筛并彻底混合；
(2)称取20g样品，加入100ml蒸馏水，剧烈震荡3分钟；
(3)静置3分钟，使样品沉淀；
(4)用WhatmanGF/A玻璃纤维纸过滤萃取液，备用。
[0014]本发明采用酶联免疫吸附试验方法来检测。用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的测定原理:样品中的呕吐 毒素与酶标板上固定的抗原特异性竞争体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中呕吐毒素的含量。如果样品中的呕吐毒素含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为呕吐毒素标准曲线图。
【具体实施方式】
[0016]检测呕吐毒素的ELISA试剂盒，其包括酶标板、呕吐毒素标准品、呕吐毒素抗体工作液、酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。
[0017]下面具体描述本发明中检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备，
呕吐毒素蛋白质偶联物的制备:
将20mgD0N溶解在200 μ?吡啶中，加入到2ml的反应瓶中，在反应瓶中加入68mg的1- 丁基硼酸。混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15-氧_( 丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇。再在其中加入32mg琥珀酸酐，并通入无氧氮气。密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90min,广生3-氧-半玻拍酸-7，15-氧-(丁基硼)-脱氧雪腐键刀菌烯醇。将吡啶在室温吹干后，加入少量的水。然后将残余物(3-HS-D0N)溶解于5mL乙酸乙酯中。超声波处理15分钟后，1000Orpm离心10分钟，取上清液。将沉淀物用乙酸乙酯溶解，重复上述操作，合并上清液。将上清液减压浓缩，进行薄层层析。
[0018]3-HS-D0N与等摩尔的NHS、DCC溶于尽可能少的DMF中，室温振荡30min，离心除去二环己基脲。将上清液缓慢滴加到溶于0.1 N NaHC03的5%BSA或0VA，反应混合物在4°C振荡2h。在0.01M PBS (PH7.5)中透析过夜，测定浓度后，分装冻存。其中DON-BSA偶联物用作免疫原，DON-OVA偶联物用作包被原。
[0019]呕吐毒素抗体的制备:选用16~18g BABL/c小鼠,免疫剂量为每只小鼠每次IOOPg,共免疫五次。首次采用免疫原与弗氏完全佐剂等量混匀，于颈部皮下多点注射；第二、三、四次免疫采用免疫原与弗氏不完全佐剂等量混匀，于背部皮下多点注射；第五次免疫，在融合前三天，采用免疫原直接注射腹腔。取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞融合，有限稀释法克隆细胞株，ELISA检测细胞株特性，包括效价、特异性、灵敏度等。将灵敏度高、特异性好的细胞株扩大培养，并冻存；同时腹腔注射小鼠，获得腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，透析后，测定浓度，分装冻存。
[0020]制备包被有呕吐毒素包被抗原的酶标板:
用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将呕吐毒素抗原DON-OVA稀释成I Pg/mL，100 PL/孔，4°C放置过夜，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μ?ν孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180 μι/孔，37°C放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C )晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存；
所述的呕吐毒素标准品配制浓度分别为O Pg/mL、0.2 Pg/mL、0.5 Pg/mL、1.0 Pg/mL、
2.5 Pg/mL ；
所述的呕吐毒素单克隆抗体工作液的制备:采用呕吐毒素人工抗原免疫小鼠，并通过细胞融合、筛选所得到，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成1:10000 ；
所述酶标二抗工作液的制备:用羊抗小鼠的酶标二抗稀释液稀释成1:2000比例；
所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液； 所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；
所述终止液为2 mol/L的硫酸；
所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
[0021]基于上述制备的试剂，本发明用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒包括如下材料: (1)96孔酶标板X I块(包被有偶联抗原)；
⑵标准液 X5瓶:(ImL/瓶)O Pg/mL、0.2 Pg/mL、0.5 Pg/mL、1.0 Pg/mL、2.5 Kg/mL;
(3)酶标二抗工作液7 mL ；
(4)抗体工作液7 mL ；
(5)底物液A7 mL ；
(6)底物液B7 mL ；
(7)终止液7 mL ；
(8)10X浓缩洗涤液20 mL;
使用本试剂盒时的注意事项:
(1)室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20~25°C)会导致所有标准的OD值偏低；
(2)在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作；
(3)每加一种试剂前需将其摇匀；
(4)反应终止液为2M硫酸,避免接触皮肤；
(5)不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂；
(6)储存条件:保存试剂盒于2~8°C，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下；
(7)试剂变质的迹象:发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。O标准的吸光度(450/630 nm)值小于0.5(A450 nm〈0.5)时，表示试剂可能变质，请勿使用；
(8)该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
[0022]本发明呕吐毒素的ELISA试剂盒在检测谷物和谷物产品中的呕吐毒素残留量中的应用:
本发明的试剂盒用于检测谷物和谷物产品中的呕吐毒素残留量时，通过以下步骤实施:样品预处理、用本发明试剂盒进行检测、分析结果。
[0023](1)样品预处理
取粉碎好的样品过20目筛，并彻底混合；称取20g样品，加入100ml蒸馏水，剧烈震荡3分钟；静置3分钟，使样品沉淀；用Whatman GF/A玻璃纤维纸过滤萃取液，备用。
[0024](2)用本发明试剂盒进行检测上述样品中呕吐毒素残留量
取包被有呕吐毒素抗原的酶标板，加标准品/样本50 VL/孔到对应的微孔中；加入酶标二抗工作液，50 μ?7孔，然后加入呕吐毒素抗体工作液，50 μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min;小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260 PL/孔，充分洗涤4飞次，每次间隔10 S，用吸水纸拍干；加入底物液A 50μ?ν孔，底物液B 50 μ?ν孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15~20min ;加入终止液50 PL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)；对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中的呕吐毒素的残留量。
[0025](3)分析结果
用上述制备的试剂盒中的5个呕吐毒素标准品浓度O Pg/mL、0.2 Pg/mL、0.5 Pg/mL、1.0 Pg/mL、2.5 Pg/mL，在 450/630 nm 处测量吸光度值;
百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，SP百分吸光度值(%) = B/B0X100%
其中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，Btl为O ppb标准溶液的平均吸光度值。
[0026]以标准品百分吸光率为纵坐标，以呕吐毒素标准品浓度(ppb)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。标准曲线见附图1。Y=A+BXX，其中A=41.33733，B=-62.5364, R2=-0.9909。将样本的B/B。值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呕吐毒素的实际浓度。
【权利要求】
1.检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、呕吐毒素标准品、呕吐毒素抗体工作液、酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。
2.检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备，包括以下步骤:酶标板的制备、呕吐毒素标准品的制作、呕吐毒素单克隆抗体及其工作液的制备、酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。
3.根据权利要求2所述呕吐毒素的检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于:所述的呕吐毒素包被抗原是将呕吐毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为卵清白蛋白(OVA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将呕吐毒素抗原稀释成1 Pg/mL，100 μL7孔，37°C放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180uL/孔，371:放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。
4.根据权利要求2所述呕吐毒素的检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于:所述的呕吐毒素标准品浓度分别为O Pg/mL、0.2 Pg/mL、0.5 Pg/mL、1.0 μδ/mL、2.5 Mg/mLo
5.根据权利要求2所述呕吐毒素的检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于:所述的呕吐毒素单克隆抗体是采用呕吐毒素人工抗原免疫小鼠所得到，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成1:10000。
6.根据权利要求2所述呕吐毒素的检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于:所述的酶标二抗工作液用酶标二抗稀释液稀释成1:2000比例；所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
7.权利要求2所述的检测呕吐毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤: (1)预处理待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中； (2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20~25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀； (3)取包被有呕吐毒素抗原的酶标板，加标准品/样本50μ?7孔到对应的微孔中； (4)加入呕吐毒素酶标二抗工作液，50μL/孔，然后加入呕吐毒素抗体工作液，50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min ； (5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260μL/孔，充分洗涤4飞次，每次间隔10 S，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)； (6)加入底物液A50 PL/孔，底物液B 50 PL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15~20min ； (7)加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)； (8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中呕吐毒素的含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品:(1)取粉碎好的样品过20目筛并彻底混合；(2)称取20g样品，加入100ml蒸馏水，剧烈震荡3分钟；(3)静置3分钟，使样品沉淀；(4)用WhatmanGF/A玻璃纤维纸过滤萃取液，备用。
【文档编号】G01N33/577GK103808934SQ201210439123
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月7日 优先权日:2012年11月7日
【发明者】杜道林, 曾昆 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司