一种水母心血管毒素粗提物的制备方法

一种水母心血管毒素粗提物的制备方法
【专利摘要】本发明涉及海洋生物【技术领域】，本发明的目的在于提供一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，该方法是以鲜活水母触手（非口腕或整个口腕部组织）为原料，利用物理刺激方法，通过短时剧烈振荡来激发刺丝囊，使得多数刺丝囊集中发射，排出囊中毒液，然后离心收集上清，粗提水母心血管毒素的方法。本发明的方法操作简便、耗时较现有技术缩短2-3天，非毒素类杂质蛋白引入少，且不含溶血毒素，有利于心血管组分的进一步纯化。
【专利说明】一种水母心血管毒素粗提物的制备方法【技术领域】
[0001]本发明涉及海洋生物【技术领域】，具体涉及一种水母心血管毒素粗提物的制备方法。
【背景技术】
[0002]水母蜇伤已成为最常见的海洋生物伤，水母毒素是导致蜇伤后系列症状的主要原因。水母毒素具有心血管、溶血、神经、肝脏、皮肤与肌肉、蛋白酶等多重生物活性，是一类具有较高研究价值的海洋肽类毒素。
[0003]心血管毒素造成的循环功能损伤是水母蜇伤致死的主要原因，但心血管毒素组分在水母毒素中丰度较低。以往的水母毒素粗提物制备方法存在耗时长、易引入非毒素成分、制备量小等不足，尤其是不能避免其他高丰度蛋白和毒素(如组织蛋白、溶血毒素)的干扰，长期以来水母毒素心血管毒性成分的纯化、鉴定及机制研究进展缓慢。
[0004]水母毒素粗提物制备主要有两种方法:一种是以水母口腕部组织(触手、口腕的混合物)为原料，利用水母组织易自溶的特点，低温(4°C )下搅拌自溶3-4天，离心收集上清经透析即为毒素粗提物(Xiao L, He Q, Guo Y, et al., Cyanea capillata tentacle-onlyextract as a potential alternative of nematocyst venom:1ts cardiovasculartoxicity and tolerance to isolation and purification procedures [J].Toxicon.2009, 53 (I): 146 - 152);另一种是切取水母触手、口腕或整个口腕部组织，低温自溶3-4天后，离心收集沉淀，洗涤沉淀并收集其中的刺丝囊，再通过超声或研磨破碎刺丝囊，离心收集上清经透析为毒素粗提物样品(Marino A, Crupi R, Rizzo G, Morabito R, MusciG, La Spada G. 2007.The unusual toxicity and stability properties of crude venomfrom isolated nematocysts of Pelagia noctiluca(Cnidaria, Scyphozoa).Cell Mol Biol(Noisy-1e-grand).53Suppl:0L994-1002.)。
[0005]综上所述，这两种方法均需经过组织自溶，耗时较长。前者操作相对简易，但必然引入大量非毒素类组织蛋白；后者所制毒素粗提物较前者纯净，但操作环节较多，期间刺丝囊发射率高、损耗大，所获毒素蛋白量很小。总的来说，这两种制备水母毒素粗提物的方法均存在局限性，难以满足后续毒素组分离纯化的需要。

【发明内容】

[0006]本发明的目的在于提供一种操作简便、耗时较短、杂质较少、更利于进一步纯化的水母心血管毒素粗提物的制备方法。
[0007]本发明的主要技术方案是:以鲜活水母触手(非口腕或整个口腕部组织)为原料，利用物理刺激方法，通过短时剧烈振荡来激发刺丝囊，使得多数刺丝囊集中发射，排出囊中毒液，然后离心收集上清，粗提水母心血管毒素的方法。
[0008]本发明提供了一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，包括以下步骤:
[0009]A、以鲜活水母触手为原料,加入PBS (Phosphate Buffer Solution,磷酸盐缓冲液)清洗；
[0010]B、振荡:加入与步骤A的触手等体积的PBS，在涡旋振荡器上以转速2000-3200rpm,最优为 3200rpm,振荡 l-5min,最优为 2min ；
[0011]C、过滤:步骤B得到的内容物以100-500目，最优为300目筛网过滤，收集滤液；
[0012]D、透析:步骤C得到的滤液置于截留分子量为1000Da透析袋中，4°C下用预冷的PBS 透析 6-24h，最优为 8h 后，4°C下 3000-10000 X g 离心 10_30min，最优为 10000 Xg 离心IOmin,收集上清液，即得水母心血管毒素粗提物。
[0013]所述的步骤A中，挑选有活力、触手发达的水母个体，以尼龙丝手抄网捕捞，捕捞的鲜活水母置于盛有海水的容器中，直至其恢复自然活动形态；分离不含口腕组织的触手，剪取触手组织，分装到离心管中。
[0014]上述步骤中，PBS缓冲液是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution)。
[0015]上述步骤中，预冷的PBS缓冲液中的预冷为常规技术，最优的为:使用的PBS缓冲液需经过孔径为0.20 μ m的微孔滤膜过滤，于4°C预冷。
[0016]所述的步骤A中，加入与触手组织等体积的PBS，摇动离心管，将上层清洗液倾尽。
[0017]本发明的方法操作简便、耗时较现有技术缩短2-3天，非毒素类杂质蛋白引入少，且不含溶血毒素，有利于心血管组分的进一步纯化。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1是本发明的方法与自溶法所制水母毒素粗提物SDS-PAGE电泳图；
[0019]图2是本发明的方法与自溶法所``制水母毒素粗提物溶血活性比较。
[0020]图3是本发明的方法与自溶法所制水母毒素粗提物心血管活性比较。
【具体实施方式】
[0021]现结合附图和实施例，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]实施例1
[0023]本发明的方法(简称快速法)制备水母心血管毒素粗提物
[0024]PBS配制:称取8g NaCl.0.2g KC1、3.63g Na2HPO4.6Η20和0.24gKH2P04，溶于900mL蒸馏水中，用盐酸调节PH值至7.4，加蒸馏水定容至1L，最后用孔径为0.20 μ m的微孔滤膜过滤，于4°C预冷。
[0025]1.水母采集:发形霞水母(Cyanea capillata)采自浙江省舟山市嵊泗县。挑选活力较好且触手发达的水母个体，以手抄网捕捞。首先将捕获的水母放入盛有海水的水箱中静置IOmin,待其恢复自然活动状态。
[0026]2.触手分离:剔除触手处杂质，仔细区分触手和口腕等不同组织，准确剪取触手，置于50ml离心管中，每管新鲜触手组织约20ml。
[0027]3.清洗:加入20mlPBS，轻柔摆动离心管清洗触手组织，将上层清洗液轻轻倾尽。
[0028]4.振荡:加入20ml PBS，于涡旋振荡器上以转速3200rpm连续振荡2min。5.过滤:管中内容物以300目筛网过滤2次，收集滤液。[0029]6.透析:将滤液置于1000Da透析袋中，4°C下用预冷PBS中透析8h后，4°C下1000OXg离心lOmin，收集上清液，即为快速法所制水母心血管毒素粗提物。
[0030]实施例2
[0031]现有技术的自溶法制备水母毒素粗提物
[0032] 发形霞水母采自浙江省舟山市嵊泗县。取口腕部组织(触手、口腕的混合物)100g，加入等体积预冷的3.34%人工海水lOOmL，自溶4天，磁力搅拌器每日搅拌2次，每次IOmin ；100目细胞筛网过滤3次，滤液10000 X g离心3次，每次lOmin，收集上清液；将上清液置于截留分子量为1000Da的透析袋中，4°C下用预冷PBS中透析8h后，4°C下1000OXg离心IOmin,上清液即水母毒素粗提物(TE, tentacle extract)。(人工海水配制:称取NaC128g，MgCl2 ?册205g，KC10.8g，CaCl2L 033g，加蒸馏水至 1L，混匀后用孔径为 0.20 μ m 的微孔滤膜过滤，于4°C预冷。)
[0033]实施例3
[0034]自溶法与快速法所制水母毒素粗提物比较
[0035]1、蛋白质纯度比较
[0036]将快制法和自溶法所制毒素粗提物及蛋白分子量标准参照物(Marker)进行SDS-PAGE电泳，分别采用5%积层胶和12%分离胶，单孔上样20 μ I (蛋白总量20μ g)，积层胶和分离胶电压分别采用80v和160v，电泳结束后用银染法进行染色。
[0037]结果如图1所示，与自溶法相比，快速法所制水母心血管毒素粗提物中大分子量组织蛋白(非毒素类蛋白)含量明显减少，提示本发明方法能有效降低非毒素类杂质蛋白的引入，利于后续的毒素分离纯化。
[0038]2、溶血活性比较
[0039]麻醉雄性SD大鼠(购自第二军医大学实验动物中心)尾静脉取血，等体积50U肝素生理盐水抗凝，PBS漂洗数次，每次漂洗后1000 Xg离心5min弃上清，至上清清亮。红细胞与PBS按体积比1:200 (0.5%)稀释成红细胞悬液。0.5ml离心管中先加入红细胞悬液
0.1ml，然后分别加入0.1ml快制法和自溶法所制水母毒素粗提物(0.2mg/ml)，反应总体积达到0.2ml，另设等体积阴性对照组(PBS)和阳性对照组(SDS，十二烷基磺酸钠)。37°C水浴30min, 1000Xg离心5min后,各吸取0.15ml上清液于96孔板中，用酶标仪检测A415,溶血分数=[(样品管A415)—(阴性对照A415)]/[(阳性对照A415)—(阴性对照A415)] X 100%。
[0040]结果如图3所示，快速法所制水母心血管毒素粗提物不具有溶血活性，而自溶法所制粗提物具有一定的溶血活性。
[0041]3、心血管活性比较
[0042]麻醉Sprague-Dawley (SD)大鼠(购自第二军医大学实验动物中心)大鼠股动脉插管，连接MPA-2000生理记录仪(上海奥尔科特生物科技有限公司)监测大鼠血压，颈外静脉插管给予毒素(0.2mg/ml，5ml/kg，lmg/kg)，观察大鼠血压变化，检测两法所制水母粗提物的心血管毒性。
[0043]结果见图2，同等剂量下，快速法与自溶法所制水母毒素粗提物均可使大鼠静脉压明显下降，且快速法毒素在IOmin内迅速致大鼠死亡。
[0044]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。`
【权利要求】
1.一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: A、以鲜活水母不含口腕组织的触手为原料，加入PBS缓冲液清洗； B、振荡:加入与步骤A的触手组织等体积的PBS缓冲液，在涡旋振荡器上以转速2000_3200rpm,振荡 l_5min ； C、过滤:步骤B得到的内容物以100-500目筛网过滤，收集滤液； D、透析:步骤C得到的滤液置于截留分子量为1000Da透析袋中，4°C下，用预冷的PBS缓冲液透析6-24h后，4°C下3000-10000 X g离心10-30min，收集上清液，即得水母心血管毒素粗提物。
2.根据权利要求1所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，挑选有活力、触手发达的水母个体，以尼龙丝手抄网捕捞，捕捞的鲜活水母置于盛有海水的容器中，直至其恢复自然活动形态； 分离不含口腕的触手组织，剪取触手组织，分装到离心管中。
3.根据权利要求1或2所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，加入与触手组织等体积的PBS缓冲液，摇动离心管，将上层清洗液倾尽。
4.根据权利要求1或2所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，步骤B中在涡旋振荡器上以转速为3200rpm，振荡2min。
5.根据权利要求1或2所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，步骤C中以300目筛网过滤，收集滤液。
6.根据权利要求1或2所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，步骤D中用预冷的PBS缓冲液透析8h后，4°C下1000OXg离心lOmin。
7.根据权利要求1或2所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，所述的预冷的PBS缓冲液是指PBS缓冲液需经过孔径为0.20 μ m的微孔滤膜过滤，于4°C预冷。
【文档编号】C07K1/34GK103613653SQ201310629343
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】张黎明, 郑杰民, 陆佳, 阮增良, 成熙, 王蓓蕾, 张博, 刘丹 申请人:中国人民解放军第二军医大学