专利名称：L-抗坏血酸在制备拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体是指L-抗坏血酸在制备预防或治疗发形霞水母蜇伤药物中的应用，进一步地，L-抗坏血酸在制备拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应药物中的应用。
背景技术：
水母种类多，种间差异大，生物多样性丰富。水母一词是个泛称，不具严格的分类学意义，泛指具水母型(钟形或碟形)的刺胞动物，是一类非常原始的海洋无脊椎浮游动物，分类学上隶属刺胞动物门(亦称腔肠动物门)。水母种类超过200种，在长达5 7亿年的进化过程中形成了至少四个大类，即水螅纲(Hydrozoa)、十字水母纲(Staurozoa)、立方水母
纲(Cubozoa)以及钵水母纲(Scyphozoa)。我国东南沿海的主要致伤水母-钵水母纲的
发形霞水母(Cyanea capillata)属于大型水母,伞部直径100-850毫米,扁平呈圆盘状,夕卜伞中央具许多刺胞。8个感觉器位于8个浅凹缘之间的底部，感觉棒梭形，其远端具一豆形平衡囊，没有眼点。下伞的纵辐位上，有8束排列U字形的触手，每束触手数目很多，通常较粗大的触手近于伞中，细小的靠近伞缘，下伞具辐肌束与环肌束。口腕发达，其长度超过伞半径。活体呈乳白色或褐色。在全世界各沿海海域均广泛分布。水母蜇伤是世界上最常见的海洋生物伤，近年来随着水母爆发性增长而不断增多，每年被水母蜇伤的患者数以十万计。水母蜇伤的中毒症状差异明显。以心血管系统毒性为例，不同水母蜇伤后会导致不同的心血管中毒症状，比如部分立方水母纲水母如Carybdea rastonii、Carukia barnesi等蜇伤后可以引起血管收缩、心率增加、血压升高，严重蜇伤者导致心衰、休克甚至死亡，而另一些立方水母纲水母Chironex fleckeri、Chiropsella bronzie>Chiropsalmus quadrigatus等则可以引起心动过缓、血压下降甚至休克死亡等严重症状。而发形霞水母毒素可以引起血管收缩、心动过缓等心血管毒性症状(参见文献Xiao L, Liu GS, Wang QQ, He Q, Liu SH, Li Y, Zhang J, Zhang LM:The lethalityoftentacle-only extract from jellyfish Cyanea capillata is primarily attributedto cardiotoxicity in anaesthetized SD rats[J]. Toxicon 2010，55(4):838-845. X水母毒素是一类结构新颖、毒性极强的肽类毒素，含有损伤心血管、神经和呼吸等系统功能的多种生物活性组分，其中细胞毒性组分被认为是水母毒素发挥毒性作用的主要物质基础，所报道的水母毒素都可产生细胞毒性效应。水母毒素的细胞毒性组分可以造成实验动物和人体广泛的非特异性损伤。如溶血反应、体内水电解质酸碱平衡的紊乱以及心、肝、肾等重要脏器的功能与器质性损伤等(参见文献Xiao L1LiuS，He Q, et al. The acute toxicity and hematological characterization of theeffects of tentacle-only extract from the jellyfish Cyanea capillata[J].Mar Drugs, 2011，9:526-534;Xiao L, Zhang J, Wang Q, et al. In vitro and in vivohaemolytic studies of tentacle-only extract from jellyfish Cyanea capillata[J].Toxicol In Vitro, 2010，24:1203-1207.)。除了非特异性的细胞毒性组分外，水母毒素中还存在着特异性作用于心脏等靶器官的毒性组分。当去除细胞毒性组分后，水母毒素导致的心脏损伤程度明显减轻，说明非特异性的细胞毒性组分与特异性的作用于特定脏器的毒性组分之间具有协同效应，共同造成了某些特定脏器的损伤(参见文献Xiao L, Wang B, Li Y, et al. Cardiovascular effect is independent of hemolytictoxicity of tentacle-only extract from the jellyfish Cyanea capillata[J]. PloSone,2012, 7:e43096.)。总之，拮抗水母毒素中细胞毒性组分产生的非特异损伤效应是预防和治疗水母蜇伤中毒的重要策略。水母毒素细胞毒性组分的作用机理尚不明确，有研究表明细胞毒性组分可能通过破坏细胞膜，引起细胞内外环境失衡而发挥毒性效应，提出了磷脂酶活性与孔道形成等机制(参见文献 Edwards L P, Whitter E, Hessinger D A. Apparent membrane
pore-formation by Portuguese Man-of-war(Physalia physalis)venom in intactcultured cells [J].Toxicon, 2002, 40:1299-1305;Helmholz H,Ruhnau C, SchuttC, Prange A. Comparative study on the cell toxicity and enzymatic activity of twonorthern scyphozoan species Cyanea capillata(L. ) and Cyanea lamarckii (Peron &Leslieur)[J]· Toxicon 2007, 50, 53—64.)。申请人:一直致力于水母毒素细胞毒性以及拮抗水母毒素细胞毒性药物的研究，已于2011年6月30日申请了中国发明专利CN201110180871. 2，发明名称为“钙通道阻断剂在制备拮抗水母毒素心脏毒性药物中的应用”，公开号为CN102228692A。L-抗坏血酸，即维生素C，是一种高效抗氧化剂，可以通过清除自由基而发挥抑制脂质过氧化的作用。此外，L-抗坏血酸参加体内的氨基酸代谢，可以增强机体抗病能力，降低毛细血管的通透性，加速血液凝固，促进铁在肠内的吸收，促进胆固醇的转化，使血脂下降。常用于各种急、慢性感染性疾病，如过敏性皮肤病、紫癜、湿疹、寻麻疹、带状疱疹，急慢性肝炎、肝硬化等肝功能损坏，还可促进伤口的愈合以及高血脂、癌症、感冒的辅助治疗。至今未见有关L-抗坏血酸拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供L-抗坏血酸的新的适应症，具体是指是指L-抗坏血酸在制备预防或治疗发形霞水母蜇伤药物中的应用，进一步地，L-抗坏血酸在制备拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应药物中的应用。申请人:经研究发现，发形霞水母(Cyanea capillata)触手提取物(tentacle extract, TE)可以引起心脏、血液以及红细胞中脂质过氧化产物丙二醒(malondialdehyde, MDA)的显著升高,提示水母毒素还可能通过脂质过氧化作用破坏细胞膜而发挥细胞毒性效应。申请人大胆推测抗氧化剂可能对水母毒素的细胞毒性效应具有拮抗作用，从而减轻水母蛰伤后其毒素引起的体内非特异损伤作用，可以作为预防和治疗水母蜇伤的有效药物。L-抗坏血酸，即维生素C，是一种高效抗氧化剂，可以通过清除自由基而发挥抑制脂质过氧化的作用。此外，L-抗坏血酸参加体内的氨基酸代谢，可以增强机体抗病能力，降低毛细血管的通透性，加速血液凝固，促进铁在肠内的吸收，促进胆固醇的转化，使血脂下降。常用于各种急、慢性感染性疾病，如过敏性皮肤病、紫癜、湿疹、寻麻疹、带状疱疹，急慢性肝炎、肝硬化等肝功能损坏，还可促进伤口的愈合以及高血脂、癌症、感冒的辅助治疗。本发明提供了 L-抗坏血酸在制备预防或治疗发形霞水母蜇伤药物中的应用。进一步地，本发明提供了 L-抗坏血酸在制备拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应药物中的应用。本发明的具体技术方案如下I.制备发形霞水母粗毒提取液I)采样采集鲜活发形霞水母，迅速剪下其触手，立即将触手干冰冷冻，运回后置于_70°C超低温冰箱冻存备用。 2)制备发形霞水母粗毒提取液将冻存触手用自配海水于4°C自溶4天，磁力搅拌器搅拌，收集触手自溶液体，4°C下IOOOOXg离心15min，上清液即发形霞水母粗毒提取液。2. L-抗坏血酸拮抗发形霞水母毒素溶血效应实验I)在离体红细胞水平，L-抗坏血酸拮抗发形霞水母毒素溶血效应，结果表明，预先加入L-抗坏血酸孵育的干预组溶血程度显著低于不加L-抗坏血酸的对照组，说明在离体红细胞水平，L-抗坏血酸可以拮抗发形霞水母毒素的溶血效应。2)在整体动物水平，L-抗坏血酸拮抗发形霞水母毒素溶血效应，结果表明，水母毒素注射IOmin后，中剂量和高剂量L-抗坏血酸干预组的大鼠血清吸光度显著低于对照组。另外一个实验中，18只雄性SD大鼠(230±20g)经腹腔注射乌拉坦(I. 2g/kg)麻醉后，随机分成三组，分别为空白对照组、中毒组、L-抗坏血酸干预组。结果表明，与中毒组相比，L-抗坏血酸干预组大鼠血清中Lac和K+上升幅度显著降低。以上结果表明，在整体动物水平，L-抗坏血酸可以拮抗发形霞水母毒素的细胞毒性效应。申请人:认为，L-抗坏血酸通过抑制发形霞水母毒素对细胞膜(红细胞)的脂质过氧化作用，从而达到拮抗发形霞水母毒素所造成的细胞毒性效应的目的。在离体的红细胞悬液中预先加入5mM的L-抗坏血酸，发形霞水母毒素造成的溶血效应显著降低；在预先腹腔注射L-抗坏血酸的干预组大鼠，发形霞水母毒素产生的体内溶血效应显著低于腹腔注射磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)的对照组。发形霞水母毒素还可以引起大鼠体内电解质和乳酸的紊乱，而L-抗坏血酸可以减轻这种紊乱，尤其是可以显著拮抗血清K+和乳酸的升高幅度。这些结果说明L-抗坏血酸在离体细胞和整体动物水平都可以对发形霞水母毒素的细胞毒性效应产生拮抗作用。本发明在离体的红细胞以及整体动物两个层面验证了 L-抗坏血酸可以拮抗发形霞水母毒素造成的细胞毒性效应，说明L-抗坏血酸适用于开发发形霞水母蜇伤的预防或治疗药物。另外，同样作为高效抗氧化剂的谷胱甘肽(glutathione, GSH),实验证明在离体的红细胞层面也可以拮抗发形霞水母毒素造成的细胞毒性效应，但效果不如L-抗坏血酸。本发明为开发发形霞水母蜇伤的预防或治疗药物提供了一种有效的候选药物。
图I是在离体细胞水平，L-抗坏血酸拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应；
其中ΔΡ〈0. 05vs.单纯毒素组，AP〈0. 05vs. L-抗坏血酸干预组。图2是在整体动物水平，L-抗坏血酸拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应。
具体实施例方式下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提 下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例I.制备发形霞水母粗毒提取液发形霞水母(Cyanea capillata)于2010年8月采自浙江省三门湾海域，取触手10g，加入等体积3. 34%自配海水10ml，自溶4天，磁力搅拌器每日搅拌2次，每次lOmin。100目细胞筛网过滤3次，滤液IOOOOXg离心3次，每次15min，收集上清即发形霞水母粗毒提取液(tentacle extract, TE)。米用Bradford法测定蛋白浓度为I. 2mg/ml。自配海水配方NaCl 28g, MgCl2 · 6H205g, KCl O. 8g, CaCl2 I. 033g，加水至 1000ml。所有操作都在冰水或4°C条件下进行。粗毒提取液使用前采用O. 01mol/L、pH7. 4PBS 透析 8h。实施例2.在离体红细胞及整体动物两个层面，L-抗坏血酸拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应实验I)在离体红细胞水平，L-抗坏血酸能够拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应雄性SD大鼠(230±20g)腹腔注射乌拉坦(I. 2g/kg)麻醉，经眼球内眦后静脉丛取血，新鲜血液悬浮于PBS中，4°C下1000 Xg离心IOmin,小心吸去上层液体,将沉淀的红细胞重新悬浮于PBS中，如此三次，最终制成0. 5%红细胞悬液。将0. 5%红细胞悬液等体积分成五份，即空白对照组、单纯毒素组、L-抗坏血酸干预组、还原型谷胱甘肽干预组、溶血对照组，其中L-抗坏血酸干预组为含有5mM L-抗坏血酸的0. 5%红细胞悬液，还原型谷胱甘肽干预组为含有50 μ M还原型谷胱甘肽的0. 5%红细胞悬液，空白对照组、单纯毒素组及溶血对照组为加入少量PBS以调节体积与L-抗坏血酸干预组和还原型谷胱甘肽干预组一致的0. 5%红细胞悬液。37°C水浴中孵育30min，单纯毒素组、还原型谷胱甘肽干预组和L-抗坏血酸干预组加入发形霞水母毒素(300μ g/ml)，空白对照组加入等体积PBS，溶血对照组加入SDS (40μ g/ml)，37°C水浴中孵育30min，4°C下1000 Xg离心lOmin，取上清，于415nm波长下检测吸光度。溶血分数(％)=样品吸光度/阳性对照组吸光度X 100%。结果表明，L-抗坏血酸干预组和还原型谷胱甘肽干预组溶血分数显著低于单纯毒素组，且L-抗坏血酸拮抗溶血效果显著强于还原型谷胱甘肽，如图I所示。说明在离体的红细胞水平，L-抗坏血酸对发形霞水母毒素的细胞毒性效应具有显著的拮抗作用。2)在整体动物水平，L-抗坏血酸能够拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应将32只雄性SD大鼠(230±20g)腹腔注射乌拉坦(I. 2g/kg)麻醉，随机分成四组，分别为对照组、L-抗坏血酸干预低、中、高剂量组。对照组大鼠经腹腔注射Iml PBS，L-抗坏血酸干预低(125mg/kg)、中(250mg/kg)、高(500mg/kg)剂量组大鼠分别经腹腔注射等体积相应浓度的L-抗坏血酸。静待IOmin后，各组大鼠经尾静脉注射发型霞水母毒素(I. 25mg/kg)。各组大鼠分别于发型霞水母毒素注射前(Omin)、注射后10min、30min、60min经眼球内目此后静脉丛取血，血液室温下静置2h，4°C下1000 Xg离心lOmin，取上清，于415nm波长下检测吸光度，以吸光度值大小代表大鼠体内溶血情况。另外一个实验中，将18只雄性SD大鼠(230±20g)腹腔注射乌拉坦(I. 2g/kg)麻醉，随机分成三组，分别为空白对照组、中毒组和L-抗坏血酸干预组。首先，空白对照组和中毒组大鼠经腹腔注射Iml PBS, L-抗坏血酸干预组大鼠经腹腔注射等体积L-抗坏血酸(250mg/kg)，静待IOmin后，中毒组和L-抗坏血酸干预组大鼠经尾静脉注射发形霞水母毒素(I. 25mg/kg)，空白对照组给予等体积PBS。静脉注射IOmin后，各组大鼠经眼球内眦后静脉丛取血，血液室温下静置2h，4°C下1000 Xg离心lOmin，取上清，用于检测Na+、K+、Ca2+、Cl—等电解质和乳酸(Lac)。结果表明，不同剂量L-抗坏血酸干预组在水母毒素注射后lOmin，体内溶血程度明显低于对照组。250mg/kg L-抗坏血酸干预组大鼠血清中Lac和K+升高幅度较中毒组明显降低，如图2、表I所示。说明在整体动物水平，L-抗坏血酸可以拮抗发形霞水母毒素的 细胞毒性效应。表I :L_抗坏血酸拮抗发形霞水母触手提取物所致体内溶血引起的电解质紊乱
Na (mM) K' (niM) Ca"' (inM) Ci"(mM) Lac (iriM)
空白对照组 139.8± 1.33 7.23 士 0.44 2.34士0.08 99.8 士 1.70 3.18 士 0.40 中毒组137.5 士 1.05A 10.65 土 1.31A 2.20±0.05& 94.7 ± 0.82^ 8.02±0.43&
L-抗坏血酸干预组 136.0 ± 1.10Δ 8.42±0.72δΑ 2.26 ± O93.7 土 0.52么 4.98 土 0.85δΑΔΡ<0. 05vs.空白对照组；▲ 〈()· 05vs.中毒组。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
权利要求
1.L-抗坏血酸在制备预防或治疗发形霞水母蜇伤药物中的应用。
2.L-抗坏血酸在制备拮抗发形霞水母毒素细胞毒性效应药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，具体是指L-抗坏血酸在制备拮抗发形霞水母(Cyanea capillata)毒素细胞毒性效应药物中的应用。本发明在离体的红细胞以及整体动物两个层面验证了L-抗坏血酸可以拮抗发形霞水母毒素造成的细胞毒性效应。本发明为开发发形霞水母蜇伤的预防或治疗药物提供了一种有效的候选药物。
文档编号A61K31/375GK102861009SQ20121036730
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者王涛, 张黎明, 肖良, 王倩倩, 王蓓蕾, 常银龙, 阮增良, 尹慢慢, 徐凤, 郑杰民, 柳国艳 申请人:中国人民解放军第二军医大学