专利名称：人源化抗egfl7抗体及其使用方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及分子生物学领域。更具体地，本发明关注抗EGFL7抗体及其用途。发明背景·维管联结(vascular supply)的发育是许多生理性和病理性过程的基本要求。活跃生长中的组织诸如胚胎和肿瘤要求充足的血液供应。它们通过生成促血管发生因子来满足这一需要，所述促血管发生因子经由称为血管发生(angiogenesis)的过程促进自已有的血管形成新血管；或经由称为维管发生(vasculogenesis)的过程自祖细胞形成新血管。管发生(tubulogenesis)是血管发育中一个至关重要的步骤。血管的管形成是复杂但有序的生物学事件，涉及所有或许多以下步骤a)自已有的内皮细胞(EC)增殖出EC或自祖细胞分化出EC ;b)EC迁移；c)EC接合以形成索样结构；d)血管索然后发生管发生以形成具有中央内腔的血管；e)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管(血管发生)；f)初级血管丛发生进一步重塑(remodeling)和整形(reshaping);及g)内皮周细胞(peri-endothelial cell)被募集来包围内皮管，为血管提供维持和调控功能，此类细胞包括用于小毛细血管的周细胞、用于大血管的平滑肌细胞、和心脏中的心肌细胞。Hanahan, D.Science 277,48-50 (1997);Hogan, B. L. &Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3, 51
3-23 (2002) ; Lubarsky, B. &Krasnow, M. A. Cell. 112, 19-28(2003)。现在完全确立了涉及自已有的内皮形成新血管的血管发生参与多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管综合征诸如增殖性视网膜病例如糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman et al. , J. Biol. Chem. , 267:10931-10934(1992);Klagsbrun et al. , Annu. Rev.Physiol.，53:217-239(1991);及 Garner A.，"Vascular diseases", In:Pathobiologyof Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A.,Klintworth GK, eds. , 2ndEdition(Marcel Dekker, NY,1994), pp 1625-1710。在肿瘤生长的情况中，血管发生对于自增生至瘤形成的转换，及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman et al.，Nature, 339:58 (1989)。新血管形成(neovascularization)让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肿瘤通常开始于单个异常细胞，由于与可利用毛细管床的距离，该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸，而且它能在较长的一段时间里保持“休眠”状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性肿瘤继续生长，而且让转移性肿瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而，在肿瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肿瘤的患者存活之间观察到了相关性。Weidner et al. , N. Engl. J. Med, 324:1-6 (1991) ;Horak et al. , Lancet, 340:1120-1124(1992) ;Macchiarini et al.，Lancet, 340:145-146 (1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡(Folkman, 1995, Nat Med I (I) :27-31)。血管发育过程受到严密调节。迄今为止，多种分子，多为由周围细胞生成的分泌性因子，已显示出调节EC分化、增殖、迁移和接合成索样结构。例如，血管内皮生长因子(VEGF)已鉴定为涉及刺激血 发生和诱导血管通透性的关键因子。Ferrara etal.，Endocr. Rev.，18:4-25(1997)。甚至单个VEGF等位基因的遗失导致胚胎致死的发现指向此因子在血管系统的发育和分化中所发挥的不可代替的作用。此外，VEGF已显示为与肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键介导物。Ferrara et al.，Endocr.Rev.,见上文。VEGF mRNA在多数所检查的人肿瘤中过表达。Berkman et al. , J. Clin.Invest. , 91:153-159 (1993);Brown et aI. , Human Pathol. , 26:86-91 (1995);Brown etal., Cancer Res.，53:4727-4735(1993);Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73:931-934(199
6);Dvorak et al. , Am. J. Pathol. , 146:1029-1039(1995)。血管形成过程中的有些步骤仍然不是很清楚。具体而言，关于管发生如何受到调节一血管索如何进展而变成管，和什么因子调节这种转换知道的很少。鉴于维管发生和血管发生在许多疾病和病症中的作用，希望有降低或抑制一种或多种引起这些过程的生物学效应的手段。通过述及完整收录本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物。发明概述本发明部分基于多种针对EGFL7的抗体。EGFL7作为一种重要且有利的治疗靶，而且本发明提供抗体，作为治疗剂和诊断剂，供靶向与EGFL7表达和/或活性有关的病理状况中使用。因而，本发明提供涉及EGFL7的方法、组合物、试剂盒和制品。例如，在一些实施方案中，本发明提供抗EGFL7抗体。在一些实施方案中，本发明提供一种抗EGFL7抗体，其包含可变域，该可变域包含至少一种、两种、三种、四种或五种选自下组的高变区(HVR)序列(i)包含KxiSx2Sx3DYx4OTSYx5S的HVR-Ll，其中X1为A或R ;X2为 H或Q ;X3SG或V ;X4选自 D，L，R，S，和 W;且 X5SM或V (SEQ ID NO :210) ;(ii)包含GASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1为N或Y;X2选自 L，R 和 Y ;且 X3 为 Q 或 S (SEQ ID NO :211);(iii)包含 Qqnnex1Px2I^Ahvr-LS,其中 X1S D 或E ;且X2 Sf 或 y(seq id no :212);(iv)包含 GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 X1 为 H 或 V ;X2 为 R 或 T ;X3 选自 F，G，R，和 S ;X4 选自 D，G，R，和 T ;且 X5 为 M 或 Y (SEQ ID NO :213) ； (v)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的HVR-H2，其中X1选自1，皿，1'，和1;\为!1或1 而选自I，M，T，和Y ;X4为D或H ;X5选自D，M和 T ;X6 为 F 或 Y ;X7 为 K 或 S ;且 X8 为 G 或 R(SEQ ID NO :214)，和(vi )包含 AxiLGSX2AVDX3的HVR-H3，其中X1为N或R;X2选自C，S，和Y ;且X3为A或Y (SEQ ID NO :215)。在一些实施方案中，该抗EGFL7抗体包含所有六种上述HVR。在一些实施方案中，HVR-Ll包含选自SEQ ID NO :31和37-43的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQ ID NO 32和44-47的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQ ID NO 33和48的氨基酸序列，HVR-Hl包含选自SEQ IDNO 34和49-57的氨基酸序列，HVR-H2包含选自SEQ ID NO 35和58-73的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO : 36和74-77的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链包含下述框架序列包含 Ex1Qlvesggglvqpggslrlscaas 的 fr-hi，其中 X1 为 I 或 v (seq id no 216);包含 WvrqapgkgleWx1 的 FR-H2，其中 X1 为 I 或 v (seq id no :217);包含 Rftx1Sx2DX3SX4X5TX6YLQMNSLRAEDTAVYX7CAR 的 FR-H3,其中 X1 为 F 或 I ;X2 为 L 或 R ;X3 为 N 或 T ;X4选自 A，E，K 和 T ;X5 为 N 或 S ;X6 选自 A，L，M，T 和 V ;且 X7 为 F 或 Y (SEQ ID NO :218);和包含WGQGTLVTVSS的FR-H4 (SEQ ID NO :219)。在一些实施方案中，重链包含下述框架序列包含 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-Hl (SEQ ID NO :197);包含 WVRQAPGKGLEWV的 FR-H2 (SEQ ID NO :198);包含 RFTISxiDNSKNTX2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中
X1为 L 或 R ;X2 选自 A，L，M，T 和 V (SEQ ID NO :220);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQID NO 200)o在一些实施方案中，轻链包含下述框架序列包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC的 FR-Ll (SEQ ID NO :201 )，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2 (SEQ ID NO :202)，包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO :203)，包含 FGQGTKVEIK (SEQID NO :221)或FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO :204)的FR-L4。在一些实施方案中，轻链包含图 15 (SEQ ID N0:82和83)所示4F11.V17或4F11.V22的可变域序列。在一些实施方案中，重链包含
图16 (SEQ ID N0:84和85)所示4F11.V17或4F11.V22的可变域序列。在一些实施方案中，本发明提供一种抗体，其中轻链包含图15 (SEQ ID NO :82)所示4F11. vl7的可变域序列且重链包含图16 (SEQ ID NO :84)所示4F11. vl7的可变域序列。在一些实施方案中，本发明提供一种抗体，其中轻链包含图15 (SEQ ID N0:83)所示4F11.V22的可变域序列且重链包含图16 (SEQ ID N0:85)所示4F11.V22的可变域序列。在一些实施方案中，本发明提供一种抗EGFL7抗体，其包含可变域，该可变域包含至少一种、两种、三种、四种或五种选自下组的HVR序列(i)包含X1X2X3X4X5X6VX7X8X9X101TYLX1!的 HVR-L 1，其中 X1 选自 L，Q，R，S，和 T ;X2 选自 P，T，和 W ；X3 为H或S ;X4为D或Q ;X5为G或S ;X6为L或V ;X7为H或P ;X8选自I，L，P，T，和Y ;X9选自N，Q或 S ;X10 选自 A，G，和 S ;且 X11 为 G 或 H (SEQ ID NO :222); (ii)包含 RVSNX1X2S 的 HVR-L2，其中父1为0或1 ;且父2选自六，6，卩，1，和了 (SEQ ID NO :223)包含X1QSX2X3VPLT的
HVR-L3，其中 X1 选自 A，G，I，K，L，N，S，TJPV;X2 为 C 或 T ;且 X3 为 F 或 H( SEQ ID NO :224);(iv)包含 GYX1X2X3DX4YX5N 的 HVR-Hl，其中 X1 为 N 或 T ;X2 为 F 或 V ;X3 选自 I，M，R，和 S ;X4选自 Y，Q，和 K ;且 X5 为 I 或M (SEQ ID NO :225); (v)包含 GDINX1X2X3X4X5X6HX7X8X9XiciX11X12X13的HVR-H2，其中X1选自A，L，N，和P ;X2选自D，L，和R ;X3选自G，K，N，R，S，和Y ;X4为G或S ;父5选自6，1，1(，1 ，5，1'，和￥;父6选自6，1和1'而选自I，V，和Y ;X8为N或S ;X9选自A，N，和 Q ;X1Q 为 K或 V5X11 为 F 或Q5X12S K或 T ;且 X13选自 G，H，RjPS (SEQ ID N0:226)，和(Vi )包含 X1Regvyhx2YDDYAx3DY 的 HVR-H3，其中 X1 选自 A，N，和 T ;X2 为 D 或 P ;且 X3 为 M 或 W(SEQ ID N0:227)。在一些实施方案中，该抗EGFL7抗体包含所有六种上述HVR。在一些实施方案中，HVR-Ll包含选自SEQ ID NO : 100和106-124的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQID NO :101和125-129的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQ ID NO :102和130-145的氨基酸序列，HVR-Hl包含选自SEQ ID NO :103和146-153的氨基酸序列，HVR-H2包含选自SEQID NO :104和154-187的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQID NO :105和188-192的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的 FR-Hl (SEQ ID NO :197);包含 WVRQAPGKGLEWXi 的 FR-H2，其中 X1 为 I 或 V (SEQ ID NO 228);包含 RXJX2SX3DX4SX5X6TX7YX8QMNSLRAEDTAVYYC 的 FR-H3，其中 X1 为 F 或 V ;X2 为 I 或L ;X3选自L，R，和V ;X4为K或N ；X5选自K，N，R，和S ;X6为N或S ；X7选自A，L，和V ;且X8为 L 或 M (SEQ ID NO :229);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。在一些实施方案中，重链包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的FR-Hl (SEQ IDNO :197);包含 WVRQAPGKGLEWV 的 FR-H2 (SEQ ID NO : 198);包含 RFTISRDXjKNTXJLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 为 N 或 K ;且 X2 选自 A，L，和 V (SEQ ID NO :230);和包含WGQGTLVTVSS的FR-H4 (SEQ ID NO :200)。在一些实施方案中，轻链包含下述框架序列包含 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 的 FR-L1(SEQ ID NO :201 )，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2(SEQ ID NO :202)，包含 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO 203),包含 FGQGTKVEIK (SEQ ID NO :221)或 FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO :204)的 FR-L4。在一些实施方案中，轻链包含图27 (SEQ ID NO :193和194)所示18F7. v6或18F7. v6k的可变域序列。在一些实施方案中，重链包含图28 (SEQ ID NO :195和196)所示18F7. v6或18F7v6k的可变域序列。在一些实施方案中，本发明提供一种抗体，其中轻链包含图27(SEQ ID NO:193)所示18F7. v6的可变域序列且重链包含图28 (SEQ ID NO :195)所示18F7. v6的可变 域序列。在一些实施方案中，本发明提供一种抗体，其中轻链包含图27 (SEQ ID NO 194)所示18F7. v6k的可变域序列且重链包含图28 (SEQ ID NO : 196)所示18F7. v6k的可变域序列。在一些实施方案中，本发明提供一种抗体，其中框架序列的至少一部分为人共有框架序列。在一些实施方案中，该抗体包含人κ亚组I共有框架序列。在一些实施方案中，该抗体包含重链人亚组III共有框架序列。在一些实施方案中，本发明提供一种抗EGFL7抗体，其为双特异性抗体。在一些实施方案中，该双特异性抗体结合血管内皮生长因子(VEGF)，例如与bevacizumab或ranibizumab结合相同VEGF表位。在一些实施方案中，本发明提供编码本发明抗体的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含此类核酸的载体。在一些实施方案中，本发明提供包含该核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供包含本发明抗体的组合物。在一些实施方案中，该组合物包含载体。在一些实施方案中，该组合物为药物组合物。在一些实施方案中，本发明提供一种用于制备抗EGFL7抗体的方法，其通过在合适宿主细胞中表达包含编码本发明抗体的核酸的载体并回收该抗体来进行。在一些实施方案中，该宿主细胞是原核的。在一些实施方案中，该宿主细胞是真核的。在一些实施方案中，本发明提供一种用于治疗肿瘤、癌症、或细胞增殖性病症的方法，该方法包括将有效量的本发明抗EGFL7抗体施用于需要此类治疗的个体。在一些实施方案中，本发明提供一种抗EGFL7抗体，其用于治疗肿瘤、癌症、或细胞增殖性病症。在一些实施方案中，该癌症选自下组乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，食管癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝细胞癌。在一些实施方案中，该癌症为乳腺癌、结肠直肠癌或肺癌。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症为癌症。在一些实施方案中，该治疗还包括有效量的第二药物，其中抗EGFL7抗体为第一药物。在一些实施方案中，该第二药物为另一种抗体、化疗剂、细胞毒剂、抗血管发生齐U、免疫抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放疗剂、皮质类固醇、止吐剂、癌症疫苗、止痛剂、或生长抑制剂。在一些实施方案中，该第二药物为抗VEGF抗体，例如bevacizumab。在一些实施方案中，该第二药物在施用抗EGFL7抗体之前或之后施用。在一些实施方案中，该第二药物与抗EGFL7抗体同时施用。在一些实施方案中，本发明提供一种在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中降低或抑制血管发生的方法，包括对受试者施用本发明的抗体，由此在受试者中降低或抑制血管发生。在一些实施方案中，本发明提供本发明的一种抗体，其用于治疗与血管发生有关的病理状况。在一些实施方案中，该病理状况为新生物状况。在一些实施方案中，该病理状况为非新生物状况。在一些实施方案中，该非新生物状况选自下组糖尿病性和其它增殖性视网膜病，早产儿视网膜病，新生血管性青光眼，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，视网膜/脉络膜新血管形成。在一些实施方案中，本发明提供一种在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中增强抗血管发生剂的功效的方法，包括对受试者施用与抗血管发生剂组合的有效量的本·发明抗体，由此增强所述抗血管发生剂的抑制活性。在一些实施方案中，本发明提供本发明的一种抗体，其用于在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中增强抗血管发生剂的功效。在一些实施方案中，该与血管发生有关的病理状况为肿瘤、癌症或细胞增殖性病症。在一些实施方案中，该与血管发生有关的病理状况为非新生物状况。在一些实施方案中，该非新生物状况选自下组糖尿病性和其它增殖性视网膜病，早产儿视网膜病，新生血管性青光目艮，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，视网膜/脉络膜新血管形成。在一些实施方案中，该抗血管发生剂在施用抗EGFL7抗体之前或之后施用。在一些实施方案中，该抗血管发生剂与抗EGFL7抗体同时施用。在一些实施方案中，该抗血管发生剂为抗VEGF剂,抗VEGF抗体,例如bevacizumab或ranibizumab。在一些实施方案中，本发明提供一种在受试者中降低或抑制肿瘤灌注和渗透性的方法，包括对受试者施用本发明的抗体。在一些实施方案中，本发明提供本发明的一种抗体，其用于在受试者中降低或抑制肿瘤灌注和渗透性。在一些实施方案中，该方法或用途进一步包括施用抗血管发生剂，例如抗VEGF剂(例如抗VEGF抗体,诸如bevacizumab)。本发明涉及下述各项。I. 一种抗EGFL7抗体,其包含可变域,该可变域包含至少一种、两种、三种、四种或五种选自下组的高变区(HVR)序列(i )包含 KxiSx2Sx3DYx4GDSYx5S 的 HVR-Ll，其中 X1 为 A 或 R ;X2 为 H 或 Q ;X3 为 G 或V;x4 选自 0，1^，1 ，5，和胃；且父5为]\1或￥ (SEQ ID NO :210);(ii )包含 GASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 SN或Y ;X2选自 L，R 和 Y;且X3 为 Q或S(SEQ ID NO :211)；(iii)包含 QQNNeX1PX2T 的 HVR-L3，其中 X1 为 D 或 E ;且 X2 为 F 或 Y (SEQ ID NO 212)；(iv)包含 GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 X1 为 H 或 V ;X2 为 R 或 T ;X3 选自 F，G，R，和 S ;X4 选自 D，G，R，和 T ;且 X5 为 M 或 Y (SEQ ID NO :213)；(V)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的 HVR-H2，其中 X1 选自 I, M，T，和 W ;X2 为 H或R ;X3选自I，M，T，和Y ;X4为D或H ;X5选自D，M和T ;X6为F或Y ;X7为K或S ;且X8为G或 R (SEQ ID NO :214，和(vi)包含Ax1Lgsx2Avdx3 的HVR-H3，其中 X1 Sn或r;x2选自 C，S，和 Y;且X3为A或 Y (SEQ ID NO :215)。2.项I的抗EGFL7抗体，其包含可变域，该可变域包含下述HVR序列(i )包含 KxiSx2Sx3DYx4GDSYx5S 的 HVR-Ll，其中 X1 为 A 或 R ;X2 为 H 或 Q ;X3 为 G 或V;x4 选自 0，1^，1 ，5，和胃；且父5为]\1或￥ (SEQ ID NO :210);(ii )包含 GASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 SN或Y ;X2选自 L，R 和 Y;且X3 为 Q或S(SEQ ID NO :211)；(iii)包含 QQNNeX1PX2T 的 HVR-L3，其中 X1 为 D 或 E ;且 X2 为 F 或 Y (SEQ ID NO 212)； (iv)包含 GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 X1 为 H 或 V ;X2 为 R 或 T ;X3 选自 F，G，R，和 S ;X4 选自 D，G，R，和 T ;且 X5 为 M 或 Y (SEQ ID NO :213)；(V)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的 HVR-H2，其中 X1 选自 I, M，T，和 W ;X2 为 H或R ;X3选自I，M，T，和Y ;X4为D或H ;X5选自D，M和T ;X6为F或Y ;X7为K或S ;且X8为G或 R (SEQ ID NO :214，和(vi)包含Ax1Lgsx2Avdx3 的HVR-H3，其中 X1 Sn或r;x2选自 C，S，和 Y;且X3为A或 Y (SEQ ID NO :215)。3.项I或2的抗体，其中HVR-Ll包含选自SEQ ID NO 31和37-43的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQ ID NO : 32和44-47的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQ ID NO: 33和48的氨基酸序列，HVR-Hl包含选自SEQ ID NO 34和49-57的氨基酸序列，HVR-H2包含选自SEQ ID NO 35和58-73的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO 36和74-77的氨
基酸序列。4.项1-3任一项的抗体，其中重链包含下述框架序列包含EXiQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-H1，其中 X1 为 I 或 V (SEQ ID NO :216)；包含WVRQAPGKGLEffX1 的 FR-H2，其中 X1 为 I 或 V (SEQID NO :217);包含 RftxiSx2DX3SX4X5TX6YLQMnslraedtavyx7car 的 FR-H3，其中 X1 为 F 或 ι ;x2 为 L 或 r ;x3 为 N 或 t，X4 选自 α，ε，K 和 τ ;X5为N或S;X6选自A，L，M，T和V;且X7为F或Y (SEQ ID NO :218);和包含 WGQGTLVTVSS的 FR-H4 (SEQ ID NO :219)。5.项4的抗体，其中重链包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的 FR-Hl (SEQ ID 勵197);包含叭1^^61 1^驟的？1 -!12 (SEQ ID NO : 198);包含 RFTISX^NSKNTx2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 为 L 或 R ;X2 选自 A，L，M，T 和 V (SEQ IDNO :220);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。6.项4或5的抗体，其中轻链包含下述框架序列包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC的 FR-Ll (SEQ ID NO :201 )，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2 (SEQ ID N0:202)，包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO :203)，包含 FGQGTKVEIK (SEQID NO :221)或 FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO :204)的 FR-L4。7.项I的抗体，其中轻链包含图15 (SEQ ID NO 82)所示4F11. vl7的可变域序列。
8.项I的抗体，其中轻链包含图15 (SEQ ID NO 83)所示4F11. v22的可变域序列。9.项I的抗体，其中重链包含图16 (SEQ ID NO 84)所示4F11. vl7的可变域序列。10.项I的抗体，其中重链包含图16 (SEQ ID NO :85)所示4F1L v22的可变域序列。11.项I的抗体，其中轻链包含图15 (SEQ ID NO :82)所示4F11. vl7的可变域序列且重链包含图16 (SEQ ID NO 84)所示4F11. vl7的可变域序列。12.项I的抗体，其中轻链包含图15 (SEQ ID NO :83)所示4F11. v22的可变域序列且重链包含图16 (SEQ ID NO 85)所示4F11. v22的可变域序列。13.项1-3任一项的抗体，其中框架序列的至少一部分为人共有框架序列。 14.项13的抗体，其包含人κ亚组I共有框架序列。15.项13的抗体，其包含重链人亚组III共有框架序列。16. 一种抗EGFL7抗体,其包含可变域,该可变域包含至少一种、两种、三种、四种或五种选自下组的HVR序列(i)包含 X1X2X3X4X5X6VX7X8X9XiciITYLX11 的 HVR-Ll，其中 X1 选自 L，Q，R，S，和 T ；X2 选自P，T，和W ;X3为H或S ;X4为D或Q ;X5为G或S ;X6为L或V ;X7为H或P ;X8选自I，L，P，T，和 Y ;X9 选自 N，Q 或 S ;X10 选自 A，G，和 S ;且 X11 为 G 或 H (SEQ ID NO :222)；(ii)包含 RVSNX1X2S 的 HVR-L2，其中 X1 为 D 或 R ;且 X2 选自 A，G，F，I，和 T (SEQID NO :223)；(iii)包含 X1QSX2X3VPLT 的 HVR-L3，其中 X1 选自 A，G，I，K，L, N, S，T，和 V ;X2 为 C或 T ;且 X3 为 F 或 H (SEQ ID NO :224)；(iv)包含 GYX1X2X3DX4YX5N 的 HVR-Hl，其中 X1 为 N 或 T ;X2 为 F 或 V ;X3 选自 I，M，R，和 S ;X4 选自 Y，Q，和 K ;且 X5 为 I 或M (SEQ ID NO :225)；(V)包含 GDINX1X2X3X4X5X6HX7X8X9XiciX11X12X13 的 HVR—H2，其中 X1 选自 A, L，N，和 P ；X2选自 D，L，和 R ；X3 选自 G，K，N，R，S，和 Y ;X4 为 G 或 S ;X5 选自 G，I，K，R，S，T，和 V ;X6 选自G，R，和T ;X7选自I，V，和Y ;X8为N或S ；X9选自A，N，和Q ；X10为K或V ；Xn为F或Q ；X12为K 或 T ;且 X13 选自 G，H，RJPS (SEQ ID NO :226);和(vi )包含 X1Regvyhx2YDDYAx3DY 的 HVR-H3，其中 X1 选自 A，N，和 T ;X2 为 D 或 P ;且X3 为 M 或 W (SEQ ID NO :227)。17.项16的抗EGFL7抗体，其包含可变域，该可变域包含下述HVR序列(i)包含 X1X2X3X4X5X6VX7X8X9XiciITYLX11 的 HVR-Ll，其中 X1 选自 L，Q，R，S，和 T ；X2 选自P，T，和W ;X3为H或S ;X4为D或Q ;X5为G或S ;X6为L或V ;X7为H或P ;X8选自I，L，P，T，和 Y ;X9 选自 N，Q 或 S ;X10 选自 A，G，和 S ;且 X11 为 G 或 H (SEQ ID NO :222)；(ii)包含 RVSNX1X2S 的 HVR-L2，其中 X1 为 D 或 R ;且 X2 选自 A，G，F，I，和 T (SEQID NO :223)；(iii)包含 X1QSX2X3VPLT 的 HVR-L3，其中 X1 选自 A，G，I，K，L, N, S，T，和 V ;X2 为 C或 T ;且 X3 为 F 或 H (SEQ ID NO :224)；(iv)包含 GYX1X2X3DX4YX5N 的 HVR-Hl，其中 X1 为 N 或 T ;X2 为 F 或 V ;X3 选自 I，M，R，和 S ;X4 选自 Y，Q，和 K ;且 X5 为 I 或M (SEQ ID NO :225)；(V)包含 GDINX1X2X3X4X5X6HX7X8X9XiciX11X12X13 的 HVR—H2，其中 X1 选自 A, L，N，和 P ；X2选自 D，L，和 R ；X3 选自 G，K，N，R，S，和 Y ;X4 为 G 或 S ;X5 选自 G，I，K，R，S，T，和 V ;X6 选自G，R，和T ;X7选自I，V，和Y ;X8为N或S ；X9选自A，N，和Q ；X10为K或V ；Xn为F或Q ；X12为K 或 T ;且 X13 选自 G，H，RJPS (SEQ ID NO :226);和(vi )包含 X1Regvyhx2YDDYAx3DY 的 HVR-H3，其中 X1 选自 A，N，和 T ;X2 为 D 或 P ;且X3 为 M 或 W (SEQ ID NO :227)。18.项16或17的抗体，其中HVR-Ll包含选自SEQ ID NO :100和106-124的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQ ID NO :101和125-129的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQID NO :102和130-145的氨基酸序列，HVR-Hl包含选自SEQ ID NO :103和146-153的氨基酸序列，HVR-H2包含选自SEQ ID NO :104和154-187的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO :105和188-192的氨基酸序列。·19.项16-18任一项的抗体，其中重链包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-HKSEQ ID NO : 197);包含 WVRQAPGKGLEWXi 的 FR-H2，其中 X1 为 I 或 V (SEQ ID NO :228);包含 RXJX2SX3DX4SX5X6TX7YX8QMNSLRAEDTAVYYC 的 FR-H3，其中X1 SF或V5X2S I或L5X3选自L，R，和V5X4S K或N ;&选自K，N，R，和S ;X6为N或3;父7选自六，1^，和￥;且父8为1^或皿(SEQ ID NO :229);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQID NO 200)o20.项19的抗体，其中重链包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的 FR-Hl (SEQ ID NO :197);包含 WVRQAPGKGLEWV 的 FR-H2 (SEQ ID NO :198);包含 RFTISRDXiSKNTXJLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 为 N 或 K ;且 X2 选自 A，L，和 V (SEQ IDNO :230);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。21.项19或20的抗体，其中轻链包含下述框架序列包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 的 FR-Ll (SEQ ID NO :201 )，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2(SEQ ID NO :202)，包含 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO:203)，包含 FGQGTKVEIK (SEQ ID NO :221)或 FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO :204)的 FR-L4。22.项16的抗体，其中轻链包含图27 (SEQ ID NO :193)所示18F7. v6的可变域序列。23.项16的抗体，其中轻链包含图27 (SEQ ID NO :194)所示18F7. v6k的可变域序列。24.项16的抗体，其中重链包含图28 (SEQ ID NO :195)所示18F7. v6的可变域序列。25.项16的抗体，其中重链包含图28 (SEQ ID NO :196)所示18F7. v6k的可变域序列。26.项16的抗体，其中轻链包含图27 (SEQ ID NO :193)所示18F7. v6的可变域序列且重链包含图28 (SEQ ID NO :195)所示18F7. v6的可变域序列。27.项16的抗体，其中轻链包含图27 (SEQ ID NO :194)所示18F7. v6k的可变域序列且重链包含图28 (SEQ ID NO :196)所示18F7. v6k的可变域序列。28.项16的抗体，其中框架序列的至少一部分为人共有框架序列。
29.项28的抗体，其包含人κ亚组I共有框架序列。30.项28的抗体，其包含重链人亚组III共有框架序列。31.项1-30任一项的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。32.项31的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体结合血管内皮生长因子(VEGF)033.项32的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与bevacizumab或ranibizumab结合相同VEGF表位。34.编码项1-33任一项的抗体的核酸。35.包含项34的核酸的载体。
36.包含项34的核酸或项35的载体的宿主细胞。37.包含项1-33任一项的抗体的组合物。38.项37的组合物，其中该组合物包含载体。39.项37或38的组合物，其为药物组合物。40. 一种用于制备抗EGFL7抗体的方法,所述方法包括(a)在合适宿主细胞中表达项35的载体，并(b)回收该抗体。41.项40的方法，其中该宿主细胞是原核的。42.项40的方法，其中该宿主细胞是真核的。43. 一种用于治疗肿瘤、癌症、或细胞增殖性病症的方法，该方法包括将有效量的项1-33任一项的抗EGFL7抗体施用于需要此类治疗的个体。44.项43的方法，其中该癌症选自下组乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，食管癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝细胞癌。45.项44的方法，其中该癌症为乳腺癌、结肠直肠癌或肺癌。46.项43的方法，其中该细胞增殖性病症为癌症。47.项43-46任一项的方法，进一步包括对个体施用有效量的第二药物，其中抗EGFL7抗体为第一药物。48.项47的方法，其中该第二药物为另一种抗体、化疗剂、细胞毒剂、抗血管发生齐U、免疫抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放疗剂、皮质类固醇、止吐剂、癌症疫苗、止痛剂、或生长抑制剂。49.项48的方法，其中该第二药物为抗VEGF抗体。50.项49的方法,其中该第二药物为bevacizumab。51.项47-50任一项的方法，其中该第二药物在施用抗EGFL7抗体之前或之后施用。52.项47-50任一项的方法，其中该第二药物与抗EGFL7抗体同时施用。53. 一种在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中降低或抑制血管发生的方法，包括对受试者施用项1-33任一项的抗体，由此在受试者中降低或抑制血管发生。54.项53的方法，其中所述病理状况为新生物状况。55.项53的方法，其中所述病理状况为非新生物状况。56.项55的方法，其中所述非新生物状况选自下组糖尿病性和其它增殖性视网膜病，早产儿视网膜病，新生血管性青光眼，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，视网膜/脉络膜新血管形成。57. 一种在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中增强抗血管发生剂的功效的方法，包括对受试者施用与抗血管发生剂组合的有效量的项1-33任一项的抗体，由此增强所述抗血管发生剂的抑制活性。58.项57的方法，其中该与血管发生有关的病理状况为肿瘤、癌症或细胞增殖性病症。59.项57的方法，其中该与血管发生有关的病理状况为非新生物状况。60.项59的方法，其中所述非新生物状况选自下组糖尿病性和其它增殖性视网膜病，早产儿视网膜病，新生血管性青光眼，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，视网膜/脉络膜新血管形成。
61.项57-60任一项的方法，其中所述抗血管发生剂在施用抗EGFL7抗体之前或之后施用。62.项57-60任一项的方法，其中所述抗血管发生剂与抗EGFL7抗体同时施用。63.项57-60任一项的方法，其中所述抗血管发生剂为抗VEGF剂。64.项63的方法，其中所述抗VEGF剂为抗VEGF抗体。65.项64的方法,其中所述抗VEGF抗体为bevacizumab。66.项64的方法,其中所述抗VEGF抗体为ranibizumab。67. 一种在受试者中降低或抑制肿瘤灌注和渗透性的方法，包括对受试者施用项1-33任一项的抗体，由此在受试者中降低或抑制肿瘤灌注和渗透性。68.项67的方法，进一步包括施用抗血管发生剂。69.项68的方法，其中所述抗血管发生剂在施用抗EGFL7抗体之前或之后施用。70.项68的方法，其中所述抗血管发生剂与抗EGFL7抗体同时施用。71.项67-70任一项的方法，其中所述抗血管发生剂为抗VEGF剂。72.项71的方法，其中所述抗VEGF剂为抗VEGF抗体。73.项72的方法,其中所述抗VEGF抗体为bevacizumab。附图简述图I描绘来自小鼠(SEQ ID NO :1)和人(SEQ ID ON :2)的EGFL7的氨基酸序列。标示了 EMI1、EMI2, EGF和卷曲螺旋域的位置。截短的EGFL7缺少卷曲螺旋域。肽EMIl(SEQ ID N0:3)、EMI2 (SEQ ID NO :4)和 p2 (SEQ ID NO :5)、P4 (SEQ ID NO :6)、p5 (SEQID NO :7)、和p6 (SEQ ID NO :8)的序列标有下划线。图2描绘人卡帕I共有(SEQ ID NO 9)和4F11. vl (SEQ ID NO :10)的轻链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号，而且框示了高变区。图3 描绘人亚组 III 共有(SEQ ID NO :11)和 4F11. vl (SEQ ID NO :12)的重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号，而且框示了高变区。图4描绘用于转换框架转换文库中位置的寡核苷酸。显示了 4F11. vl的DNA序列和用于生成框架转换的寡核苷酸。还显示了初始和一些所得框架转换区的氨基酸序列。在一些情况中，基于如何设计简并密码子，还掺入了别的氨基酸残基。序列标识符显示于相应序列右边的括号中(SEQ ID NO 13-28)ο图5描绘结果，证明了 mu4Fll结合EGFL7能被肽2 (SEQ ID NO 5)阻断，但不被交叠肽I或3 (分别为SEQ ID NO 29和30)或随机对照肽阻断。图6描绘展示4F11. vIFab的噬菌体对微量滴定板上固定化的截短的EGFL7的结合。作为渐增噬菌体浓度的函数，4F11. vl噬菌体的两份样品都显示升高的对固定化EGFL7的结合。对照噬菌体显示与4F11. vl噬菌体在低噬菌体浓度的水平相似的背景结合，提示一些非特异性噬菌体-EGFL7相互作用。图7描绘展示4F11. VlFab的噬菌体对EMI2域或p2肽(经由游离氨基或游离硫醇基生物素化的)的结合。图8描绘框架转换期间在每个框架位置处找到的残基的丰度。列出了框架转换期间在每个框架位置处引入的氨基酸。图9 (图9A和9B)描绘在6个“单位置文库”(SPL)每一个中对3种框架每一个观察到的CDR序列变化。文库通过使用的框架分开(4F11. VU4F11. v2和4F11. v3)。相对于特定⑶R序列突显了自每一个SPL获得的变化。这些变化以外的VL和VH序列与相应框·架相同，而且现在显示。序列标识符显示于相应序列右边的括号中(SEQ ID N0:31-77)。出现超过一次的序列个体可能不是总是具有相应的序列标识符。图10描绘有限文库I和2的轻链可变域的框架和文库设计。与用于文库I (SEQID N0:78)和文库2 (SEQ ID NO :79)的模板相比，显示了人卡钼I共有(SEQ ID N0:9)和4Fll.vl (SEQ ID NO : 10)的氨基酸序列。以穿过氨基酸的斜线显示了随机化成所有20种
氨基酸的位置。图11描绘有限文库I和2的重链可变域的框架和文库设计。与用于文库I (SEQID N0:80)和文库2 (SEQ ID NO :81)的模板相比，显示了人亚组III共有(SEQ ID NO 11)和4F11.V1 (SEQ ID NO : 12)的氨基酸序列。以穿过氨基酸的斜线显示了随机化成所有20种氨基酸的位置。图12描绘在有限文库I和2中的随机化位置处观察到的变化频率。显示了轻链中位置53和54及重链中29、52、和98处选择的氨基酸偏爱。对任何氨基酸的偏爱(Sigma)报告为超出假设氨基酸二项式分布时文库中给定残基的随机机会出现的标准偏差数目。通过此方法进行的打分说明了建立共有时预期的密码子偏倚和取样统计学。图13和14描绘在体外人源化4F11变体对HUVEC粘附固定化人或鼠EGFL7的抑制。在渐增浓度的抗体存在下容许HUVEC (20，000个细胞/孔)粘附至用5 μ g/ml人或鼠EGFL7包被的96孔板。对清洗后仍粘附至板的细胞数计数，并作为分配入每个孔的总细胞的百分比来计算。图 15 描绘人卡帕 I 共有(SEQ ID NO 9),4F11. vl(SEQ ID NO :10)、4F11. vl7(SEQID N0:82)JP4F11.v22(SEQ ID NO :83)的轻链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号，而且框示了高变区。图16 描绘人亚组 III 共有(SEQ ID NO :11)、4F11. vl (SEQ ID NO :12)、4F11. vl7(SEQ ID NO :84)、和4F11. v22 (SEQ ID NO :85)的重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号,而且框示了高变区。图17描绘人卡帕I共有(SEQ ID NO :9)和18F7-嫁接(SEQ ID NO :86)的轻链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号，而且框示了高变区。图18 描绘人亚组 III 共有(SEQ ID NO :11)和 18F7-嫁接(SEQ ID NO :87)的重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号，而且框示了高变区。图19描绘用于转换框架转换文库中位置的寡核苷酸。显示了 18F7-嫁接的DNA序列和用于生成框架转换的寡核苷酸。还显示了初始和一些所得框架转换区的氨基酸序列。在一些情况中，基于如何设计简并密码子，还掺入了别的氨基酸残基。序列标识符显示于相应序列右边的括号中(SEQ ID NO 88-99)ο图20描绘描绘结果，证明了结合EGFL7的mul8F7能被EMIl (SEQ ID NO :3)或肽P5 (SEQ ID NO :7)阻断，但不被肽P4或P6 (分别为SEQ ID NO :6和8)阻断。用含有带HA标签的全长人EGFL7 cDNA的质粒转染鸡胚成纤维细胞。在200倍过量的竞争性肽存在下用mul8F7免疫沉淀自经转染细胞制备的细胞溶胞物。使用抗HA抗体通过Western印迹分析免疫沉淀物。图21描绘展示18F7-嫁接Fab的噬菌体对微量滴定板上固定化的截短的huEGFL7的结合。作为渐增噬菌体浓度的函数，18F7-嫁接噬菌体的两份样品都显示升高的对固定化 EGFL7的结合。对照噬菌体显示与18F7-嫁接噬菌体在低噬菌体浓度的水平相似的背景结合，提示一些非特异性噬菌体-EGFL7相互作用。图22描绘展示18F7-嫁接Fab对EMIl域或p5肽(经由游离氨基或游离硫醇基生物素化的)的结合。图23描绘框架转换期间在每个框架位置处找到的残基的丰度。列出了框架转换期间在每个框架位置处引入的氨基酸。图24 (图24A和24B)描绘在6个SPL每一个中对3段框架每一个观察到的⑶R序列变化。文库通过使用的框架分开(18F7-嫁接、18F7-K、18F7-KV、和18F7-KA)。相对于特定⑶R序列突显了自每一个SPL获得的变化。这些变化以外的VL和VH序列与相应框架相同，而且现在显示。序列标识符显示于相应序列右边的括号中(SEQ ID N0100-192)o出现超过一次的序列个体可能不是总是具有相应的序列标识符。图25描绘在体外人源化18F7变体对HUVEC粘附固定化人或小鼠EGFL7的抑制。在渐增浓度的抗体存在下容许HUVEC(20，000个细胞/孔)粘附至用5 μ g/ml人或鼠EGFL7包被的96孔板。对清洗后仍粘附至板的细胞数计数，并作为分配入每个孔的总细胞的百分比来计算。图26描绘对HUVEC跨孔迁移的抑制。将HUVEC (50，000个细胞每孔)在跨孔板的上槽中培养16小时，并用5 μ g/ml重组人EGFL7蛋白包被上槽中的膜。将各种浓度的对照抗体(抗IgE)或不同18F7变体添加至上和下槽中的培养基，而在下孔中添加20ng/ml重组人VEGF-165以刺激HUVEC迁移。对迁移至上槽下侧的细胞计数，并相对于处理(抗体和浓度)绘图。图27 描绘人卡帕 I 共有(SEQ ID NO :9)、18F7. v6(SEQ ID NO :193)、和 18F7. v6k(SEQ ID NO :194)的轻链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号，而且框示了高变区。在没有显示18F7. v6k的序列的情况中(比对的第二和第三部分中)，相应序列与18F7.v6的序列相同。图28 描绘人亚组 III 共有(SEQ ID NO :11)、18F7. v6(SEQ ID NO :195)、和 18F7.v6k (SEQ ID NO :196)的重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号，而且框示了高变区。在没有显示18F7. v6k的序列的情况中(比对的第一和第三部分中)，相应序列与18F7. v6的序列相同。图29描绘单独地或与抗VEGF抗体组合地使用hul8F7. v6k对H1299异种移植物肿瘤生长的抑制。图30描绘单独地和与抗VEGF抗体组合地使用hul8F7. v6k对LXFL 1674异种移植物肿瘤生长的抑制。图31描绘单独地和与抗VEGF抗体组合地使用hul8F7. v6k对新生儿气管血管化的抑制。发明详述本发明提供抗EGFL7抗体的方法、组合物、试剂盒和制品。本文中提供这些方法、组合物、试剂盒和制品的详情。 通用技术本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的方法SambiOOket al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y ;CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F. M. Ausubel, et al. eds. , (2003))；丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY(AcademicPress, Inc.) : PCR2:A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Tayloreds. (1995)) ；Harlow and Lane, eds. (1988)ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL ;及 ANIMALCELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))。定义“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(I)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。术语“抗EGFL7抗体”或“结合EGFL7的抗体”指能够以足够亲和力结合EGFL7，使得该抗体可用作靶向EGFL7的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，结合EGFL7的抗体具有彡I μ M、彡ΙΟΟηΜ、彡10nM、彡InM、或彡0. InM的解离常数(Kd)。“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间I:I相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下， 用最小浓度的125I标记抗原平衡，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen，et al.，(1999)J.Mol Biol 293:865-881)。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5 μ g/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23° C)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将IOOpM或26pM[125I]_抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与Presta et al. , (1997)CancerRes. 57:4593-4599中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间(例如65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如I小时)。然后除去溶液，并用含O. l%Tween -20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150 μ I/孔闪烁液(MicroScint _20; Packard),然后在TopCount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ)在 25° C 使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’ - (3- 二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸钠pH 4. 8将抗原稀释至5 μ g/ml (约O. 2 μ Μ),然后以5 μ I/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25° C以约25 μ I/分钟的流速注入在含O. 05%Tween -20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(O. 78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore EvaluationSoftware version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(km)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率I^ffZXn计算。参见例如Chen，Y.，et al. , (1999) J. Mol.Biol. 293:865-881。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10 -^那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(astop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25° C的荧光发射强度(激发=295nm ;发射=340nm, 16nm带通)的升高或降低。术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”或“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有 烧化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换,用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体和半固体支持物。5’和3’末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2’ -氧-甲基、2’ _氧-烯丙基、2’ -氟-或2’ -叠氮-核糖，碳环糖类似物，α -端基异构糖,差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、批喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S (“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S (“二硫代酸酯” (dithioate) )、(O)NR2 (“酰胺酯” (amidate) )、P (0) R、P (0) OR’、CO 或 CH2(“甲缩醛” (formacetal))替代，其中R或R’各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1_20个C)，任选含有醚(-0-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和 DNA。“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。术语“EGFL7”(可互换地称为“EGF 样域，多种 7 (EGF-like-domain multiple
7)”)，在用于本文时，除非另有明确说明或者上下文另有说明，指任何天然的或变异的(无论是天然的或合成的)EGFL7多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。术语“野生型EGFL7” 一般指包含天然存在EGFL7蛋白的氨基酸序列的多肽。术语“野生型EGFL7序列” 一般指在天然存在EGFL7中发现的氨基酸序列。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区或高变区(CDR或HVR，在本文中可互换使用)的三个区段。可变域中较保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR —起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al. , Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版，National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的(细胞)毒性中抗体的参与。·用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F (ab’)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三个HVR相互作用而在Vh-' 二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个HVR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CHl)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab' )2抗体片段最初是作为在Fab’片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab’片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Y和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab' )2和？￥片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fe区的抗体片段，保留通常与Fe区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fe序列相连。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR :三个在VH中(HI、H2、H3)，三个在VL中(LI、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.,Immunityl3:37-45 (2000);Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed. , HumanPress, Totowa, NJ, 2003)。事实上,仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如 Hamers-Casterman et al. , Nature363:446-448 (1993) ; Sheriff et al. , Nature Struct. Biol. 3:733-736(1996)。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(OTR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol·Biol. 196:901-917(1987)) o AbM HVR 代表 Kabat HVR 与 Chothia 结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触(contact) TVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
权利要求
1.一种抗EGFL7抗体，其包含可变域，该可变域包含下述高变区(HVR)序列(i )包含 KxiSx2Sx3DYx4GDSYx5S 的 HVR-Ll，其中 X1 为 A 或 R ;X2 为 H 或 Q ;X3 为 G 或 V ;X4 选自 0，1^，1 ，5，和胃；且父5为]\1或￥ (SEQ ID NO :210)；(ii)包含GASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 为 N 或 Y ;X2 选自 L，R 和 Y ;且 X3 为 Q 或 S(SEQID NO 211)；(iii)包含QQNNeX1PX2T 的 HVR-L3，其中 X1 为 D 或 E ;且 X2 为 F 或 Y (SEQ ID NO :212);(iv)包含GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 X1 为 H 或 V ;X2 为 R 或 T ;X3 选自 F，G，R，和S;X4 选自 0，6，1 ，和1';且父5为]\1或￥ (SEQ ID NO :213)；(V)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的 HVR-H2，其中 X1 选自 I，M，T，和 W ;X2 为 H 或 R ;X3选自I，M，T，和Y ;X4为D或H ;X5选自D，M和T ;X6为F或Y ;X7为K或S ;且X8为G或R(SEQ ID NO :214)，和(Vi )包含 AxiLGSx2AVDx3 的 HVR-H3，其中 X1 为 N 或 R ;X2 选自 C，R，H，和 Y ;且 X3 为 A 或Y (SEQ ID NO :215)。
2.权利要求I的抗体，其中HVR-Ll包含氨基酸序列KASQSVDYS⑶SYMS(SEQ IDNO: 234)，HVR-L2 包含氨基酸序列 GASYRES (SEQ ID NO: 235)，HVR-L3 包含氨基酸序列 QQNNEEPYT (SEQ ID NO: 236)，HVR-Hl 包含氨基酸序列 GHTFTTYGMS (SEQ ID NO: 34)，HVR-H2包含氨基酸序列GWINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 35)，且HVR-H3包含氨基酸序列ARLGSYAVDY(SEQ ID NO:237)。
3.一种抗EGFL7抗体，其包含下述HVR序列包含选自SEQ ID NO :37-43的氨基酸序列的HVR-Ll，包含选自SEQ ID NO 44-47的氨基酸序列的HVR-L2，包含SEQ ID NO 48的氨基酸序列的HVR-L3，包含选自SEQ ID NO :49-57的氨基酸序列的HVR-Hl，包含选自SEQ IDNO 58-73的氨基酸序列的HVR-H2，和包含选自SEQ ID NO :74-77的氨基酸序列的HVR-H3。
4.权利要求1-3任一项的抗体，其中重链包含下述框架序列包含EXiQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-H1，其中 X1 为 I 或 V (SEQ ID NO :216)；包含WVRQAPGKGLEffX1 的 FR-H2，其中 X1 为 I、M 或 V (SEQ ID NO :217);包含 RfTX1SX2DX3SX4X5TX6YLQMNSLRAEDTAVYX7CAR 的 FR-H3，其中 X1 为 F 或 I ;X2 为 L 或 R ;X3 为 N 或 T，X4 选自 A，E，K 和T ;X5 为 N 或 S ;X6 选自 A，L，M，T 和 V ;且 X7 为 F 或 Y(SEQ ID NO :218);和包含 WGQGTLVTVSS的 FR-H4 (SEQ ID NO :219)。
5.权利要求4的抗体，其中重链包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的 FR-Hl (SEQ ID 勵197);包含叭1^^61 1^驟的？1 -!12 (SEQ ID NO : 198);包含 RFTISX^NSKNTx2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 为 L 或 R ;X2 选自 A，L，M，T 和 V (SEQ IDNO :220);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。
6.权利要求4的抗体，其中重链包含下述框架序列FR-H1包含EIQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:238) ；FR-H2 包含 WVRQAPGKGLEmKSEQ IDNO: 239) ；FR-H3 包含 RFTISXfNSKSTXJLQMNSLRAEDTAVYFCAR，其中 X1 为 L 或 R ;X2 选自 A、L、M、I^PV(SEQ ID NO:240);且 FR-H4 包含 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 219)。
7.权利要求I的抗体，其中轻链包含选自下组的可变域序列(a)图15(SEQ ID NO82)所示4F11. vl7的可变域序列；和(b)图15 (SEQ ID NO 83)所示4F11. v22的可变域序列。
8.权利要求I的抗体，其中重链包含选自下组的可变域序列(a)图16(SEQ ID NO84)所示4F11. vl7的可变域序列；和(b)图16 (SEQ ID NO 85)所示4F11. v22的可变域序列。
9.权利要求I的抗体，其选自下组(a)—种抗体，其中轻链包含图15(SEQ ID NO :82)所示4F11. vl7的可变域序列且重链包含图16 (SEQ ID NO :84)所示4F11. vl7的可变域序列；和(b) 一种抗体，其中轻链包含图15SEQ ID NO :83)所示4F11. v22的可变域序列且重链包含图16 (SEQ ID NO 85)所示4F11. v22的可变域序列。
10.一种抗EGFL7抗体，其包含可变域，该可变域包含下述HVR序列⑴包含 X1X2X3X4X5X6VX7X8X9X10ITYLX11 的 HVR-Ll，其中 X1 选自 L，Q，R，S，和 T ;X2 选自 P，T，和W ;X3为H或S ;X4为D或Q ;X5为G或S ;X6为L或V ;X7为H或P ;X8选自I，L，P，T，和Y;X9选自10或3;父1(|选自六，6，和3;且父11为6或!1 (SEQ ID NO :222); (ii)包含RVSNX1X2S 的 HVR-L2，其中父1为0或1 ;且父2选自 A，G，F，I，和 T (SEQ IDNO :223)；(iii)包含X1QSX2X3VPLT 的 HVR-L3，其中 X1 选自 A，G，I，K，L，N，T，和 V ;X2 为 C 或 T ;且 X3 为 F 或 H (SEQ ID NO :224)；(iv)包含GYX1X2X3DX4YX5N 的 HVR-Hl，其中 X1 为 N 或 T ;X2 为 F 或 V ;X3 选自 I，M，R，和S;X4 选自 Y，Q，和 K;且父5为 I 或M (SEQ ID NO :225)；(V)包含 GDINX1X2X3X4X5X6HX7X8X9XiciX11X12X13 的 HVR-H2，其中 X1 选自 A，L，N，和 P ;X2 选自0，1^，和1 ;父3选自 G，K，N，13，和丫；父4为6或5;父5选自 G，I，K，R，S，T，和 V ;X6 选自 G，R，和T ;X7选自I，V，L，和Y ;X8为N或S ；X9选自A，N，和Q ；X10为K或V ；Xn为F或Q ；X12为K或 T ;且 X13 选自 G，H，R，和 S (SEQ ID NO :226);和(Vi )包含 X1Regvyhx2YDDYAx3DY 的 HVR-H3，其中 X1 选自 A，N，和 T ;X2 为 D 或 P ;且 X3 为M 或 W (SEQ ID NO :227)。
11.一种抗EGFL7抗体，其包含下述高变区(HVR)序列包含选自SEQ ID NO =106-124的氨基酸序列的HVR-Ll，包含选自SEQ ID NO : 125-129的氨基酸序列的HVR-L2，包含选自SEQ ID NO :130-145的氨基酸序列的HVR-L3，包含选自SEQ ID NO : 146-153的氨基酸序列的HVR-H1，包含选自SEQ ID NO =154-187的氨基酸序列的HVR-H2，和包含选自SEQ ID NO 188-192的氨基酸序列的HVR-H3。
12.权利要求10的抗体，其中HVR-Ll包含氨基酸序列RTSQSLVHINAITYLH(SEQIDNO:241)，HVR-L2包含氨基酸序列RVSNRFS(SEQ ID NO: 101)，HVR-L3包含氨基酸序列GQSTHVPLT(SEQ ID NO: 131)，HVR-Hl 包含氨基酸序列 GYTFIDYYMN(SEQ ID NO: 103)，HVR-H2包含氨基酸序列⑶INLDNSGTHYNQKFKG (SEQ ID NO: 242)，且HVR-H3包含氨基酸序列AREGVYHDYDDYAMDY(SEQ ID NO:105)。
13.权利要求10-12任一项的抗体，其中重链包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR_H1(SEQ ID NO : 197);包含 WVRQAPGKGLEWXi 的 FR-H2，其中 X1 为 I 或 V (SEQ ID NO :228);包含 RXJX2SX3DX4SX5X6TX7YX8QMNSLRAEDTAVYYC 的 FR-H3，其中X1 SF或V5X2S I或L5X3选自L，R，和V5X4S K或N ;&选自K，N，R，和S ;X6为N或3;父7选自六，1^，和￥;且父8为1^或皿(SEQ ID NO :229);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQID NO 200)o
14.权利要求13的抗体，其中重链包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-Hl (SEQ ID NO :197);包含 WVRQAPGKGLEWV 的 FR-H2(SEQ ID NO 198);包含 RFTISRDX1SKNTX2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 为 N 或 K ;且 X2 选自 A，LJPV (SEQ ID NO :230);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。
15.权利要求4、5、6、13或14的抗体，其中轻链包含下述框架序列包含DIQMTQSPSSLSASVOTRVTITC 的 FR-Ll (SEQ ID NO :201 )，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2(SEQ ID NO :202)，包含 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO 203),包含 FGQGTKVEIK (SEQ ID NO :221)或 FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO :204)的 FR-L4。
16.权利要求10的抗体，其中轻链包含选自下组的可变域序列(a)图27(SEQID NO 193)所示18F7. v6的可变域序列；和(b)图27 (SEQ ID NO :194)所示18F7. v6k的可变域序列。
17.权利要求10的抗体，其中重链包含选自下组的可变域序列(a)图28(SEQID NO 195)所示18F7. v6的可变域序列；和(b)图28 (SEQ ID NO :196)所示18F7. v6k的可变域序列。
18.权利要求10的抗体，其选自下组(a)—种抗体，其中轻链包含图27 (SEQ ID NO 193)所示18F7. v6的可变域序列且重链包含图28 (SEQ ID NO :195)所示18F7. v6的可变域序列；和(b) —种抗体，其中轻链包含图27SEQ ID NO :194)所示18F7. v6k的可变域序列且重链包含图28 (SEQ ID NO :196)所示18F7. v6k的可变域序列。
19.权利要求1-3或10-12任一项的抗体，其中框架序列的至少一部分为人共有框架序列。
20.权利要求19的抗体，其选自下组(a)—种抗体，其包含人K亚组I共有框架序列；和(b) —种抗体，其包含重链人亚组III共有框架序列。
21.权利要求1-20任一项的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。
22.权利要求21的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体结合血管内皮生长因子(VEGF)0
23.权利要求22的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与bevacizumab或ranibizumab结合相同VEGF表位。
24.编码权利要求1-23任一项的抗体的核酸。
25.包含权利要求24的核酸的载体。
26.包含权利要求24的核酸或权利要求25的载体的宿主细胞。
27.包含权利要求1-23任一项的抗体的组合物。
28.权利要求27的组合物，其中该组合物包含载体。
29.权利要求27或28的组合物，其为药物组合物。
30.一种用于制备抗EGFL7抗体的方法,所述方法包括(a)在合适宿主细胞中表达权利要求25的载体，并(b)回收该抗体。
31.权利要求30的方法，其中该宿主细胞选自下组原核宿主细胞和真核宿主细胞。
32.权利要求1-23任一项的抗EGFL7抗体在制备药物中的用途，该药物用于在需要此类治疗的个体中治疗肿瘤、癌症、或细胞增殖性病症。
33.权利要求32的用途，其中该癌症选自下组乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，食管癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝细胞癌。
34.权利要求32的用途，其中该细胞增殖性病症为癌症。
35.权利要求32-34任一项的用途，其中对个体施用有效量的第二药物，其中抗EGFL7抗体为第一药物。
36.权利要求35的用途，其中该第二药物为另一种抗体、化疗剂、细胞毒剂、抗血管发生剂、免疫抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放疗剂、皮质类固醇、止吐剂、癌症疫苗、止痛剂、或生长抑制剂。
37.权利要求36的用途，其中该第二药物为抗VEGF抗体。
38.权利要求37的用途,其中该第二药物为bevacizumab。
39.权利要求35-38任一项的用途，其中该第二药物在施用抗EGFL7抗体之前或之后或与抗EGFL7抗体同时施用。
40.权利要求1-23任一项的抗体在制备药物中的用途，该药物用于在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中降低或抑制血管发生。
41.权利要求40的用途，其中所述病理状况选自下组新生物状况和非新生物状况。
42.权利要求41的用途，其中所述非新生物状况选自下组糖尿病性和其它增殖性视网膜病，早产儿视网膜病，新生血管性青光眼，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，视网膜/脉络膜新血管形成。
43.权利要求1-23任一项的抗体在制备药物中的用途，该药物用于在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中增强抗血管发生剂的功效，其中与抗血管发生剂组合施用所述抗体，由此增强所述抗血管发生剂的抑制活性。
44.权利要求43的用途，其中该与血管发生有关的病理状况选自下组(a)肿瘤、癌症或细胞增殖性病症；和(b)非新生物状况。
45.权利要求44的用途，其中所述非新生物状况选自下组糖尿病性和其它增殖性视网膜病，早产儿视网膜病，新生血管性青光眼，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，视网膜/脉络膜新血管形成。
46.权利要求1-23任一项的抗体在制备药物中的用途，该药物用于在受试者中降低或抑制肿瘤灌注和渗透性。
47.权利要求46的用途，其中与抗血管发生剂一起施用所述抗体。
48.权利要求43-45或47任一项的用途，其中所述抗血管发生剂在施用抗EGFL7抗体之前或之后或与抗EGFL7抗体同时施用。
49.权利要求43-45、47或48任一项的用途，其中所述抗血管发生剂为抗VEGF剂。
50.权利要求49的用途，其中所述抗VEGF剂为抗VEGF抗体。
51.权利要求50的用途，其中所述抗VEGF抗体选自下组bevacizumab和ranibizumabο
全文摘要
本发明关注针对EGFL7的抗体及其用途。本发明关注人源化抗EGFL7抗体及其使用方法。
文档编号A61K39/395GK102875677SQ20121036698
公开日2013年1月16日 申请日期2010年5月7日 优先权日2009年5月8日
发明者叶伟兰, M.丹尼斯, J.弗雷德里克森 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司