抗人cd34人源化抗体、其制备方法及用途的制作方法

专利名称：：抗人cd34人源化抗体、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明公开了一种抗体、其制备方法及用途。
背景技术：
：在某些恶性血液病及实体瘤的临床治疗上，造血干/袓细胞(hematopoieticstem/progenitorcells,HSC)移植已经成为目前公认的唯一有效的治疗方法。但因移植物中含有大量T淋巴细胞致使移植后发生急性、重度移植物抗宿主病(graft-versus-hostdiseaseGVHD)是影响异基因造血干细胞移植能否获长期生存的主要原因之一。造血干/祖细胞移植面临的首要问题是如何获得大量纯化的造血干细胞，以去除杂质细胞对移植的干扰，因此，清除或富集移植物中特定的细胞是当前移植领域所关注的问题。由于HSC没有明确的形态学特征，主要表现为淋巴细胞样的单个核母细胞，所以只能以细胞表面的一些蛋白来鉴定。CD34是一个分子量约110Kd的穿膜糖蛋白，是目前所能认识的表达在人类HSC上最早期也是最广泛的抗原，是衡量HSC质与量的较好的标志，随着基于CD34抗体的阳性选择技术的发展，CD34+造血干细胞无论是在实验性动物还是在人身上都显示出重建造血的功能[AndrewsRG，BryantEM，BartelmezSH，Muirhead3DT，KnitterGH，BensingerW，StrongDM，BernstienID(1992)CD34+marrowcells,devoidofTandBLymphocytes,reconstitutestablelymphopoiesisandmyelopoiesisinlethallyirradiatedbaboons.Blood80:1693][ShpallEJ，JonesRB，FranklinW，BearmanS，StemmerS，HamiL，PetscheD，TaffsS，MyersS，PurdyM，HeimfeldS，HalliganJ，BerensonRJ(1994)TransplantationofautologousCD34+hematopoieticprogenitorcellsintobreastcancerpatientfollowinghigh-dosechemotherapy.JClinOncol12:28]，因此它们以其独特的生物学特性与功能正成为造血干细胞移植最理想的靶细胞。目前，应用于细胞分离纯化主要采用贴壁法、差速离心、非连续性密度梯度法等手段。虽然这些技术解决了不少实际问题，但由于操作周期长、细胞回收率低、分离纯化成本高，阻碍了细胞生物学的发展以及细胞生物治疗技术产品的开发和应用。免疫磁珠分选细胞技术是近年来发展起来的一项新的细胞分离技术，具有简便易行、分离纯度高、保留细胞活性等优点，可用于分离和检测各种骨髓及血细胞、肿瘤细胞、细菌及其他微生物等，日益受到生物医学领域科研工作者的青睐。近几年，免疫磁珠逐步朝着亚微米尺寸方向发展，以使得磁珠能够在低梯度磁场下简便快速分离细胞，又在实施分离后无需将磁珠从细胞表面解离而直接进行后续分析与应用，且磁珠对分离后的细胞活性没有影响。其分离原理为运用抗体特异性亲和作用原理，以磁性纳米颗粒作为载体将抗体偶联在其表面，磁性纳米颗粒上抗体与待分选细胞特异性表面抗原结合，形成细胞-抗体-磁性纳米颗粒复合物，在外加磁场的定向控制下，通过亲和吸附、清洗和解吸等操作，可以一步从原始细胞混合液中直接分离出靶细胞。纳米磁性细胞亲和分离具有磁性分离的简单方便和亲和分离的高选择性双重优势。随着免疫磁珠的问世，通过CD34单克隆抗体偶联磁性纳米微球制备相应的免疫磁珠来分选骨髓造血干细胞已经应用于临床造血干细胞移植，由于用其分选细胞具有操作简便、分离迅速完全、细胞纯度高等优点，已成为某些恶性血液病、重症免疫缺陷和肿瘤放化疗所至的造血功能低下等疾病的首选疗法。在造血干细胞分选的过程中，这些抗体将不可避免地伴随着造血干细胞进入人体。杂交瘤技术生产的鼠源单克隆抗体进入人体后可能引起人抗鼠抗体免疫应答humanantimouseantibodyresponse(HAMA)[WinterG，HarrisWJ.Humanizedantibodies.ImmunolToday.1993Jun;14(6):243-6]。因此，如何通过基因工程技术来构建抗降低鼠源抗体的免疫原性的抗体，有效地减少HAMA反应的发生率是本领域的技术人员急于解决的问题。人源化抗体是为了克服鼠源单抗在临床应用中的缺陷而发展起来的新型基因工程抗体。第一代人源化抗体是将鼠单抗的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体，由于抗体的抗原亲和力是由其可变区决定的，因此嵌合抗体的亲和力保持得很好，同时免疫原性也得到了一定程度的降低。抗体的可变区是由超变区(CDR)区和框架区(FR)区组成的，CDR是高度可变的区域，直接介导抗体与抗原的结合。FR区相对保守，作为支架维持着CDR区的空间位置，它是可变区中产生免疫原性的主要区域。由于嵌合抗体上还保留着鼠可变区，临床应用时仍常常会有强烈的HAMA反应。因此，为了尽可能降低嵌合抗体的免疫原性，人们考虑将鼠CDR区直接移植到人源抗体可变区中的FR区上，得到CDR移植抗体，也就是人源化抗体。但是，单纯的CDR移植往往降低甚至丧失原抗体的亲和力，这是因为FR区不仅提供了CDR的空间构象环境，有时还直接参与抗原抗体的相互结合，只有将FR中某些重要残基回复突变成鼠源残基才能恢复抗体的活性。因此，如佝确定FR中影响抗体活性的重要残基成为了抗体人源化的关键。
发明内容本发明的发明人进行了大量的实验，在申请人于2007年12月13曰申请的发明专利申请号为200710094456.9，发明名称为《抗人CD34抗体、其制备方法及用途》的基础上对抗体CD34的小鼠单抗4C8进行了人源化改型设计，成功构建了抗CD34人源化抗体h4C8。具体地，本发明公开了一种人源化抗CD34抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQIDN0:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDN0:8所示，恒定区为人抗体恒定区。本发明还公开了一种编码上述人源化抗CD34抗体的核苷酸序列，更具体地，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQIDN0:5所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDN0:7所示。本发明还公开了含有上述核苷酸序列表达载体，为pc腿3.1/ZE0(+)和pc廳3.1(+)。本发明还公开了被上述表达载体转化的宿主细胞为CH0细胞。本发明进一步公开了上述抗CD34的人源化抗体的制备方法，包括通过计算机辅助设计出人源化抗体h4C8的氨基酸序列，全基因合成h4C8的重链和轻链可变区基因并经基因重组分别与人抗体重、轻链恒定区基因拼接，克隆到真核表达载体中，分别构建人源化抗体的轻、重链表达载体，然后将轻、重链表达载体用脂质体法共转染CHO细胞，然后进行筛选、培养纯化即得。本发明的发明人还利用得到的抗体进行了一系列实验，体外抗原结合活性测定结果表明h4C8都能很好地与高表达CD34的人髓性白血病细胞KG-la特异性结合。竞争抑制实验结果表明h4C8保留了原鼠源抗体的亲和力和特异性，可以将它与磁性纳米材料偶联，制备免疫磁珠，来分选骨髓造血干细胞，能有效地减少HAMA的发生率，提高临床造血干细胞移植的安全性，用于某些恶性血液病及实体瘤的治疗。发明人采用碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚氨(EDC/NHS)方法活化磁珠表面羧基，活化的羧基再与抗体上氨基进行反应，偶联CD34抗体，制备可高效分离细胞的CD34+免疫磁珠。利用CD34+的KG-la细胞与CD34-的Raji细胞制备分选模型，CD34单抗免疫磁珠分选CD34+的细胞。还利用CD34+的免疫磁性纳米颗粒分选分离骨髓血造血干细胞，并对分选获得细胞的纯度、得率进行检测分析。将抗CD34单克隆抗体结合在磁性纳米颗粒上，这种作为抗体载体的磁性纳米颗粒与CD34+造血干/祖细胞结合后，形成免疫复合物。在外加磁场的作用下，复合物发生力学移动，将与磁性纳米颗粒上抗体特异性结合的造血干/祖细胞与其它细胞(不表达CD34抗原的肿瘤细胞)分离，将净化后的造血干细胞回输患者，重建造血及免疫系统，并有效减少肿瘤复发。图1.4C8单克隆抗体的分子模拟结构示意图FR区残基用浅灰色条带表示，CDR区残基用深灰色条带表示，9个位于CDR区周围5A距离内的FR区残基用浅灰色球棒状表示。图2.人源化抗体h4C8的重链(图2-l)和轻链(图2-2)氨基酸序列与相关序列的比对图，其中4C8VH禾B4C8VL分别表示鼠源单克隆抗体4C8的重链和轻链的可变区；选择人抗体AAC18206的重链可变区和人抗体BAC01734的轻链可变区分别作为人源化抗体hu4C8重链和轻链的框架区；hu4C8VHa和hu4C8VHb表示不同的人源化抗体重链可变区，h4C8VLa和h4C8VLb分别表示不同的人源化抗体轻链可变区；破折号表示与人抗体AAC18206或BAC01734对应残基相同的氨基酸，括弧里表示的是CDR区；氨基酸的按照Kabat的编号方式进行编号[E.A.Kabat，T.T.Wu，H.M.Perry,K.S.Gottesman，C.Foeller，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,Fifthed.，UnitedStatesDepartmentofHealthandHumanServices,BethesdaMD,1991.]。图3.4C8的人源化抗体的抗原结合活性实验结果。图4.竞争抑制实验结果。图5:CD34免疫磁珠分选CD34+细胞系实验结果前方的图为分选前混合细胞，左侧的峰为CD34-的Raji细胞，右侧的峰为CD34+的KG-la细胞；后方的图为分选后的阳性细胞群，CD34-的Raji细胞已被去除，CD34+的细胞得到有效的富集。图6:CD34免疫磁珠分选人脐带血造血干细胞实验结果前方的图为分选前脐带血单个核细胞，左侧的峰为CD34-的细胞群，右侧的峰为CD34+的细胞群；后方的图为分选后的阳性细胞群，CD34-的细胞已被去除，CD34+的干细胞得到有效的富集。具体实施例方式以下实施例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。KG-la(人白血病细胞，ATCC，CCL-246.1)Raji(人B淋巴瘤细胞，ATCC，CCL-86)在本发明中，如果没有特别说明，4C8均指按本发明的申请人于2007年12月13日申请的发明专利申请号为200710094456.9，发明名称为《抗人CD34抗体、其制备方法及用途》中公开的方法中得到的4C8。实施例l.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(工nvitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell,1980，22:197-207)和文献(NucleicAcidsResearch,1982，10:4071-4079)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQIDN0:1和SEQIDN0:2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDNO:3和SEQIDN0:4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。实施例2.鼠源4C8单抗可变区(Fv)三维结构的同源模建利用Accelrys公司的InsightII程序包来模拟4C8鼠源单抗可变区的三维结构。首先，用BLAST程序在蛋白质结构数据库(ProteinDataBank，PDB)中分别搜索4C8重链和轻链可变区蛋白的模板蛋白。我们选取同源性最高的抗体1A4J作为4C8的模建模板，利用InsightII程序模建出4C8的三维结构，如图1所示。实施例3.4C8人源化抗体的设计与构建用BLAST程序在Genbank数据库中分别搜索与4C8轻链和重链可变区的最相似人源模板。与4C8重链可变区同源性最高的人源抗体是humanantibodyAAC18206抗体(GenBankNo.AAC18206)，相似度为68%，与4C8轻链可变区同源性最高的人源抗体是BAC01734(GenBankNo.BAC01734)，相似度为80%。因此，我们分别采用AAC18206和10BAC01734作为4C8重链和轻链人源化的模板。首先将4C8的重链和轻链CDR区分别直接移植到人源模板AAC18206和BAC01734上，构成CDR移植抗体，重链为h4C8Ha，轻链为h4C8La。h4C8Ha和h4C8La的可变区氨基酸序列如图2所示。全基因合成人源化抗体重、轻链可变区基因(h4C8VHa和h4C8VLa)，然后以h4C8VHa基因和pGEM-T/CH载体为模板通过重叠PCR合成人源化抗体重链基因，反应条件为95°C15分钟；94°C50秒，58。C50秒，72°C50秒，30个循环；72°C10分钟。并使此人源化重链基因的5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoRl。信号肽基因序列见SEQIDNO:CCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEMT载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoRl酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体重链片段h4C8VHaCH，与用HindIII和EcoRI酶切的质粒pcDNA3.1(+)(美国Invitrogen公司产品)进行连接，构建成人源化重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(h4C8VHaCH)。以h4C8VLa基因和pGEM-T/CL载体为模板通过重叠PCR合成人源化抗体轻链基因，反应条件为95°C15分钟；94°C50秒，58°C50秒，72°C50秒，30个循环；72°C10分钟，得到PCR产物h4C8VLaCL，其5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoRI。信号肽基因序列见SEQIDNO:CCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoRl酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体轻链片段h4C8VLaCL，与用HindIII和EcoRl酶切的质粒pcDNA3.1/ZEO(+)载体(美国Invitrogen公司产品)进行连接，构建成人源化轻链真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(h4C8VLaCL)。于24孔组织培养板中接种0.8XIOV孔的COS-1细胞(ATCCCRL1650)，用腦FCS的RPMI1640/DMEM混合培养基(16/DM培养基)培养至90_95%融合度时进行转染取质粒1ixg(轻链表达载体0.6pg;重链表达载体0.4|jg)和2|ilLipofectamine2000Reagent分别溶于50|^1无血清16/DM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用0.5ml无血清的16/DM培养基替换24孔板中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到孔中，COJ瞎箱培养4小时后补加0.5ml含20%FCS的16/DM培养基，置于C02孵箱中继续培养，72小时后取培养上清进行分析，采用ELISA确定培养上清中抗体的含量Goatanti-humanIgG(Fc)包被于ELISA板，4°C过夜，用2%BSA-PBS于37°C封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(HumanmyelomaIgGl，k)，37°C卵孚育2小日寸，力口入HRP—goatanti—humankappa进行结合反应，37°C孵育1小时，加入TMB于37。C作用5分钟，最后用^S04终止反应，测OD柳)值。将人KG-la细胞用2%FCS-PBS重悬成1X10ficells/ml，分别加入不同稀释度的转染人源化抗体的COS细胞培养上清，表达后置于4°C孵育60min，用2%FCS-PBS洗细胞2遍，再加入FITC-goatanti-humanIgG(H+L)于4。C孵育60min，洗细胞后用FCM分析并计算细胞的荧光强度。结果发现与c4C8嵌合抗体相比，h4C8Ha和h4C8La组成的人源化抗体(h4C8Ha/h4C8La)的活性几乎完全丧失(图3)。因此，为了获得高亲和力的人源化抗体，我们还需对可能影响4C8抗体结合活性的FR区鼠源残基进行分析和回复突变。通过分析模建的4C8单抗可变区的三维结构(图1)，我们发现在CDR区周围5A的空间范围内可能影响原抗体CDR构象而又与人源模板中相应位置不同的FR区残基有9个，分别为L3Leu，L4Leu，L46Leu，H2Ile，H46Lys，H68Ala，H69Leu，H82aAsn，和H91Phe。将这些鼠源氨基酸残基保留在构建的CDR移植抗体中可得到人源化抗体(h4C8Hb/h4C8Lb)。h4C8Hb和h4C8Lb的可变区氨基酸序列如图2所示。SEQIDN0:5和SEQ工DN0:6分别显示了h4C8Hb的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDN0:7和SEQIDN0:8分别显示了h4C8Lb的核苷酸序列和氨基酸序列。H4C8Hb的三个CDR区氨基酸序列分别为(可参见图2-1的H4C8VHb):HCDR3(GYGNYARGAWLAY);h4C8Lb的三个CDR区氨基酸序列分另U为(可参见图2-2的H4C8VLb):LCDR1(RSSQTIVHSNGNTYLE),LCDR2(QVSNRFS),LCDR3(FQGSHVPRT)。采用重叠PCR的方法分别合成人源化抗体重、轻链可变区基因(h4C8VHb/h4C8VLb)，并按与人源化抗体(h4C8Ha/h4C8La)相同的方法构建轻链表达载体pcDNA3.1/ZE0(+)(h4C8VLbCL)和重链表达载体pcDNA3.1(+)(h4C8VHbCH)。然后将轻、重表达载体共转染COS-1细胞，用流式细胞术测定抗体的抗原结合活性，发现其与KG-la的结合活性与4C8嵌合抗体相似，将这个人源化抗体(h4C8Ha/h4C8La)命名为h4C8。实施例4.人源化抗体的稳定表达与纯化于3.5cm组织培养皿中接种3X10fiCH0-Kl细胞(ATCCCRL-9618)，细胞培养至90%-95%融合时进行转染取质粒10ug(质粒pcDNA3.1(+)(Vh4C8HbCH)4ug，质粒pcDNA3.1/ZE0(+)(Vh4C8LbCU6ug)禾口20w1Lipofectamine2000Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于500y1无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，COJ哮箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于C02孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600ug/mlG418和250ug/mlZeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4。C过夜，用2。^BSA-PBS于37。C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(HumanmyelomaIgGl，k)，37°C温育2h，加入HRP—羊抗人IgG(K)进行结合反应，37°C温育lh，加入TMB于37。C作用5min，最后用&504终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用ProteinA亲和柱(GE公司产品)分离纯化人源化抗体h4C8。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。实施例5.竞争抑制实验将固定的亚饱和浓度的荧光标记抗体FITC-4C8和系列稀释的未标记纯化抗体分别混合后加入到靶细胞KG-la(1X106/ml)中，4°C孵育60min，1%FCS-PBS洗细胞2遍，流式细胞仪检测并用Cellquest软件分析。人源化抗CD3的单克隆抗体hul2F6(制备参见LiBH，WangH，DaiJX，JiJJ，QianWZ，ZhangDP，HouS，GuoYJ.Constructionandcharacterizationofahumanizedaiiti-humanCD3monoclonalantibody12F6witheffectivei隱unoregulationfunctions.Immunology.2005，116(4):487-98)作为对照。竞争抗体的每个浓度设3个复管，计算半数抑制浓度工C"直，最大荧光强度表示在没有竞争抗体时获得的平均荧光强度。实验结果见图4，抗体h4C8能完全阻断荧光标记抗体FITC-4C8与KG-la细胞的结合，它们的IC5o值接近，表明人源化抗体具有与原鼠源抗体相似的特异性和亲和力(表l)。表l.竞争抑制分析结果抗体类型IC5。(yg/ml)aSDn4C81.7230.1453c4C81.6920.1373h4C81.7640.1583实施例6免疫磁珠的制备活化以pH6.0，0.01mol/L的NaH2P04吐温(0.05%Tween-20)溶液作为活化缓冲溶液，取2mg羧基磁珠(美国Bangslaboratories,BioMagCarboxyl(BM570))于2ml离心管中，加入500^d活化缓冲液，在漩涡振荡器上混合均匀，再将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，用微型台式真空泵把上清液抽提掉；加入500(il活化缓冲液重新洗涤磁珠2遍后，向磁珠中加入485pl活化缓冲液，再分别加入2.5mg碳化二亚胺(EDC，原浓度0.5g/ml)与N—羟基琥珀酰亚氨(NHS，原浓度0.25g/ml)，在漩涡振荡器上混合均匀，室温活化2mg磁珠表面的羧基30min。偶联以500fi1，pH7.4，0.01mol/L的磷酸盐吐温(PBST，0.05%Tween-20)溶液作偶联缓冲液，力CI500jLil的活化缓冲液重新洗涤已经活化的磁珠3遍后，再用500^il的偶联缓冲液洗涤磁珠两遍；力n475pl偶联缓冲液重悬洗涤后的磁珠，再加入25)116mg/ml的抗CD34抗体，使得磁珠表面活化的羧基跟抗CD34抗体的氨基室温反应3h，将抗体偶联于磁珠表面，得到免疫磁珠。封闭用500W的偶联缓冲液洗涤偶联后的磁珠2遍，加入500pl含有1%牛血清白蛋白(BSA)的偶联缓冲液封闭磁珠30min。保存用500pl的偶联缓冲液洗涤偶联后的磁珠2遍，用500pl含0.02%NaN3，0.1%BSA，pH7.4，0.01mol/L磷酸盐吐温(0.05%Tween-20)溶液重悬磁珠，保存于4。C冰箱，待用。16实验例1CD34免疫磁珠分选CD34+细胞系利用CD34+的KG-la(人白血病细胞)及CD34-的Raji(人B淋巴瘤细胞)体外混合，混合比例为1:10，模拟人脐带血单个核细胞(或动员后外周血单个核细胞)。配制0.1MPBS溶液NaCl8g，KCl0.2g，Na2HP04-12H203.488g，KH2PO40.2g，加Milli-Q水至1000ml，i周节pH至7.4，0.22,滤膜过滤除菌，fc保存。配制免疫磁珠分选buffer:0.1MPBS溶液内含有2mMEDTA和0.5%的BSA。按90^1/107细胞的比例加分选buffer重悬上述混合细胞；按10|11/107细胞的比例加CD34免疫磁珠于上述细胞悬液中，混匀，4-8'C孵育15分钟；按1000|^1/107细胞的比例加入分选buffer重悬细胞(细胞少于107也用lOOOpl);将分离管放置于磁场中，吸去上清；重复上步两次；用500|il分选buffer重悬细胞沉淀，所得即为CD34+的KG-la细胞。细胞利用CD34陽FITC(8G12，BDBioscience,340668，与分选抗体没有竞争作用)染色，鉴定分选获得细胞的纯度大于95%;分选细胞计数，分选CD34+细胞的得率大于90。/。；结果见图5。实验例2CD34免疫磁珠分选人脐带血造血干细胞分选人脐带血中CD34+造血干细胞。配制0.1MPBS溶液NaCl8g，KC10.2g，Na2HP04-12H203.488g，KH2P040.2g，加Milli-Q水至1000ml，调节pH至7.4，0.22(am滤膜过滤除菌，4'C保存。配制免疫磁珠分选buffer:0.1MPBS溶液内含有2mMEDTA和0.5%的BSA。利用Ficoll分离健康产妇脐带血中单个核细胞。按卯^11/107细胞的比例加分选buffer重悬单个核细胞；按10|11/107细胞的比例加CD34免疫磁珠于上述细胞悬液中，混匀，4-8。C孵育15分钟；按1000(11/107细胞的比例加入分选buffer重悬细胞(细胞少于107也用lOOOpl);将分离管放置于磁场中，吸去上清；重复上步两次；用500fil分选buffer重悬细胞沉淀，所得即为CD34+的造血干细胞。细胞利用CD34-FITC(8G12，BDBioscience,340668，与分选抗体没有竞争作用)染色，鉴定分选获得细胞的纯度大于95%;分选细胞计数，分选CD34+细胞的得率大于90。/。；结果见图6。利用我们制备的CD34免疫磁珠分选脐带血造血干细胞所得的纯度和得率已经达到临床应用的要求，可望用于临床骨髓造血干细胞移植。18SEQUENCELISTING〈110〉上海中信国健药业有限公司〈120〉抗人CD34人源化抗体、其制备方法及用途<130〉AndrewsRG，BryantEM，BartelmezSH，MuirheadDT，KnitterGH,BensingerW，StrongDM,BernstienID(1992)CD34+mar簡cells,devoidofTandBLymphocytes,reconstitutestablelymphopoiesisandmyelopoiesisinlethallyirradiatedbaboons.Blood80:1693〈150〉200810043016.5U51〉2008-01-08〈160〉8<170>Patentlnversion3.4〈210〉1〈211〉990<212>DNA〈213>人工序列<400>1gctagcaccaagggcccatcggtxttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60ggcac已gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120gcgccctg已ccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggC3CCC3g3CC240tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagc犯caccaaggtggac犯ga^agttgagccc300acaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggggga360ccgtcagtcttcctcttcccccca^3ccc￡l3gg3C3CCCtcatgatctcccggacccct420gaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactgg480t3Cgtgg3Cggcgtgg郷tgcat33tgccaagacaaagccgcggg鄉a,540agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaag600gagtacsagtgcaaggtctccaaca^gccctcccagcccccatcgag犯aaccatctcc660ggragccccg3g犯CC3C3ggtgt3C3CCCtgcccccatcccgggstgag720ctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatc780gccgtggagtggg卿gcaatgggcsgccggag犯c肌ctgcctcccgtg840ctggactccgacggctccttcttcctctac3gca^gctcaccgtggsc犯gsgcaggtgg900cagcagggg已acgtcttxtcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg960c已gaagagcctctccctgtxtcccggtaaa990<210>2〈211〉330<212>PRT<213>人工序列〈400〉2AlaSerThrLys1SerThrSerGly20PheProGluPro35GlyValHisThrGlyProSerValPheProLeu510GlyThrAlaAlaLeuGlyCys25ValThrValSerTrpAsnSer40PheProAlaValLeuGinSerAlaProSerSerLys15LeuValLysAspTyr30GlyAlaLeuThrSer45SerGlyLeuTyrSer50LeuSer65TyrlieSerValValCysl」ysValGluProAlaLysPro130ValVal145TyrValPro115LysValAspGluGinTyrHisGinLysAla210GinPro225LeuThrAsp195LeuAsnVal85ProLys100GluLeuAspThrAspValGlyVal165AsnSer180TrpLeuArgGluProLysProSerAspAsnTyrLeuTyr290ValPhe305GinLysLys275SerSerAsnGin245lieAla260ThrThrSerLeuSerThr70AsnSerLeuLeuSer150GluThrAsnProAlaProGin230ValLysLeuCysSerThrVal310Leu55ValHisCysGlyMet135HisVal295MetProSerSeriLysAspGly120lieProLys105ProSer90ThrGluAspProValHisAsnTyrGlylie215ValLys200GluVal185GluAla170ValTyrThrLeuSerLeuThrValGluTrpProProVal280AspGlu265LeuCys250SerSer75Asn60LeuThrThrSerValPheHisSerArgThrGlu155LysPro140ValThrValTyrLysCysSerLysThrliePro235LeuSer220ProValGlyAspSerAspAsnLysSerArgHisGluAlaLeu315Trp300HisGlyLysCysLeu125GluLysLysLeuLys205LysSerLysGinGly285GinAsnThrValPro110PheValPheProThr190ValAlaArgGlyPro270SerGinHisGinAsp95ProProThrAsnArg175ValSerLysAspPhe255GluPheGlyTyrThr80LysCysProCysTrp160GluLeuAsnGlyGlu240TyrAsnPheAsnThr320SerProGlyLys325330〈210〉3〈211〉318〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3actgtggctgcaccatctgtcttcatcttxccgccatctgatgagcagttgaaatctgga60actgcctctgttgtgtgcctgctg3at朋ctt.ctatcccag卿ggcc犯agt腦gtgg120卿gtgg咖acgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagc180cctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcsgactacgagaaa240cacaaagtxtacgcctgcg已agtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcac犯agagc300ttcaticagggg卿gtgt318<211>106<212〉PRT、213〉人工序列〈400〉4ThrValAlaAla1LeuLysSerProArgGlu35GlyAsnSer50TyrSerLeu65HisLysValVaThrLysGly20AlaGinPro5ThrSerValPhelieAlaSerValLysValGinGluSerSerTyrSer100Ala85PheSerThr70CysVal55LeuTrp40ThrVal25LysPhe10CysValProLeuAspGluGinAspThrLeuSerGluValThrAsnArgGlyGlu105His90CysLys75Gin〈210〉5〈211〉1356<212>DNA〈213〉人源化抗体h4C8重链核苷酸序列<400>5tcgtccagtccggctcagagctaaagaaaccagatccaac3gctgc;aa3gccaggccagggCtg3gg3gtcttcaaattagggaattacgtcttctgctatctgggggcagtgtcgtggatcctcaggaccagacctacagagcccaaatgggggeiccgtacccctgaggEmctggteicgtacaacagcaggca鄉agt3tCtCC333ggatgagctgagacatcgccgcccgtgctggaggtggcagccatctgggtagactgaagtgtcaagggccgacagtctcaaca卿ggtgcgcaccaagggcagcggccctactcaggcgctctactcccttctgcaacgtcttgtgacaacagtcttccttcacatgcgttggiacggcgtcgtaccgtgtacaagtgcaaccaaagggcaccaagsaccatggagtgggaactccgacggaggggaacgtcacct.ttacagatggggtggattcgccttaagcggaggatgtggctcgctcccatcggtcgggctgcctgcctgaccagccagcagcgtggaatcacaagaactcac3C3cttxcccccaggtggtggaicggaggtgcatggtcagcgtcggtctccaacgccccgagaaggtcagcctggagcaatgggctccttcttccttctcatgcaactatggtaataaacacgatCCttgg3C3acggctgtattattggggccttccccctgggtcaaggactggcgtgcacEigtgaccgtgccccagc犯cstgcccaccgtaaacccaagggtgagccacgaatgccaagactcaccgtccaaagccctccccacaggtgtacctgcctggcagccgg卿ctctacagcatccgtgatgc21ProLeuAsnSer60AlaGlySerAsnAla45LysAspLeuAspAsn30LeuAspTyrSerGlu15PheGinSerGluSer95GinTyrSerThrLys80Proccgg;agcc;agtgaattgggtatactggtgacctcagtctcacttttgtgcagggaactctcaccctcctcacttccccgaccttcccggccctccagcagcc犯ggtgggigcccagcaccacaccctxataagaccctgacaaagccgcgtgcaccaggacagcccccatacaccctgcctcaaa_ggcttagctcaccgtatgaggctcttgt咖ggtgtcgccaagcgaccgaaatacccggggatatggtgaccgttcaagagcaccaccggtgacgtgtcctacagcttgggcacccaagaaagtttgaactcctggatctcccggggtcaagttcggEmgagCEigctggctgemtcgaga肌acccccatcccggctatcccagcga.ccacgcctggacemgagcgcacaaccgic6012018024030036042。480540600660720780840900960102010801140120012601320tacacgcagaagagcctctccctgtctcccggtaaa<210〉6〈211〉452<212>PRT<213>人源化抗体h4C8重链氨基酸序列〈400〉6GinlieGinLeuValGinSerGlySerGlu1510SerValLysValSerCysLysAlaSerGly1356ClyMetGlyTrp50LysGly65LeuGinAlaArgGlyGinSerVal130AlaAla145ValSerAlaValValProHisLys210CysAsp225GlyGlyMetlieHisGluValHis290TyrArg305Asn35HeArglieGlyGly115PheLeuTrpLeuSer195ProLysProSerAsp275AsnValVal20TrpAsnPheAsnTyr100ThrProGlyAsnGin180SerSerThrSerArg260ProAlaValValThrAlaSer85GlyLeuLeuCysSer165SerSerAsnHisVal245ThrGluLysSerCysArgAsnLeu70LeuAsnValAlaLeu150GlySerLeuThrThr230PheProValThrVal310LysGinThr55SerLysTyrThrPro135ValAlaGlyGlyLys215CysLeuGluLysLys295LeuAla40GlyLeuAlaAlaVal120SerLysLeuLeuThr200ValProPheValPhe280ProThrSer25ProGluAspGluArg105SerSerAspThrTyr185GinAspProProThr265AsnArgValGlyProThrAsp90GlySerLysTyrSer170SerThrLysCysPro250CysTrpGluLeuLeuLysLysProGlyAla15TyrThrPheThrAsnTyr30GinGlyLeuLysTrpMet45LysTyrAlaGluGluPhe60SerValSerThrAlaTyr7580ThrAlaValTyrPheCys95AlaTrpLeuAlaTyrTrp110AlaSerThrLysGlyPro125SerThrSerGlyGlyThr140PheProGluProValThr155160GlyValHisThrPhePro175LeuSerSerValValThr190TyrlieCysAsnValAsn205LysValGluProLysSer220ProAlaProGluLeuLeu235240LysProLysAspThrLeu255ValValValAspValSer270TyrValAspGlyValGlu285GluGinTyrAsnSerThr300HisGinAspTrpLeuAsn315320<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>ProArgLeuLeulieTyrGinValSerAsnArgPheSerGlyValPro505560AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslie65707580SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysPheGinGly859095SerHisValProArgThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105110ArgThrValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGlu115120125GinLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPhe130135140TyrProArgGluAlaLysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGin145150155160SerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLysAspSer165170175ThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGlu180185190LysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyUuSerSer195200205ProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys2102152权利要求1.一种人源化抗CD34抗体，其重链可变区CDR氨基酸序列分别选白GYTFTNYGMN、WINTNTGEPKYAEEFKG或GYGNYARGAWLAY，轻链可变区CDR氨基酸序列分别选自RSSQTIVHSNGNTYLE、QVSNRFS或FQGSHVPRT。2.权利要求1所述的人源化抗CD34抗体，其重链Bf变区氨基酸序列如SEQIDN0:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDN0:8所示，恒定区为人抗体恒定区。3.—种核苷酸序列，编码权利要求1所述的人源化抗CD34抗体。4.权利耍求3所述的核苷酸序列，其中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQIDN0:5所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDN0:7所示。5.—种含有权利要求4所述的核苷酸序列的表达载体，为pcDNA3.1/ZE0(+)或pcDNA3.1(+)。6.权利要求5所述的表达载体转化的宿主细胞为CHO细胞。7.—种制备权利要求1-2任一所述的抗CD34的人源化抗体的方法，包括通过计算机辅助设计出人源化抗体h4C8的氨基酸序列，全基因合成h4C8的重链和轻链可变区基因并经基因重组分别与人抗体重、轻链恒定区基因拼接，克隆到真核表达载体中，分别构建人源化抗体的轻、重链表达载体，然后将轻、重链表达载体用脂质体法共转染CHO细胞，然后进行筛选、培养纯化即得。8.权利要求卜2任一所述的抗体在分选骨髓造血干/祖细胞中的用途。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
。具体地，本发明公开了抗人CD34人源化抗体h4C8、其制备方法及其在分选骨髓干/祖细胞中的用途。h4C8抗体能很好地与高表达CD34的人髓性白血病细胞特异性结合，可以将它与磁性纳米材料偶联，制备免疫磁珠，来分选骨髓造血干细胞，能有效地减少HAMA的发生率，提高临床造血干细胞移植的安全性，用于某些恶性血液病及实体瘤的治疗。文档编号C07K16/18GK101481417SQ200810090840公开日2009年7月15日申请日期2008年4月2日优先权日2008年1月8日发明者李博华,皓王,郭亚军,钱卫珠,菁马申请人:上海国健生物技术研究院